86例無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測假陽性病例原因分析*

謝潤桂，何 怡，魏順娣，張曉燕

(東莞市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，廣東東莞 523107)

胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(NIPT)是利用大規(guī)模平行測序技術對母體外周血中的胎兒游離DNA片段(包含胎兒游離DNA)進行深度測序，并將結果進行生物信息分享，可以從中獲得胎兒的遺傳信息[1]。目前NIPT已廣泛用于產(chǎn)前篩查，13-三體、18-三體和21-三體靈敏度和特異度[2]的檢測，但是，同任何篩查方法一樣，假陽性和假陰性時常發(fā)生。通過臨床實踐與案例研究發(fā)現(xiàn)NIPT結果與實際胎兒核型之間存在差異，其發(fā)生率在0.1%～0.3%。該現(xiàn)象的生物學原因主要包括限制性胎盤嵌合、雙胎一胎凋亡、母親染色體異常、DNA拷貝數(shù)異常、母血中胎兒DNA含量低以及母親罹患腫瘤等因素[3-5]。本文通過分析在東莞市婦幼保健院NIPT檢測發(fā)現(xiàn)的86例NIPT假陽性病例，在胎兒分娩后留取的胎盤組織及母親外周血標本，采用高通量測序方法進行驗證，探討NIPT產(chǎn)生假陽性的原因，以及相應的預防措施。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年10月至2018年7月在東莞市婦幼保健院檢測出現(xiàn)的NIPT陽性而羊水穿刺核型分析和CMA檢測驗證胎兒染色體正常的假陽性病例86例。在胎兒分娩后留取的胎盤組織及母親外周血標本，采用高通量測序方法進行驗證。本研究經(jīng)東莞市婦幼保健院倫理委員會批準，所有孕婦簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本采集方法 樣本采集與孕婦分娩后，采集孕婦靜脈血7～10 mL，使用Cell-Free DNA BCT 管，采血后顛倒混勻8～10次，24 h后進行血漿分離。同時進行胎盤組織采樣，每個胎盤選6個采樣點，在胎盤的胎兒面和母體面分別間隔一定位置表層獲取3個黃豆大小(長：0.5～1.0 cm,寬：0.5～1.0 cm，深：0.2～0.3 cm)的胎盤組織，用少量生理鹽水洗凈母血，分別按標注置于對應的2 mL無菌小型離心管中，最后將標本以-20 ℃儲存于實驗室。

1.2.2高通量測序檢測 基因組DNA提取、測序文庫構建和質量控制，用試劑盒提取基因組DNA，測定基因組DNA濃度，然后在-20 ℃保存。根據(jù)晶芯胎兒染色體非整倍體T21、T18、T13檢測試劑盒的說明進行文庫構建、質量控制和匯集。使用半導體測序儀用于DNA測序。測序讀數(shù)被過濾并與人類參考基因組(HG19)比對。

1.2.3NIPT假陽性評估方法 NIPT檢測提示染色體異常，而胎兒染色體與羊水核型分析和CMA正常，則判定為NIPT假陽性。本研究采用高通量測序法在胎兒出生后同時檢測胎盤和母親外周血中的染色體異常情況，將檢測結果與孕期檢測的NIPT結果對比，如果NIPT結果與胎盤測定結果一致，則判定NIPT假陽性來源于胎盤細胞；如果NIPT結果與母血測定結果一致，則判定NIPT假陽性來源于母體細胞。如果兩者檢測結果正常，無法判定NIPT假陽性的來源，判定為未知來源。

2 結 果

經(jīng)高通量測序法檢測驗證，在86例NIPT假陽性標本中64例胎盤檢測結果與NIPT相符，母血結果正常，占74.4%，其中檢測結果為性染色異常9例，常染色體異常55例；12例母血檢測結果與NIPT結果相符，胎盤結果正常，占14.0%，其中檢測結果為性染色異常10例，常染色體異常2例；10例胎盤與母血結果均正常，NIPT假陽性來源不明，占11.6%。在64例胎盤來源假陽性病例中有47例為限制性胎盤嵌合，占73.4%。NIPT檢測提示常染色體異常的63例中2例證實假陽性來源于母血，占3.2%，而性染色體異常23病例中10例假陽性病例來源于母血，占43.5%。見表1。

表1 86例NIPT假陽性原因驗證結果

3 討 論

孕婦外周血胎兒游離DNA(cffDNA)的NIPT是應用高通量基因測序等分子遺傳技術檢測孕期母體外周血中胎兒游離DNA片段，以評估胎兒常見染色體非整倍體異常風險[6]。母體外周血中cffDNA片段的濃度非常低(3%～6%)[7]。cffDNA具有獨特的生理性質：(1)孕婦血漿中的cffDNA隨著孕周的增加而增加[8]；(2)cffDNA均有小片段形式存在，片段長度大都小于300 bp；(3)清除速度快，cffDNA的半衰期為16.3 min，胎盤娩出后的2 h內快速消除[9]。NIPT檢測母親外周血中的片段長度為75～250 bp的cffDNA,并將游離DNA數(shù)量定位到染色體相應的位置上，從而得到染色體不同位置DNA數(shù)量的比例關系，從而推斷染色體是否存在缺失、重復或數(shù)目異常。NIPT結果陽性代表胎兒母親外周血中的各種cffDNA的比例關系不正常，可能是與母親血液系統(tǒng)相連通胎兒滋養(yǎng)層的異常核型細胞引起,也能是由母親異常核型細胞本身引起，也可能有一部分來源于通過輸血、免疫治療、器官移植等形式輸入體內的外來異常核型細胞導致。母體外周血中cffDNA的來源以及含量變化等生物因素，都會影響NIPT檢測準確性，表現(xiàn)為NIPT結果、染色體核型分析及CMA結果三者之間存在不一致情況[10-11]。

NIPT檢測的cffDNA絕大部分來源于胎兒滋養(yǎng)層細胞，胎兒滋養(yǎng)層細胞與胎兒都是由同一個合子發(fā)育而來，將發(fā)育為胎盤，合子形成后，一部分細胞發(fā)育成胎盤的細胞系，一部分細胞發(fā)育成胎兒的細胞系。正常情況，兩者的遺傳物質是相同的。如果胎盤細胞系的部分細胞出現(xiàn)有絲分裂錯誤，那么將會出現(xiàn)限制性胎盤嵌合體，即胎盤出現(xiàn)正常與異常的染色體嵌合體，而胎兒核型正常[12]。這種情況胎盤滋養(yǎng)層細胞釋放cffDNA的分子劑量會異常，同時引起孕婦血漿中cffDNA的分子劑量異常，NIPT檢測結果顯示為陽性，而胎兒染色體是正常的，即出現(xiàn)假陽性結果。本研究發(fā)現(xiàn)NIPT假陽性大部分來源于胎盤，占74.4%，其中大部分的胎盤來源假陽性病例驗證結果提示限制性胎盤嵌合體。因此胎盤來源的異常染色體是導致NIPT假陽性的主要原因。

母體血漿DNA大部分來源于母體基因組，cffDNA約占10%～20%[13]。雖然在高通量測序前，經(jīng)過分離和純化去除了部分的母體基因組DNA，但是如果母血中存在異常DNA，仍會影響cffDNA的測定，出現(xiàn)假陽性結果。性染色體異常在母血中最常見，其中性染色體嵌合是最常見的母體染色體嵌合異常，其發(fā)生率1/400[14]。由于女性擁有兩條X染色體，而且存在劑量補償和“選擇性失活”現(xiàn)象，女性的X染色體異常通常不會引起嚴重表型，其中X三體、嵌合型的X單體或X染色體的結構異常女性一般都有生育能力[15]。而對于常染色體異常，數(shù)目異常者除21-三體外通常不能存活，也沒有生育能力，只有小片段的缺失或者重復攜帶者才能存活和生育，因此性染色體異常在母體中最常見，性染色體異常攜帶者比例高是導致母血來源的NIPT假陽性的主要原因。本研究中12例母體來源假陽性有10例是X染色體異常，說明X染色體異常在孕婦中攜帶率最高。所以NIPT檢測時如果性染色體異常，很可能來源于母血，應同時對母體白細胞進行染色體檢測，以排除母體來源的可能，將會提高NIPT對性染色體檢測結果的準確性，避免病人妊娠期間不必要的緊張和壓力。

本研究還有10例假陽性病例同時檢測了胎盤組織和母血均正常，NIPT假陽性來源不明。NIPT檢測一般在孕早中期距離分娩有6、7個月時間，引起NIPT假陽性的異常cffDNA可能已經(jīng)消失了，因此，本方法無法找到引起NIPT假陽性原因。對游離DNA劑量變化的來源檢測還需要進一步提高現(xiàn)有檢測技術。

高通量測序法驗證發(fā)現(xiàn)胎盤和母血中異常游離DNA釋放入母血是NIPT假陽性的主要原因。對NIPT結果為性染色體異常病例，應排除性染色體異常源自母血的可能性。NIPT能夠準確檢測母血總游離DNA的劑量變化，但無法分辨游離DNA劑量變化的來源。