卵巢癌組織中帶狀皰疹透明帶樣結(jié)構(gòu)域蛋白1 mRNA表達(dá)與腫瘤增殖、侵襲及自噬相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性

路 娜，王炳淑，古吉敏

(1.宜賓市第二人民醫(yī)院病理科，四川 宜賓 644000；2.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科，海南 ?？?570311)

卵巢癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，每2 500名絕經(jīng)后女性中約有1人患卵巢癌。早期卵巢癌患者5 a生存率接近90%，然而，絕大多數(shù)患者被確診時(shí)已是晚期，5 a生存率僅為10%～30%[1]。因此，如何在發(fā)病早期準(zhǔn)確診斷卵巢癌顯得尤為重要。目前，研究者們一直致力于尋找早期診斷卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物，其中研究最廣泛的是糖類抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)，CA125敏感性較低，在Ⅰ期卵巢癌患者中的檢測(cè)率約為50%；此外，CA125特異性也較低，在心包、子宮內(nèi)膜等多種組織中均有表達(dá)；因此，不能滿足卵巢癌早期診斷的要求[2]。尋找高敏感性和特異性的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物是當(dāng)下臨床研究的熱點(diǎn)。帶狀皰疹透明帶樣結(jié)構(gòu)域蛋白1(CUB and zona pellucida-like domains-containing protein 1,CUZD1)又稱UO-44，該蛋白基因位于染色體10q26.13，編碼607個(gè)氨基酸。LEUNG等[1]的研究已證明CUZD1是一種新型胰腺癌、卵巢癌生物標(biāo)志物。本研究旨在觀察卵巢癌組織中CUZD1 mRNA的表達(dá)水平，并進(jìn)一步探討CUZD1 mRNA表達(dá)水平與腫瘤增殖、侵襲及自噬相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性，以明確該腫瘤標(biāo)志物在卵巢癌輔助診斷、病情評(píng)估中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源選取2018年1～10月宜賓市第二人民醫(yī)院病理科保存的122例卵巢癌、72例卵巢囊腫和20例正常卵巢組織標(biāo)本，且所有患者術(shù)前未進(jìn)行放射治療和化學(xué)治療。卵巢癌患者年齡35～52(41.79±6.13)歲，卵巢囊腫患者年齡35～53(42.09±8.14)歲；正常卵巢組織為卵巢囊腫旁的組織，患者年齡34～53(41.98±7.95)歲。3組患者的年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器TRIzol、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒購(gòu)自中國(guó)生工生物工程(上海)股份有限公司，引物均由中國(guó)生工生物工程(上海)股份有限公司合成，ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)儀、NanoDrop One微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 組織中RNA提取取0.1 g待測(cè)組織，勻速放入勻漿器中，加入1 mL 預(yù)冷TRIzol總RNA提取試劑，在冰上進(jìn)行研磨直至成懸液，轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，4 ℃ 12 000×g離心10 min，棄沉淀并往上清中加入0.2 mL氯仿，震蕩混勻15 s，室溫下放置2 min，4 ℃ 12 000×g離心15 min；吸取上層透明液體，轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL的EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，放置-20 ℃靜置20 min，4 ℃ 12 000×g離心10 min；棄上清液。加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)75%乙醇，輕彈管底，使沉淀漂浮，4 ℃ 12 000×g離心10 min；棄上清液，管底中加入焦碳酸二乙酯水溶解(20 μL)沉淀。

1.4 RNA濃度和純度的測(cè)定使用微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)RNA濃度，當(dāng)RNA樣品的核酸在260 nm處的吸光度值與蛋白質(zhì)在280 nm處的吸光度值的比值在1.7～2.0時(shí)為純RNA。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)各組織標(biāo)本中增殖、侵襲及自噬相關(guān)基因的表達(dá)利用一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒檢測(cè)CUZD1 mRNA、增殖相關(guān)基因[β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、C-myc]、侵襲相關(guān)基因[核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)、鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastsis associated gene 1,MTA1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和整合素α2(integrin α2,ITGA2)]、自噬相關(guān)基因[bcl-2同源結(jié)構(gòu)域樣蛋白1(bcl-2 homeodomain protein 1,Beclin1)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)]的表達(dá)情況，以β-actin和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參基因，所用引物序列見(jiàn)表1。20 μL反應(yīng)體系：2× onestep RT-qPCR Master Mix 10 μL、正向引物200 nmol、反向引物200 nmol、RT enzyme Mix 0.65 μL、RNA Template 4 μL、剩余體積用ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序：42 ℃反轉(zhuǎn)錄 30 min，95 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃變性10 s、50～60 ℃退火(以基因?yàn)闇?zhǔn))10 s、72 ℃延伸/采集熒光信號(hào) 30 s (40個(gè)循環(huán))。ABI7500 RT-qPCR儀自動(dòng)生成熔解曲線。用無(wú)模板和無(wú)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)模板作陰性對(duì)照。2-△△Ct的方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 RT-qPCR所用引物序列

Tab.1 Primer used for RT-qPCR

引物名稱序列(5′→3′))上游下游β-cateninTCCCAAGTCCTGTATGAGTGTGCCCTCATCTAATGTCTCAGCyclin D1CGGTGTCCTACTTCAAATGTGGGCAAACTTCAAAGTTCTAGCC-mycCTGAGATGAGTCGAATGCCTCTTCTCCTCTCCCATCTTGACGAPDHTGTTCCAATATGATTCCACCTTTCTTCCATTCTGTCTTCCβ-actinATGAAGGCTTTTGGTCTCACTCTGGGTAAGGACAAGNF-κBTATCAGACGCCATCTATGACAGAAATCTCCAAATCCTTCCCAGACVimentinGAGCAGCAGAATAAGATCCTGCTTTGTCGTTGGTTAGCTGGMMP-9CACCACAACATCACCTATTGGAGACACCAAACTGGATGACGAVEGFCAGATTATGCGGATCAAACCTAAACAAATGCTTTCTCCGCTITGA2AAATGTCCTGTTGACCTATCCCCGTTGTGTAATACTGATTCCE-cadherinCATTTCTTGGTCTACGCCTGGAGAGGAGTTGGGAAATGTGBeclin1CCATTTATTGAAACTCCTCGCCGGGTGATCCACATCTGTCTGLC3GCTACAAGGGTGAGAAGCAGTCTCCTGCTCGTAGATGTCCMTA1GACTACGTCTACTTTGAGAACTCCCCTTATAGCAGACTGACAGGG

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌、卵巢囊腫及正常卵巢組織中CUZD1 mRNA表達(dá)比較卵巢癌、卵巢囊腫及正常卵巢組織中CUZD1相對(duì)表達(dá)量分別為947.354±24.263、367.944±16.256、2.116±0.032，卵巢癌組織中CUZD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵巢囊腫和正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；卵巢囊腫組織中CUZD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.2 卵巢癌、卵巢囊腫及正常卵巢組織中增殖相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)表2。卵巢癌組織中β-catenin、Cyclin D1、C-myc基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵巢囊腫和正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；卵巢囊腫組織中β-catenin、Cyclin D1、C-myc基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 卵巢癌、卵巢囊腫及正常卵巢組織中增殖相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量比較

組織類別nβ-cateninCyclin D1C-myc正常卵巢組織201.261±0.0512.497±0.0071.124±0.006卵巢囊腫組織7231.815±2.589a31.312±3.461a62.101±7.238a卵巢癌組織12270.906±6.259ab112.889±14.217ab118.301±21.381abF2 514.0001 741.000556.200P<0.001<0.001<0.001

注：與正常卵巢組織比較aP<0.05；與卵巢囊腫組織比較bP<0.05。

2.3 卵巢癌、卵巢囊腫及正常卵巢組織中侵襲相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)表3。卵巢癌組織中NF-κB、Vimentin、MTA1、MMP-9、VEGF、ITGA2基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵巢囊腫和正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；卵巢癌組織中E-cadherin基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于卵巢囊腫和正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；卵巢囊腫組織中NF-κB、Vimentin、MTA1、MMP-9、VEGF基因相對(duì)表達(dá)量高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；卵巢囊腫組織與正常卵巢組織中ITGA2、E-cadherin基因相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 卵巢癌、卵巢囊腫及正常卵巢組織中侵襲相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量比較

組織類別nNF-κBVimentinMTA1VEGFITGA2MMP-9E-cadherin正常卵巢組織2010.234±1.0628.412±1.122.366±0.0753.340±0.1920.926±0.0761.264±0.0261.236±0.051卵巢囊腫組織7257.617±5.363a44.079±5.263a6.057±1.263a14.863±0.160a1.139±0.0923.982±0.145a1.124±0.039卵巢癌組織1225 384.312±203.564ab694.330±52.638ab272.705±35.269ab789.208±56.280ab92.452±9.264ab145.651±10.236ab0.062±0.002abF31 420.0007 110.0002 628.0008 714.0004 447.0008 833.00041 490.000P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與正常卵巢組織比較aP<0.05；與卵巢囊腫組織比較bP<0.05。

2.4 卵巢癌、卵巢囊腫及正常卵巢組織中自噬相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)表4。卵巢癌組織中Beclin1、LC3基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于卵巢囊腫和正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；卵巢囊腫組織中Beclin1、LC3基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 卵巢癌、卵巢囊腫及正常卵巢組織中自噬相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量比較

組織類別nBeclin1LC3正常卵巢組織202.892±0.0613.650±0.074卵巢囊腫組織720.026±0.003a0.314±0.023a卵巢癌組織1220.019±0.004ab0.007±0.001abF215 100.000171 300.000P<0.001<0.001

注：與正常卵巢組織比較aP<0.05；與卵巢囊腫組織比較bP<0.05。

2.5 卵巢癌組織中CUZD1 mRNA表達(dá)與增殖、侵襲及自噬相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析顯示，卵巢癌組織中CUZD1 mRNA表達(dá)水平與增殖相關(guān)基因β-catenin、Cyclin D1和C-myc表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.998、0.990、0.988，P<0.05)；與侵襲相關(guān)基因NF-κB、Vimentin、MTA1、VEGF、ITGA2、MMP-9表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.926、0.946、0.928、0.928、0.924、0.930，P<0.05)，與侵襲相關(guān)基因E-cadherin表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.954，P<0.05)，與自噬相關(guān)基因Beclin 1、LC3表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.928、-0.931，P<0.05)。

3 討論

CUZD1是催乳素(prolactin,PRL)/催乳素受體(prolactin receptor,PRLR)-Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transducers and activators of transcription 5,STAT5)信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)因子。已有研究表明，過(guò)表達(dá)CUZD1促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，沉默CUZD1表達(dá)抑制STAT5信號(hào)通路可能為治療腫瘤提供一種策略[3]。β-catenin是Wnt信號(hào)通路中的重要因子，與E-cadherin組成復(fù)合體，激活Wnt信號(hào)通路，參與腫瘤的發(fā)生及增殖。胡艷萍等[4]研究表明，β-catenin在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中過(guò)表達(dá)。Cyclin D1在細(xì)胞周期失調(diào)控中扮演關(guān)鍵角色，是參與腫瘤細(xì)胞早期形成和生長(zhǎng)的癌基因[5-6]。C-myc是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[7]。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織中CUZD1相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵巢囊腫和正常卵巢組織，卵巢囊腫組織中CUZD1相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常卵巢組織，且卵巢癌組織中CUZD1 mRNA表達(dá)水平與增殖相關(guān)基因β-catenin、Cyclin D1和C-myc mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，表明CUZD1表達(dá)水平可以反映卵巢癌細(xì)胞的增殖活性。

卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的一般規(guī)律是：首先，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)瘤處脫落，侵入其鄰近細(xì)胞外基質(zhì)；激活各種降解酶類，降解所黏附的組織，形成空隙，使卵巢癌細(xì)胞移動(dòng)；然后在多種促血管因子的作用下著床的癌組織形成新生血管，最后癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)免疫逃逸而增殖形成轉(zhuǎn)移灶[8-9]。NF-κB屬于Rel蛋白家族，廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，其可通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管形成、誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解等途徑促使癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。Vimentin高表達(dá)和E-cadherin表達(dá)缺失被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化分子標(biāo)志物的典型代表[11]。MTA1是與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因家族成員之一，在胰腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)[12]。MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)Ⅳ型膠原，促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[13-14]。VEGF是特異的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，可以促進(jìn)血管生成，在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用[15]。ITGA2是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的最重要的受體，研究顯示，ITGA2參與肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程[16]。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織中NF-κB、Vimentin、MTA1、MMP-9、VEGF、ITGA2基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵巢囊腫和正常卵巢組織，E-cadherin基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于卵巢囊腫和正常卵巢組織；且卵巢癌組織中CUZD1 mRNA表達(dá)水平與NF-κB、Vimentin、MTA1、VEGF、ITGA2、MMP-9基因表達(dá)水平呈正相關(guān)，與E-cadherin基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，表明CUZD1表達(dá)水平可以反映卵巢癌細(xì)胞的侵襲活性。

自噬即Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，發(fā)生于機(jī)體的生理或病理過(guò)程中，且與腫瘤密切相關(guān)。Beclin1是形成自噬體的必需分子，其異常表達(dá)能夠促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，研究表明，Beclin1表達(dá)缺失可能是甲狀腺癌進(jìn)展的早期分子事件[17-18]。LC3是與細(xì)胞自噬活性密切相關(guān)的基因，呂國(guó)義等[19]研究表明，Beclin1、LC3低表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生與發(fā)展緊密相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織中Beclin1、LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于卵巢囊腫和正常卵巢組織，卵巢囊腫組織中Beclin1、LC3基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常卵巢組織，且卵巢癌組織中CUZD1 mRNA表達(dá)水平與自噬相關(guān)基因Beclin 1、LC3基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，表明CUZD1表達(dá)水平可反映卵巢癌細(xì)胞的自噬活性。

綜上所述，卵巢癌組織中CUZD1表達(dá)增高，其表達(dá)水平與癌細(xì)胞增殖和侵襲活性呈正相關(guān)，與細(xì)胞自噬活性呈負(fù)相關(guān)，CUZD1可以卵巢癌診斷及病情評(píng)估的指標(biāo)。