豐都紅心柚落果制備柚皮素

李則靈，朱霞建，范佳瑩，談安群，易鑫，周琦，郭莉，黃林華，王華

(西南大學(xué)柑桔研究所，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶，400712)

柚皮素(4′，5，7-三羥基二氫黃酮)是柚皮苷的苷元，廣泛存在于蕓香科植物中，在降血脂、鎮(zhèn)靜、抗氧化、抗真菌、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化等方面具有較強(qiáng)的藥理活性[1-4]。黃酮類化合物之所以一直受到廣泛的關(guān)注，是因?yàn)槠浯x后能夠改變藥物的生物活性和細(xì)胞透過(guò)能力[5]。因此認(rèn)為黃酮類天然藥物是以前藥的形式存在，真正起作用的是其代謝產(chǎn)物[6]。研究表明，柚皮苷通過(guò)口服或灌胃給藥后在動(dòng)物體內(nèi)主要水解生成柚皮素，且相比口服柚皮苷，直接口服柚皮素具有更好的藥動(dòng)學(xué)效應(yīng)[7-8]。

柚皮素雖在天然植物中來(lái)源廣泛，但含量極低，通過(guò)提取法得率較低[9]，且需要使用大量有機(jī)溶劑，易造成環(huán)境污染?；谶@些問(wèn)題，目前工業(yè)上主要通過(guò)水解柚皮苷來(lái)大量制備柚皮素。豐都紅心柚是中國(guó)十大名柚之一，以其深紅鮮艷的汁胞和豐富的營(yíng)養(yǎng)而深受消費(fèi)者喜愛。柚子生長(zhǎng)過(guò)程中，由于疏果處理及生理原因常造成果園大量的落果，種植者一般任其腐爛。但研究表明[10]，掉落的幼果果皮中柚皮苷含量遠(yuǎn)高于成熟果，是制備柚皮素的理想原料。因此，本文以紅心柚落果為原料提取柚皮苷進(jìn)而水解制備柚皮素，能夠極大程度地實(shí)現(xiàn)資源綜合利用、減輕落果丟棄造成的環(huán)境問(wèn)題。

柚皮素的水解制備方法包括酶法、微生物法及酸解法。酶解法在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中成本高，且存在柚皮苷溶解度小、反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的問(wèn)題，經(jīng)濟(jì)效益較低[11-12]。有研究者為了避免酶的復(fù)雜的分離純化步驟，采用產(chǎn)柚苷酶霉菌與柚皮苷混合，通過(guò)霉菌直接水解柚皮苷[13-14]。該法雖反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)，但仍存在操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題。酸解法是指將柚皮苷與酸的水溶液混合，在高溫或高溫高壓情況下催化反應(yīng)，將柚皮苷水解掉一分子葡萄糖和鼠李糖得到最終產(chǎn)物柚皮素的過(guò)程，高溫條件下柚皮苷能在溶劑中較好地溶解，與酸充分反應(yīng)，產(chǎn)物得率高[15-16]。目前很少有研究者從柚子果園落果中提取柚皮苷，并以其制備苷元柚皮素，而關(guān)于不同酸解條件對(duì)柚皮素得率和柚皮苷水解率影響的文獻(xiàn)鮮見報(bào)道。本文以豐都紅心柚落果為原料，提取柚皮苷并運(yùn)用酸解法制備柚皮素，通過(guò)單因素試驗(yàn)探究各反應(yīng)條件對(duì)柚皮素得率及柚皮苷水解率的影響，并通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化，確定了最佳的工藝條件，為豐都紅心柚落果高價(jià)值利用，開發(fā)簡(jiǎn)便、低成本的柚皮素制備工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豐都紅心柚落果,采購(gòu)于重慶市豐都縣;柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥95%，Sigma公司)、柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥97%，Sigma公司)、濃HCl(分析純)、NaOH(分析純)甲醇(分析純)、乙醇(分析純)，成都科龍化工試劑廠；甲醇(色譜純)，Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BT224S 電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫磁力攪拌器，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；UltiMate3000 高效液相色譜儀，戴安中國(guó)有限公司；恒溫水浴鍋，上海雙舜實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；LGJ-10 臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī)，長(zhǎng)沙市恒和科技儀器有限公司；6202 型高速粉碎機(jī)，北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司；真空泵，南京真空泵廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 柚皮苷的提取及純化

參考孫勝亮[17]的方法并稍作修改，將豐都紅心柚落果切塊后于60 ℃烘箱中干燥24 h，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，得落果粗粉。取一定量落果粉于圓底燒瓶中，按液料比20∶1(mL∶g)加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，在70 ℃水浴條件下回流提取1 h，過(guò)濾得提取液；過(guò)濾后的濾渣再按液料比10∶1(mL∶g)加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，在70 ℃水浴下繼續(xù)回流提取1 h，過(guò)濾得第2次提取液。合并2次濾液，50 ℃下真空濃縮至原體積1/10，室溫下冷卻后于4 ℃冰箱靜置24 h，過(guò)濾得沉淀，即為柚皮苷粗品。

在柚皮苷粗品中按液料比3∶1(mL∶g)加入無(wú)水乙醇，充分溶解后過(guò)濾，濾液于4 ℃放置24 h，過(guò)濾得結(jié)晶物；結(jié)晶物中按液料比2∶1(mL∶g)加入蒸餾水，70 ℃水浴充分溶解30 min，趁熱過(guò)濾，濾液放冷后于4 ℃靜置24 h，過(guò)濾，結(jié)晶物冷凍干燥得柚皮苷純品。取適量柚皮苷純品溶解于甲醇中，測(cè)得其純度為88.23%。

1.3.2 柚皮苷和柚皮素含量測(cè)定方法的建立

1.3.2.1 色譜條件

Venusil MP C18色譜柱(4. 6 mm×250 mm，5μm)；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相;1% 冰乙酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～25 min，38% B; 25～55 min，38%～45% B; 55～60 min，45%～38% B)；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1 mL/min。

1.3.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品柚皮素5.00 mg于10 mL容量瓶中，對(duì)照品柚皮苷1.00 mg于100 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解并定容至刻度，配制得質(zhì)量濃度分別為500 mg/L和10 mg/L的對(duì)照品溶液。

1.3.2.3 供試品溶液的制備

取1.0 g柚皮苷純品于100 mL圓底燒瓶中，加入25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%的HCl，110 ℃油浴條件下攪拌(200 r/min)回流酸解1.5 h。酸解液冷卻至室溫，用2 mol/L NaOH將其pH調(diào)至7，將液體轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度線，稀釋40倍，在1.3.2.1的方法進(jìn)行含量測(cè)定。

1.3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別準(zhǔn)確吸取柚皮素和柚皮苷對(duì)照品溶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL；0.4、1.0、1.6、2.2、2.8 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，使其質(zhì)量濃度分別為10、30、50、70、90 mg/L；0.4、1.0、1.6、2.2、2.8 mg/L。以對(duì)照品質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程。

1.3.2.5 精密度試驗(yàn)

分別取柚皮素和柚皮苷對(duì)照品溶液1 mL，按1.3.2.1色譜條件進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄柚皮素和柚皮苷峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱取柚皮苷純品6份，按1.3.2.3的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄柚皮素和柚皮苷峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取柚皮苷純品1份，按1.3.2.3的方法制備，將供試品溶液在室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h時(shí)測(cè)定，記錄柚皮素和柚皮苷峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已測(cè)含量的酸解液10 mL 9份，每3份中分別準(zhǔn)確加入柚皮苷對(duì)照品溶液0.4、0.6、0.8 mL；柚皮素對(duì)照品溶液0.4、0.6、0.8 mL，稀釋40倍后進(jìn)樣，測(cè)定柚皮苷和柚皮素的平均回收率。

1.3.3 柚皮素得率及柚皮苷水解率計(jì)算

柚皮素及柚皮苷水解率計(jì)算如公式(1)和公式(2)。

(1)

式中：ρ,柚皮素的質(zhì)量濃度，mg/L；40,稀釋倍數(shù)；V,容量瓶體積，L；m,柚皮苷純品質(zhì)量，mg；R,柚皮苷純品純度, %。

(2)

式中：A2，反應(yīng)后柚皮苷峰面積，mAU·min；A1，反應(yīng)前柚皮苷峰面積，mAU·min。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)柚皮素制備過(guò)程中影響柚皮素得率和柚皮苷水解率的各因素進(jìn)行分析，確定最佳工藝參數(shù)。

1.3.4.1 酸解溫度的影響

取5份1.0 g柚皮苷，分別置于100 mL圓底燒瓶中，并分別加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%的HCl，酸解時(shí)間為1 h，研究酸解溫度分別為90、100、110、120、130 ℃時(shí)對(duì)柚皮素得率、柚皮苷水解率的影響。

1.3.4.2 酸解時(shí)間的影響

取5份1.0 g柚皮苷，分別置于100 mL圓底燒瓶中，并分別加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%的HCl，酸解溫度為110 ℃，研究酸解時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時(shí)對(duì)柚皮素得率、柚皮苷水解率的影響。

1.3.4.3 HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

取5份1.0 g柚皮苷，分別置于100 mL圓底燒瓶中，并分別加入20 mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的HCl，固定酸解時(shí)間為1 h，酸解溫度為110 ℃，研究HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%時(shí)對(duì)柚皮素得率、柚皮苷水解率的影響。

1.3.4.4 液料比的影響

取5份1.0 g柚皮苷，分別置于100 mL圓底燒瓶中，并分別加入不同體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%的HCl，固定酸解時(shí)間為1 h，酸解溫度為110 ℃，研究液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL∶g)時(shí)對(duì)柚皮素得率、柚皮苷水解率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化酸解制備柚皮素工藝參數(shù)

通過(guò)單因素試驗(yàn)，選擇酸解溫度、酸解時(shí)間、HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、液料比4個(gè)因素作為優(yōu)化的單因素，以柚皮素得率為指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化柚皮素的制備工藝。用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，確定最佳工藝參數(shù)。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和表的繪制，使用Origin 2018軟件制圖，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行多因素方差分析(Duncan法，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)驗(yàn)得到的柚皮素和柚皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為Y=0.906 5X-3.716 8，R2=0.999 2；Y=0.565 3X-0.0118,R2=0.999 7,由此可知柚皮素和柚皮苷分別在10～90 mg/L、0.4～2.8 mg/L有良好的線性關(guān)系，可做為含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn)

對(duì)照品溶液進(jìn)樣6次，柚皮素和柚皮苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.81%和1.12%，表明本測(cè)定方法具有較好的精密度。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

放置不同時(shí)間測(cè)得柚皮素和柚皮苷峰面積RSD分別為0.94%和0.87%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)制備并測(cè)定供試品溶液6次，柚皮素和柚皮苷含量RSD分別為1.85%和2.13%，表明本方法重現(xiàn)性好。

2.2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

如表2所示，經(jīng)加入不同體積對(duì)照品溶液，測(cè)得柚皮素和柚皮苷平均回收率分別為99.63%(RSD為1.05%)和98.87%(RSD為1.21%)。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery test

2.3 酸解前后樣品的HLPC圖

由圖1、圖2比較可見，最優(yōu)條件下反應(yīng)后，酸解液中柚皮苷(峰1)含量極低，僅為最初含量的0.69%，這表明在此條件下原料得到充分利用，水解效率高。圖2中峰2保留時(shí)間與圖3柚皮素標(biāo)品峰保留時(shí)間基本相同，可以初步判斷其即為柚皮素。

圖1 樣品酸解前高效液相色譜圖Fig.1 HPLC diagram of the sample before acidic hydrolysis

圖2 樣品酸解后高效液相色譜圖Fig.2 HPLC diagram of the sample after acidic hydrolysis

圖3 柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.3 HPLC diagram of naringenin standard

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 酸解溫度的選擇

由圖4可知，隨著溫度的升高，柚皮素得率和柚皮苷水解率也逐漸升高。當(dāng)溫度從100 ℃升至110 ℃時(shí)，柚皮素得率的升高程度明顯大于柚皮苷水解率，這說(shuō)明溫度的升高不僅增加了柚皮苷水解的質(zhì)量，還大大提高了柚皮苷的水解程度。當(dāng)溫度達(dá)到110 ℃時(shí)柚皮素得率最高，溫度繼續(xù)上升時(shí)，柚皮素得率開始逐漸下降，柚皮苷水解率變化較為平緩，因此選擇110 ℃較為適宜。

圖4 酸解溫度對(duì)柚皮苷水解率及柚皮素得率的影響Fig.4 Effect of temperature on the yield of naringeninand hydrolysis percent of naringin

2.4.2 酸解時(shí)間的選擇

如圖5所示，酸解時(shí)間對(duì)柚皮苷水解率和柚皮素得率有一定影響。當(dāng)酸解時(shí)間為1.5 h時(shí)柚皮素得率和柚皮苷水解率均達(dá)到最大值，分別為99.16%和40.58%。繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間時(shí)，柚皮苷水解率幾乎保持不變而柚皮素得率開始下降，這可能是由于時(shí)間的延長(zhǎng)柚皮素被破壞所致[18]。但因1.0 h時(shí)兩指標(biāo)與1.5 h時(shí)相差并不大，考慮到時(shí)間成本，酸解時(shí)間選擇1.0 h較為適宜。

圖5 酸解時(shí)間對(duì)柚皮苷水解率及柚皮素得率的影響Fig.5 Effect of time on the yield of naringenin andhydrolysis percent of naringin

2.4.3 HCl濃度的選擇

由圖6可知，當(dāng)HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于2.5%時(shí)，柚皮苷的水解數(shù)量和程度均不高，這可能與缺少反應(yīng)底物有關(guān)[19]。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)到達(dá)3.5%時(shí)，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，柚皮素和柚皮苷含量的變化并不明顯，說(shuō)明此時(shí)反應(yīng)物充足。故選擇3.5%為最佳HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖6 HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)柚皮苷水解率及柚皮素得率的影響Fig.6 Effect of concentration of hydrochloric acid onthe yield of naringenin and hydrolysis percent of naringin

2.4.4 液料比的選擇

由圖7可以看出，液料比對(duì)柚皮素得率和柚皮苷水解率有較大影響。酸解過(guò)程中隨著稀HCl體積的增加,柚皮素得率和柚皮苷水解率逐漸增高。當(dāng)液料比為20∶1(mL∶g)時(shí)，柚皮素得率達(dá)到最大值，為41.02%，但若繼續(xù)增加液料比,柚皮素得率有所下降，同時(shí)柚皮苷水解率升高緩慢。因此本實(shí)驗(yàn)選用最佳液料比為20∶1(mL∶g)。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酸解制備柚皮素工藝的結(jié)果

由酸解制備柚皮素優(yōu)化正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果可知，對(duì)柚皮素得率的影響大小依次為：酸解溫度>酸解時(shí)間>HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)>液料比，優(yōu)化的最佳酸解條件為A1B2C2D2，即在酸解溫度為110 ℃、酸解時(shí)間為1.5 h、HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%、液料比為25∶1(mL∶g)時(shí)柚皮素得率最高，為42.39%，此時(shí)柚皮苷水解率為99.31%。由表中方差分析可知，對(duì)柚皮素得率的影響大小為酸解溫度、酸解時(shí)間、液料比對(duì)柚皮素得率影響極顯著，而HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)柚皮素得率有顯著影響(表3、表4)。

圖7 液料比對(duì)柚皮苷水解率及柚皮素得率的影響Fig.7 Effect of liquid-solid ratio on the yield ofnaringenin and hydrolysis percent of naringin

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of orthogonal test

表5 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 5 Variance analysis of orthogonal test

注：*為差異顯著，P<0.05;**為差異極顯著，P<0.01。

3 討論

在天然活性物質(zhì)的利用過(guò)程中，往往將其中的低效成分轉(zhuǎn)化為高效成分[20]。目前，將柚皮苷轉(zhuǎn)化為柚皮素的方法主要包括酸水解法和酶水解法。酶水解法的反應(yīng)條件較為溫和，可以較好地保持產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。由于酶對(duì)化學(xué)鍵的專一性強(qiáng)，酶水解法能夠達(dá)到較高的水解率和產(chǎn)物得率。但在酶的作用溫度下(<60℃)柚皮苷的溶解度較低，酶解速率慢，導(dǎo)致較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間(24～48 h)[21]。崔莉等[22]通過(guò)在酶解液中添加聚山梨酯80，將柚皮苷的溶解度提高了21倍，反應(yīng)時(shí)間縮短到了12 h，大大提高了酶解法的效率。與酶解法相比，酸水解法工藝簡(jiǎn)單，時(shí)間短，成本低，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。伍毅[23]在70℃下，HCl的80%甲醇溶液中將銀杏黃酮水解4 h制備其苷元，在此條件下黃酮水解率為93.8%。本實(shí)驗(yàn)在達(dá)到更高水解率的前提下，水解時(shí)間更短，原因可能是在更高的溫度下，分子運(yùn)動(dòng)加快，有利于水解反應(yīng)進(jìn)行[24]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于柚皮素的酸水解制備方法的研究非常有限，以各種酶催化水解制備的研究較多，這可能與HCl和H2SO4等無(wú)機(jī)酸屬于高危險(xiǎn)管制藥品有關(guān)，因此使用蘋果酸、酒石酸等食品級(jí)有機(jī)酸作為替代品可能會(huì)成為今后發(fā)展的方向。

落果是樹體生長(zhǎng)過(guò)程中的正常生理現(xiàn)象，果實(shí)之間的養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)易導(dǎo)致落果現(xiàn)象發(fā)生，農(nóng)民也常通過(guò)疏果來(lái)提高果實(shí)品質(zhì)、避免果實(shí)遭受病蟲害[25]。早期落地幼果果皮中黃酮含量遠(yuǎn)高于成熟果，其中柚皮苷的含量大于總黃酮含量的70%[26]。然而處理大量落果的方式通常為深埋或堆積漚肥，這不僅造成巨大的資源浪費(fèi)，同時(shí)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此，以田間廢棄物豐都紅心柚落果為原料提取柚皮苷、制備柚皮素具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)為柚皮苷、柚皮素工業(yè)化量產(chǎn)的原料來(lái)源提供思路。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了不同因素對(duì)柚皮素得率及柚皮苷水解率的影響，并以柚皮素得率為指標(biāo)，選取酸解溫度、酸解時(shí)間、HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、液料比進(jìn)行工藝優(yōu)化，得出對(duì)柚皮素得率的影響大小為：酸解溫度>酸解時(shí)間>HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)>液料比，優(yōu)化的工藝條件為:酸解溫度110 ℃、酸解時(shí)間1.5 h、HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%、液料比為25∶1(mL∶g)，柚皮素得率為42.39%，柚皮苷水解率為99.31%。在此條件下，原料得到充分利用、殘余量較低，柚皮素的得率高。該方法操作簡(jiǎn)便、酸用量少，較為經(jīng)濟(jì)環(huán)保，以期對(duì)柚皮素低成本產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。