益氣活血通脈顆粒對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠顳葉神經(jīng)元損傷的影響

姜瑾， 任平， 劉悅， 許杰， 崔娜， 王璐， 李國(guó)信

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)明華制藥有限公司，遼寧沈陽(yáng) 110135）

大腦中動(dòng)脈閉塞腦梗死是臨床常見(jiàn)的腦血管病，臨床表現(xiàn)為偏身感覺(jué)障礙、對(duì)側(cè)偏癱、完全性失語(yǔ)等，可因腦水腫、顱內(nèi)高壓而發(fā)生腦主干閉塞、皮層性對(duì)稱側(cè)偏癱，頭面部與上肢重于下肢。在大腦中動(dòng)脈梗死急性期過(guò)后，患者往往遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損癥狀[1-3]。中醫(yī)藥治療腦血管病方面有一定的積累和優(yōu)勢(shì)。益氣活血通脈顆粒是本院腦病科劉悅教授治療腦梗死的經(jīng)驗(yàn)方，以清·王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》中補(bǔ)陽(yáng)還五湯為主化裁而成，主要成分為黃芪、當(dāng)歸、白芍、川芎、桃仁、紅花、地龍、全蝎等，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)、舒頸醒腦的作用，在臨床應(yīng)用多年，療效顯著。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，本研究以腦缺血再灌注模型大鼠為研究對(duì)象，對(duì)該方劑進(jìn)行了與功能主治有關(guān)的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物SPF級(jí)健康雌性SD大鼠166只，體質(zhì)量220～260 g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。飼養(yǎng)于遼寧省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室內(nèi)溫度22～25℃，濕度55%～60%，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（遼）2012-0010。本項(xiàng)目的實(shí)施已通過(guò)遼寧省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物倫理及動(dòng)物福利的審查。

1.2藥物益氣活血通脈顆粒，規(guī)格：5 g/袋，每袋相當(dāng)于12 g生藥，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院中藥藥劑實(shí)驗(yàn)室提供，批號(hào)：20151124。用法用量：口服，每次5 g，每日2次。銀杏葉片（規(guī)格：19.2 mg），由華納大藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：160217。用法用量：口服，每次1片，每日3次。

1.3試劑大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）免疫組化試劑盒、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）免疫組化試劑盒（博士德生物工程有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京Solarbio科技有限公司，批號(hào)：5091034）；多聚甲醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20161203）；無(wú)水乙醇（沈陽(yáng)市新化試劑廠，批號(hào)：20160121）；二甲苯（沈陽(yáng)市新化試劑廠，批號(hào)：20151125）；枸櫞酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150713）；磷酸緩沖液（PBS，北京Solarbio科技有限公司，批號(hào)：20150815）；水合氯醛（北京市旭東化工廠，批號(hào)：20000530）。

1.4儀器BX53型光電顯微鏡（奧林巴斯中國(guó)有限公司）；JKDP2型電熱恒溫培養(yǎng)箱（廈門醫(yī)療電子儀器廠）；TP1020自動(dòng)脫水機(jī)、Leica切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；YG-280KX攤片機(jī)（湖北孝感市陽(yáng)光神琦醫(yī)用科技有限公司）；YG-280KX烤片機(jī)（湖北孝感市陽(yáng)光神琦醫(yī)用科技有限公司）。

1.5分組、造模與給藥166只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)選取16只作為假手術(shù)組，其余150只制備腦缺血再灌注模型。采用改良線栓法[4]復(fù)制腦缺血再灌注模型：按照3 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定到操作臺(tái)上，頸部褪毛、消毒，分離并結(jié)扎頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈。將栓線經(jīng)頸外動(dòng)脈向頸內(nèi)動(dòng)脈插入約（18.0±2.0）mm到達(dá)大腦中動(dòng)脈并阻塞大腦中動(dòng)脈，缺血120 min后，將栓線抽離，確認(rèn)無(wú)出血后用酒精消毒，涂青霉素粉，縫合皮膚。假手術(shù)組將線栓插入頸動(dòng)脈，但未深入到大腦中動(dòng)脈。術(shù)后再灌注4 h后對(duì)造模大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分[5]。根據(jù)Bederson的神經(jīng)行為損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行篩選：1～3分者為成功模型，0分、4分或死亡者剔除。將成功的腦缺血再灌注模型大鼠按照其神經(jīng)功能損傷評(píng)分結(jié)果隨機(jī)分為模型組，中藥低、中、高劑量組，每組16只。造模結(jié)束后，中藥低、中、高劑量組給予益氣活血通脈顆粒（生藥劑量為2.16、4.32、8.64 g·kg-1·d-1，相當(dāng)于臨床成人擬用等效劑量、2倍等效劑量、4倍等效劑量）灌胃，銀杏葉片組給予銀杏葉片混懸液（劑量為5.18 g·kg-1·d-1，由蒸餾水配制）灌胃，假手術(shù)組、模型組給予等體積蒸餾水灌胃。給藥體積為10 mL·kg-1·d-1，連續(xù)給藥5 d。末次給藥1 h后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)，然后斷頭取腦，計(jì)算腦梗死率、檢測(cè)顳葉神經(jīng)元NGF和BDNF的表達(dá)。

1.6觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 檢測(cè)神經(jīng)行為學(xué) 神經(jīng)行為損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]：無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀，計(jì)0分；不能完全伸展右側(cè)前爪，計(jì)1分；自由行走向右側(cè)旋轉(zhuǎn)，計(jì)2分；自由活動(dòng)時(shí)向右側(cè)傾倒，計(jì)3分；意識(shí)喪失，不能行走，計(jì)4分。0分、4分或死亡者剔除，1～3分者選為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.6.2 TTC染色[7]觀察腦梗死情況 按神經(jīng)行為損傷評(píng)分每組隨機(jī)抽取10只大鼠，斷頭處死，取大腦，-20℃冷凍20 min后，將大腦組織切取2 mm厚度冠狀位腦片，切成5片，放入2%TTC溶液中，37℃溫箱孵育30 min染色，每隔10 min翻動(dòng)1次。孵育完畢后將腦片置于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛中固定2 h后拍照。染色后的腦梗死區(qū)呈灰白色。采用Image-J軟件測(cè)量腦梗死面積，計(jì)算腦梗死率。腦梗死率=腦梗死區(qū)面積/全腦面積×100%。

1.6.3 免疫組化法檢測(cè)大鼠腦顳葉神經(jīng)元NGF和BDNF表達(dá) 將各組剩余的6只大鼠按照3 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉后，將大鼠仰臥位固定到操作臺(tái)上，開胸暴露心臟，灌注針刺入左心室，右心耳剪一小孔，用生理鹽水沖洗至肝臟變白；再用40 g/L多聚甲醛固定液400 mL（由0.01 mol/L PBS配制，pH 7.4）灌流固定，直至身體逐漸僵硬震顫為止[8]。斷頭、開顱取各組大鼠大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域的腦組織行冠狀位切片，置于40 g/L多聚甲酸溶液中固定24 h。固定后的腦組織用酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片備用。檢測(cè)時(shí)，將大鼠腦組織切片60℃烘烤4 h，二甲苯透明2次，置于無(wú)水乙醇中浸泡5 min、體積分?jǐn)?shù)90%乙醇浸泡4 min、體積分?jǐn)?shù)80%乙醇浸泡3 min、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡2 min，蒸餾水浸泡1 min。滴加體積分?jǐn)?shù)3%H2O2去離子水孵育20 min。PBS緩沖液漂洗5 min。于枸櫞酸鈉緩沖液（pH 7.0）中高壓修復(fù)5 min。血清封閉30 min后，加入PBS稀釋的一抗（NGF 1∶400、BDNF 1∶550），4℃孵育過(guò)夜。PBS緩沖液漂洗5 min。再加入生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育2 h。PBS緩沖液漂洗5 min。滴加鏈霉親和素—過(guò)氧化物酶，37℃孵育30 min。PBS緩沖液漂洗5 min。滴加DAB顯色劑。自來(lái)水漂洗。蘇木精復(fù)染10 min，自來(lái)水漂洗3 s，加入1%鹽酸乙醇分化5 s，自來(lái)水漂洗30 s。中性樹膠封片。采用Image J軟件對(duì)經(jīng)免疫組化染色組織進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算各組積分光密度（IOD）[9]。

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示。不符合正態(tài)分布者采用秩和檢驗(yàn)，滿足正態(tài)性和方差齊性者采用LSD（L）檢驗(yàn)，滿足正態(tài)性但不滿足方差齊性者采用Dunnet’s C（U）檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠神經(jīng)行為損傷評(píng)分比較治療前：與假手術(shù)組比較，各組大鼠神經(jīng)行為損傷評(píng)分均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組神經(jīng)行為損傷評(píng)分未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05）。治療后：與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)行為損傷評(píng)分顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，中藥高劑量組、銀杏葉片組神經(jīng)行為損傷評(píng)分均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠腦梗死率比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死率顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，中藥中、高劑量組及銀杏葉片組大鼠腦梗死率顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3各組大鼠腦顳葉神經(jīng)元NGF和BDNF表達(dá)比較NGF：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦顳葉NGF表達(dá)有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組及銀杏葉片組NGF表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。BDNF：與假手術(shù)組比較，模型組BDNF表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，中藥高劑量組及銀杏葉片組BDNF表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3、圖1、圖2。

表2 各組大鼠腦梗死率比較Table 2 Comparison of the cerebral infarction rate in various groups （s，p/%）

表2 各組大鼠腦梗死率比較Table 2 Comparison of the cerebral infarction rate in various groups （s，p/%）

①P＜0.01，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組銀杏葉片組腦梗死率0 19.36±4.13①16.13±4.25 14.76±3.78②13.38±3.21②12.97±4.47②N 10 10 10 10 10 10

表3 各組大鼠腦顳葉神經(jīng)元NGF和BDNF表達(dá)比較Table 3 Comparison of the expression levels of NGF and BDNF in temporallobe neurons of various groups （s，p）

表3 各組大鼠腦顳葉神經(jīng)元NGF和BDNF表達(dá)比較Table 3 Comparison of the expression levels of NGF and BDNF in temporallobe neurons of various groups （s，p）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組銀杏葉片組BDNF 0.047±0.011 0.094±0.023①0.105±0.019 0.132±0.024 0.182±0.036②0.249±0.043②N 6 6 6 6 6 6 NGF 0.053±0.009 0.103±0.011 0.155±0.021 0.199±0.043②0.260±0.087②0.281±0.092②

圖1 各組大鼠腦顳葉神經(jīng)元NGF表達(dá)結(jié)果（免疫組化法，×200）Figure 1 Comparison of the expression of NGF in temporallobe neurons of various groups（immunohistochemistry，×200）

3 討論

腦梗死是由于腦組織局部供血?jiǎng)用}血流突然減少，造成該血管供血區(qū)的腦組織缺血、缺氧進(jìn)而導(dǎo)致腦組織壞死、軟化，并伴有相應(yīng)部位臨床癥狀，如失語(yǔ)、偏癱等神經(jīng)功能缺失癥狀。腦梗死是缺血性腦卒中的總稱，是腦血液供應(yīng)障礙引起的腦部病變[10]。中樞性癱瘓是錐體束受損產(chǎn)生，因上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損，失去了對(duì)下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的調(diào)控作用而產(chǎn)生的隨意運(yùn)動(dòng)減弱，其主要表現(xiàn)為肌張力增高[11-13]。周圍性癱瘓也稱下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元性癱瘓[14]，是因腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核受損害產(chǎn)生的癱瘓。因下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損，使其所支配的肌肉得不到足夠的沖動(dòng)興奮，表現(xiàn)為肌張力下降、反射消失。本研究結(jié)果顯示：給藥前，各造模組神經(jīng)行為損傷評(píng)分均比假手術(shù)組顯著增加，提示大鼠腦中動(dòng)脈阻塞缺血再灌注模型復(fù)制成功。治療5 d后，模型組神經(jīng)行為損傷評(píng)分較假手術(shù)組顯著增加，提示大鼠腦中動(dòng)脈阻塞缺血再灌注模型尚未完全自然恢復(fù)。益氣活血通脈顆粒各劑量組神經(jīng)行為損傷評(píng)分較模型組均有所降低，呈劑量依賴性，說(shuō)明益氣活血通脈顆粒對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞缺血再灌注模型具有治療作用。

圖2 各組大鼠腦顳葉神經(jīng)元BDNF表達(dá)結(jié)果（免疫組化法，×200）Figure 2 Comparison of the expression of BDNF in temporallobe neurons of various groups（immunohistochemistry，×200）

腦是對(duì)缺血、缺氧最為敏感的重要器官，腦組織缺血將會(huì)引起局部腦組織功能損害，其損害程度與缺血時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，短期缺血會(huì)引起可逆性損害，長(zhǎng)時(shí)間的缺血會(huì)引起梗死，腦梗死所引起的組織學(xué)變化表現(xiàn)為腦水腫及腦細(xì)胞壞死[15]。益氣活血通脈顆粒主要由補(bǔ)氣活血藥物組成，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)的功效，其治療腦缺血的機(jī)制可能與改善微循環(huán)、增加缺血區(qū)血液供應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死率顯著增加。與模型組比較，益氣活血通脈顆粒各劑量組腦梗死率顯著降低，且呈劑量依賴性。提示益氣活血通脈顆粒對(duì)短時(shí)間大腦中動(dòng)脈阻塞所引起的腦梗死具有治療作用。

NGF廣泛分布于腦組織，可促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化，維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，加快神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)。當(dāng)NGF效應(yīng)神經(jīng)元受到損傷（如外傷損害、缺血缺氧等）神經(jīng)元將發(fā)生一系列的病理改變（如死亡），NGF可以抑制上述神經(jīng)損傷，同時(shí)能影響受損神經(jīng)元再生時(shí)間和再生速度[16，17]。BDNF分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，海馬和皮質(zhì)中的含量最高[18，19]，對(duì)腦神經(jīng)元的生長(zhǎng)起重要作用。BDNF可以防止神經(jīng)元受損死亡，并能夠促進(jìn)受損神經(jīng)元再生及分化。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，益氣活血通脈顆粒各劑量組顳葉神經(jīng)元NGF和BDNF表達(dá)均增加，且呈劑量依賴性。表明益氣活血通脈顆?？梢酝ㄟ^(guò)增加顳葉神經(jīng)元NGF和BDNF表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)受損神經(jīng)元的再生及分化，從而起到對(duì)大鼠腦中動(dòng)脈阻塞缺血再灌注損傷的治療作用。

綜上所述，益氣活血通脈顆粒對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠產(chǎn)生的治療作用可能與增加腦顳葉神經(jīng)元NGF和BDNF的表達(dá)有關(guān)。