重組釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)瓦倫西亞烯及其衍生物

歐陽(yáng)小丹，李文，察亞平，朱晁誼，李爽

(華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州，510006)

瓦倫西亞烯及圓柚酮均屬于倍半萜類化合物。瓦倫西亞烯分子式為C15H24，淡黃色澄清液體，具有甜橙油特征香氣。一直是推動(dòng)消費(fèi)者偏好眾多產(chǎn)品的關(guān)鍵因素，產(chǎn)品包括食品、飲料、香水個(gè)人護(hù)理和家人護(hù)理用品[1-2]。同時(shí)，瓦倫西亞烯也是生產(chǎn)圓柚酮的重要前體。圓柚酮，分子式C15H22O，它是葡萄柚和柑橘衍生的氣味香氣成分的主要貢獻(xiàn)者，具有相對(duì)較低的香味閾值，通常在柑橘類冷榨油或精油中經(jīng)提純得到[3]。目前已被FDA和EPA批準(zhǔn)，可以用于調(diào)配橙子、圓柚、熱帶水果等實(shí)用香精和煙用香精。因?yàn)閳A柚酮具有很好的揮發(fā)性，并且它對(duì)人體無(wú)害，所以圓柚酮還被公認(rèn)為環(huán)境友好型的殺蟲劑[4-6]。故 2014年，CDC正式批準(zhǔn)兩家公司可以生產(chǎn)圓柚酮類殺蟲劑。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)圓柚酮不僅具有抑制癌細(xì)胞增生和抗血小板凝集的效果[7]，還可以防止因空氣污染引起的呼吸系統(tǒng)疾病[8]。

圓柚酮的生產(chǎn)方法主要有3種：植物提取法、化學(xué)合成法和生物催化轉(zhuǎn)化法[7, 9]。萜類化合物在植物中的含量通常都很低，植物提取法對(duì)野生植物資源易造成嚴(yán)重破壞，且其作物的種植加工受到氣候、環(huán)境、運(yùn)輸?shù)戎T多因素的影響，使得圓柚酮香料在產(chǎn)量、質(zhì)量、價(jià)格方面存在不可控的變化，經(jīng)濟(jì)可行性較差。目前，工業(yè)上常常通過(guò)直接氧化價(jià)格相對(duì)便宜的前體物質(zhì)瓦倫西亞烯來(lái)獲得圓柚酮。但是，該反應(yīng)過(guò)程通常涉及一些非環(huán)境友好的氧化劑，如三氧化鉻等重金屬鹽類[10]，相比之下，生物催化轉(zhuǎn)化方法不受原料的限制、生產(chǎn)過(guò)程綠色清潔，具有很大的優(yōu)勢(shì)[11]。

綜上所述，在微生物體內(nèi)重構(gòu)瓦倫西亞烯及其衍生物圓柚酮的生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)瓦倫西亞烯及圓柚酮的菌株極具現(xiàn)實(shí)意義。2011年，CANKAR等在釀酒酵母WAT11中異源表達(dá)來(lái)源于黃扁柏的瓦倫西亞烯合成酶，獲得1.36 mg/L的瓦倫西亞烯[12]。EMMERSTORFER等通過(guò)在釀酒酵母W303中異源表達(dá)圓柚酮生物合成途徑中的幾個(gè)關(guān)鍵酶，總萜產(chǎn)量達(dá)31 mg/L[13]。2018年，GUO等利用解酯耶式酵母作為宿主菌株，5 d后瓦倫西亞烯和圓柚酮的產(chǎn)量分別達(dá)22.8、0.98 mg/L[9]?；卺劸平湍副还J(rèn)為安全的模式生物，本研究在釀酒酵母PK2-1Ca中引入圓柚酮的生物合成途徑，結(jié)合代謝工程策略，優(yōu)化代謝通路，旨在進(jìn)一步提高瓦倫西亞烯及其衍生物的產(chǎn)量，為利用釀酒酵母規(guī)模化生產(chǎn)瓦倫西亞烯及其衍生物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒和菌種

質(zhì)粒和菌種如表1、表2所示，本實(shí)驗(yàn)用到的出發(fā)菌株包括購(gòu)于英濰捷基的E.coliDH5(F-φ80 lacZ ΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169recA1endA1hsdR17 (rK-, mK+)phoAsupE44 λ-thi-1gyrA96relA1)，購(gòu)于ATCC?MYA-1108TM的CEN.PK2-1Ca(MATatrp1-289leu2-3leu2-112ura3-52his3Δ1)及實(shí)驗(yàn)室保存的CEN.PK2-1Ca-M(MATatrp1-289leu2-3leu2-112ura3-52his3Δ1erg9::Δ-220—176rox1::mut)。

表2 試驗(yàn)所用菌株Table 2 Strains that used in this study

1.1.2 主要試劑

本文重組表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中所用到的各種限制性內(nèi)切酶、DNA marker、2×PrimerSTAR Max Premix:Takara公司；2×DreamTaq Green PCR Master Mix:上海Thermo Fisher Scientific公司；T4 DNA ligase:NEB公司；KOD FX:日本TOYOBO公司；快速質(zhì)粒小提試劑盒:天根(北京)股份有限公司；Cycle-Pure Kit:Omega股份有限公司；酵母轉(zhuǎn)化試劑盒:英濰捷基；基因、引物合成及測(cè)序:由生工生物工程股份有限公司完成；瓦倫西亞烯、圓柚醇、圓柚酮標(biāo)準(zhǔn)品:上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5，酵母提取物5，蛋白胨10。LB/Amp+抗性培養(yǎng)基：以體積比1∶1 000加入氨芐青霉素(100 g/L)。YPD液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10，葡萄糖20，蛋白胨20。SD液體培養(yǎng)基(g/L)：無(wú)水葡萄糖20，體積比1∶10加入10×酵母氮源(YNB)貯液和10×DO添加劑貯液。按需要添加相應(yīng)的氨基酸。SG液體培養(yǎng)基(g/L)：半乳糖20，體積比1∶10加入10×酵母氮源(YNB)貯液和10×DO添加劑貯液。根據(jù)需要按體積比1∶100添加相應(yīng)的100×氨基酸貯液。固體培養(yǎng)基則在此基礎(chǔ)上添加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂粉。

1.1.4 儀器與設(shè)備

PCR基因擴(kuò)增儀，美國(guó)Bio-Rad公司；小型高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；UV-2100型分光光度計(jì)，UNICO公司；生化培養(yǎng)箱，上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫?fù)u床，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；超低溫冰箱，美國(guó)Thermo公司；水平型電泳槽，上海天能科技有限公司；超微量分光光度計(jì)，美國(guó)GE Nano Vue公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因擴(kuò)增

細(xì)胞色素P450單加氧酶HPO (Hyoscyamusmuticus，GenBank：EF569601.1)、瓦倫西亞烯氧化酶CnVO(Callitropsisnootkatensis，GenBank：JX518290)、CYP450還原酶AtCPR (Arabidopsisthaliana， GenBank：NM_118585.3)，瓦倫西亞烯合成酶CnVS(Callitropsisnootkatensis，GenBank：JX040471)，由上海生工生物工程有限公司經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成。以公司合成的基因?yàn)閿U(kuò)增模板，用引物對(duì)HPO-U/D，CnVO-U/D，AtCPR-F/R，VS-U/D分別擴(kuò)增出HPO，CnVO，AtCPR，CnVS四個(gè)基因片段，引入酶切位點(diǎn)SmaI、BamH I。以酵母基因組為模板，ADH1-U/D，tHMG1-U/D為擴(kuò)增引物對(duì)，從酵母基因組擴(kuò)增得到ADH1和tHMG1，試驗(yàn)所需引物如表3所示。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

基于課題組前期構(gòu)建好的表達(dá)載體YEp352-PGAL1-GFP-TCYC1，用BamH I和SmaI雙酶切該載體和經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的目的基因片段HPO、AtCPR、CnVO，經(jīng)切膠回收，純化，16 ℃過(guò)夜連接。轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5中，成功構(gòu)建3個(gè)表達(dá)載體?；赮Ep352-PGAL1-HPO-TCYC1的成功構(gòu)建，以YEp352-PGAL1-HPO-TCYC1為模板，GAL1-F1/ GAL1-R1為引物，PCR擴(kuò)增出具有酶切位點(diǎn)EcoR I和PstI的PGAL1-HPO-TCYC1基因表達(dá)盒，然后用EcoR I和PstI對(duì)PGAL1-HPO-TCYC1基因片段及YEplac181空載進(jìn)行雙酶切。純化后連接，構(gòu)建YEp181-PGAL1-HPO-TCYC1的重組表達(dá)載體。同理可以構(gòu)建YEp181-PGAL1-CnVO-TCYC1的重組表達(dá)載體?；诖?，利用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建了對(duì)應(yīng)的4個(gè)突變體，分別為mHPO，CnVO-3，CnVO-4，CnVO-34。

表3 試驗(yàn)所用引物Table 3 Primers used in this study

注：下劃線部分為酶切位點(diǎn)。

基于課題組前期構(gòu)建好的表達(dá)載體YEp181-PTDH3-TADH1和YEp181-PTEF1-TCYC1，用BamH I和SmaI雙酶切上述兩載體及目的基因片段CnVS，16 ℃過(guò)夜連接，分別得到Y(jié)Ep181-PTDH3-VS-TADH1和YEp181-PTEF1-VS-TCYC1重組表達(dá)載體。同樣的，得到Y(jié)Ep181-PTDH3-tHMG1-TADH1和YEp181-PTDH3-ADH1-TADH1兩個(gè)表達(dá)載體。最后利用SalI，XhoI同尾酶的性質(zhì)，運(yùn)用biobrick的方法，實(shí)現(xiàn)多基因串聯(lián)表達(dá)在同一表達(dá)載體上。

1.2.3 培養(yǎng)方法

將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體，利用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒轉(zhuǎn)入相應(yīng)的酵母感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組酵母菌株。

靜息細(xì)胞試驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)方法：(1)接種：挑轉(zhuǎn)化子接種于5 mL SD-(Leu-(Ura液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)22～24 h，OD600為1～3。(2)擴(kuò)大培養(yǎng)：準(zhǔn)備數(shù)個(gè)滅菌的250 mL的帶擋板的搖瓶。每瓶分裝50 mL SD-ΔLeu-ΔUra，接種種子液，使發(fā)酵初始OD600為0.1。30 ℃，200 r/min培養(yǎng)20～22 h，OD600為3.5～4.0。(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)：1 060×g離心收集菌體，棄盡上清，50 mL SG-ΔLeu-ΔUra誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸菌體，30 ℃，200 r/min誘導(dǎo)8 h。(4)1 062×g離心，收集150 OD600單位的誘導(dǎo)后細(xì)胞，1 mL、50 mmol/L K3PO4溶液(pH 7.4)重懸，裝至催化小瓶，添加20 μL、100 mmol/L瓦倫西亞烯(溶于DMSO且含1%(體積分?jǐn)?shù)) Triton X-100)，蓋子旋松，30 ℃、200 r/min催化 18 h。(5)制樣：加入1 mL乙酸乙酯，室溫條件下用VXR basic Vibrax?最大轉(zhuǎn)速振蕩30 min、2 720×g離心15 min，待分層后取有機(jī)相，500 μL的有機(jī)相加入500 μL的乙酸乙酯，再加入2 μL、25 mmol/L的異長(zhǎng)葉烯，少量無(wú)水硫酸鈉，除去可能存在的水分，用0.22 μm無(wú)菌有機(jī)相濾頭過(guò)濾到干凈的氣相色譜瓶中，-20 ℃保存。

原位發(fā)酵培養(yǎng)方法：(1)活化的平板在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d。(2)接種：挑單菌落接種于5 mL的SD-ΔLeu-ΔUra液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)22～24 h，OD600長(zhǎng)到1～3。(3)將種子液分別接種于含10 mL SD-ΔLeu-ΔUra的50 mL小搖瓶中，每株菌做3個(gè)平行，起始OD600為0.05，30 ℃培養(yǎng)14～16 h，OD600長(zhǎng)到1。(4)1 062×g離心收集菌體，10 mL SG-ΔLeu-ΔUra重懸，并加入2 mL的正十二烷覆蓋。30 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h。(5)取發(fā)酵液上層有機(jī)相500 μL，加入500 μL的乙酸乙酯，再加入2 μL、25 mmol/L的異長(zhǎng)葉烯作為內(nèi)標(biāo)，用0.22 μm無(wú)菌有機(jī)相濾頭過(guò)濾到干凈的氣相色譜瓶中。

補(bǔ)料分批發(fā)酵方法：發(fā)酵罐條件，通氣量1 vvm，DO>30%，溫度30 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速200～500 r/min，2 mol/L NaOH自動(dòng)控制pH=5.5。發(fā)酵方式為間歇補(bǔ)料發(fā)酵，每隔48 h補(bǔ)料1次，每次50 mL、20倍的SG儲(chǔ)液。補(bǔ)料次數(shù)3次。

(1)一級(jí)種子液培養(yǎng)：從活化的平板上挑取單菌落接種到接種于5 mL的SD-ΔLeu-ΔUra液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)22～24 h，OD600長(zhǎng)到 1～3。

二級(jí)種子液培養(yǎng)：將一級(jí)種子液接種到含有50 mL SD-ΔLeu-ΔUra液體培養(yǎng)基的250 mL擋板搖瓶中，使起始OD600為0.1，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，OD600為3～5。

(2)發(fā)酵罐接種：超凈工作臺(tái)中，用50 mL離心管收集菌體，常溫1 060×g離心收集菌體，棄盡上清，并在超凈工作臺(tái)用50 mL SG-ΔLeu-ΔUra重懸菌體。然后接種至裝有950 mL SG-ΔLeu-ΔUra的發(fā)酵罐中，起始OD600為0.3～0.5。并覆蓋200 mL的正十二烷，開始發(fā)酵。

(3)每隔12 h取1次樣，每次取樣控制在3～5 mL，12 000 r/min離心5 min。取上層有機(jī)相制備氣相樣。方法同搖瓶制樣。

1.2.4 GC-FID及GC-MS檢測(cè)分析產(chǎn)物

GC-FID：檢測(cè)產(chǎn)物用到的是Hewlett-Packard 5890 Ⅱ 氣相色譜儀，色譜柱為5% Ph-Me硅氧烷柱，規(guī)格為10 m×0.10 mm×0.10 μm，檢測(cè)器為氫火焰檢測(cè)器(flame ionization detector，F(xiàn)ID)，設(shè)置的程序如下：1 μL樣品分流進(jìn)樣，分流比30∶1，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度320 ℃，流速為0.4 mL/min，柱溫100 ℃保持10 min，再以10℃/min升溫至200 ℃，200 ℃保持8 min，總時(shí)間為28 min。打開儀器及軟件，編好序列，將樣品瓶按順序放到樣品盤中，進(jìn)樣。

GC-MS：本試驗(yàn)用到的是Hewlett-Packard 5890 Ⅱ 氣相色譜儀，色譜柱為石英毛細(xì)管柱，規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm，檢測(cè)器為質(zhì)量選擇檢測(cè)器(mass selective detectors，MSD)。程序同GC-FID程序。質(zhì)量掃描的方式：選擇離子掃描。質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)電離源，電子能量70 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母重組載體的構(gòu)建

2.1.1 單基因表達(dá)載體的構(gòu)建

以公司合成的基因?yàn)槟０?，引物?duì)HPO-U/D、CnVO-U/D、AtCPR-F/R、CnVS-U/D分別擴(kuò)增出具有酶切位點(diǎn)的HPO、CnVO、AtCPR、CnVS四個(gè)基因片段，長(zhǎng)度分別為1 509、1 512、2 079、1 770 bp。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證均符合預(yù)期大小，結(jié)果如圖1所示。

以YEp181-PGAL1-mHPO-TCYC1載體的構(gòu)建為例，分別以GAL1-F1/HPO-482DM、HPO-482UM/GAL1-R1為擴(kuò)增引物對(duì)，以YEp352-PGAL1-HPO-TCYC1為模板，擴(kuò)增出上下游2個(gè)小的基因片段，大小分別為2 023和376 bp，將純化后的兩片段混合，使其互為模板和引物，然后加入dNTP及引物GAL1-F1/ GAL1-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到已經(jīng)定點(diǎn)突變的全長(zhǎng)片段mHPO，長(zhǎng)度為 2 364 bp，CnVO-3，CnVO-4和CnVO-34長(zhǎng)度均為2 367 bp。然后利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和PstI對(duì)該片段及載體YEplac181進(jìn)行雙酶切，將酶切后的載體與片段連接，得到Y(jié)Ep181-PGAL1-mHPO-TCYC1，同理得到Y(jié)Ep181-PGAL1-CnVO-3-TCYC1，YEp181-PGAL1-CnVO-4-TCYC1， YEp181-PGAL1-CnVO-34-TCYC13個(gè)重組表達(dá)載體。酶切驗(yàn)證如圖2所示，大小符合預(yù)期，測(cè)序結(jié)果正確。

M-DL10 000 DNA marker；1-CnVO；2-HPO；3-AtCPR；4-CnVSa-CnVO和HPO的PCR產(chǎn)物；b-AtCPR的PCR產(chǎn)物；c-CnVS的PCR產(chǎn)物圖1 HPO，CnVO，AtCPR，CnVS四個(gè)基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The agarose gel electrophoresis of HPO, CnVO,AtCPR， CnVS four gene fragments

M-DL10 000 DNA Marker；1～3-YEp181-PGAL1-mHPO -TCYC1質(zhì)粒，質(zhì)粒單切，質(zhì)粒雙切；4～6-YEp181-PGAL1-CnVO-3 -TCYC1，質(zhì)粒單切，質(zhì)粒雙切；7～9-YEp181-PGAL1-CnVO-4-TCYC1質(zhì)粒，質(zhì)粒單切，質(zhì)粒雙切；10～12-YEp181-PGAL1-CnVO-34 -TCYC1圖2 突變體酶切驗(yàn)證瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 The agarose gel electrophoresis of the mutantsenzyme digestion

用BamH I和SmaI雙酶切YEp181-PTDH3-TADH1和YEp181-PTEF1-TCYC1及擴(kuò)增得到的CnVS基因片段，連接轉(zhuǎn)化獲得YEp181-PTDH3-VS-TADH1和YEp181-PTEF1-VS-TCYC1重組表達(dá)載體。從NCBI上獲得ADH1，tHMG1基因序列，以試劑盒提取的釀酒酵母PK2-1Ca的基因組為模板，引物對(duì)ADH1-U/D， tHMG1-U/D擴(kuò)增出目的基因片段，經(jīng)酶切連接轉(zhuǎn)化，得到Y(jié)Ep181-PTDH3-ADH1-TADH1， YEp181-PTDH3-tHMG1-TADH1，上述載體酶切驗(yàn)證如圖3所示，切下的目的片段大小分別為1 770，2 492，1 047和1 578 bp，大小符合預(yù)期。

M-DL10000 DNA Marker;1～2-YEp181-PTDH3-VS-TADH1質(zhì)粒，BamH I和Sma I雙酶切；3～4 YEp181-PTEF1-VS -TCYC1質(zhì)粒，EcoR I和Pst I雙酶切；5～6-YEp181-PTDH3- ADH1-TADH1質(zhì)粒，BamH I和Sma I雙酶切；7～9-YEp181-PTDH3- tHMG1-TADH1質(zhì)粒；8～10-YEp181-PTDH3- tHMG1-TADH1質(zhì)粒BamH I和Sma I雙酶切a-YEp181-PIDH3-VS-TADH1質(zhì)粒；b-YEp181-PTEF1-VS-TCYC1質(zhì)粒；c-YEP181-PTDH3-ADH-TADH1質(zhì)粒；d-YEP181-PTDH3-tHMG1-TAOH1質(zhì)粒圖3 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 The agarose gel electrophoresis of plasmids enzyme digestion

2.1.2 多基因串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建

考慮到圓柚酮生物合成途徑涉及的關(guān)鍵酶基因較多，本研究將多個(gè)基因串聯(lián)表達(dá)在同一表達(dá)載體上，得到p181-V1H，p181-V2H，p181-V1V2，p181-V1HV2， p352-A1mHC 5個(gè)多基因重組表達(dá)載體。部分載體酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖4所示。

M-DL15000 DNA Marker;1、3-p352-A1mHC質(zhì)粒；2、4-酶切(1 953、2 322、8 043bp)； 5～7-p181-V1HV2原質(zhì)粒，單切(13 498 bp)，雙切(2 661、10 837 bp)a-p552-AlmHC質(zhì)粒；b-P181-V1HV2質(zhì)粒圖4 p352-A1mHC質(zhì)粒和p181-V1HV2質(zhì)粒酶切驗(yàn)證瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 The agarose gel electrophoresis of enzyme digestionof p352-A1mHC and p181-V1HV2

2.2 CYP450的篩選

各重組菌株靜息催化瓦倫西亞烯生成圓柚醇和圓柚酮的產(chǎn)量如圖5所示。對(duì)照菌株P(guān)K2-C中沒有檢測(cè)到圓柚醇和圓柚酮。PK2-01檢測(cè)到48.36 mg/L的圓柚醇和10.93 mg/L的圓柚酮，該菌株對(duì)底物瓦倫西亞烯的轉(zhuǎn)化率可達(dá)10.73%。而之前報(bào)道稱HPO不能在釀酒酵母細(xì)胞中轉(zhuǎn)化瓦倫西亞烯生成圓柚酮[14]。故推測(cè)S.cerevisiaePK2-1Ca體內(nèi)存在脫氫酶將中間產(chǎn)物圓柚醇轉(zhuǎn)化生成了圓柚酮。顯然，PK2-02中圓柚醇和圓柚酮的產(chǎn)量與PK2-01相比，沒有明顯的差別。之前文獻(xiàn)報(bào)道突變體mHPO對(duì)瓦倫西亞烯的轉(zhuǎn)化率提高了15倍[14]，然而這是基于體外檢測(cè)的結(jié)果。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，在非生理?xiàng)l件下獲得的酶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)通常不符合代謝途徑中體內(nèi)酶動(dòng)力學(xué)。如今開發(fā)了許多基于模擬各種生物細(xì)胞體內(nèi)的條件測(cè)定酶動(dòng)力學(xué)的方法[15]。此外對(duì)于CnVO及其對(duì)應(yīng)的3個(gè)突變體(CnVO A366P/L377V、CnVO K477L/Y478V/V481T/L482I、CnVO A366P/L377V/K477L/Y478V/V481T/L482I)而言，圓柚醇和圓柚酮的產(chǎn)量較mHPO下降了10%～15%。故根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選取mHPO作為后續(xù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)。

圖5 不同菌株靜息細(xì)胞試驗(yàn)圓柚醇和圓柚酮的產(chǎn)量Fig.5 The yield of β-nootkatol and (+)-nootkatonein resting cell assays of different strains

2.3 重組酵母菌株產(chǎn)物產(chǎn)量分析

基于靜息細(xì)胞試驗(yàn)篩選得到的P450氧化酶mHPO，構(gòu)建了多株圓柚酮從頭合成的重組酵母菌株。代謝途徑如圖6所示。

圖6 釀酒酵母中圓柚酮的生物合成途徑Fig.6 The biosynthetic pathway of (+)-nootkatone in Saccharomyces cerevisiae

取各菌株發(fā)酵液的上層有機(jī)相制樣，經(jīng)GC-FID檢測(cè)，各菌株產(chǎn)量如圖7所示。(1)當(dāng)宿主菌株為PK2-1Ca-M時(shí)，總萜產(chǎn)量相較于宿主菌株為野生型菌株P(guān)K2-1Ca時(shí)的2.79 mg/L，提高了3.92倍。故下調(diào)ERG9和敲除ROX1能夠有效減少支流，促進(jìn)法尼烯焦磷酸鹽FPP的積累[16-18]，從而增加瓦倫西亞烯和圓柚醇的產(chǎn)量。有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)宿主菌株為WAT11時(shí)，總萜產(chǎn)量?jī)H為1.11 mg/L[19]，研究表明，在釀酒酵母S.cerevisiaeCEN.PK的菌株中，麥角固醇生物合成途徑強(qiáng)于其他來(lái)源的菌株[20]，比如S288c，這可能使得S.cerevisiaeCEN.PK菌株體內(nèi)法尼烯焦磷酸鹽FPP的濃度比一般菌株要高，故總萜產(chǎn)量提高。(2)進(jìn)一步過(guò)表達(dá)tHMG1，總萜產(chǎn)量提高了1.7倍，表明tHMG1在類異戊二烯合成途徑中的關(guān)鍵地位[21-28]。(3)當(dāng)CnVS的啟動(dòng)子由TDH3更換為TEF1時(shí)，總萜產(chǎn)量整體提高了2倍，達(dá)34.4 mg/L。說(shuō)明啟動(dòng)子的適配性對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量起著至關(guān)重要的作用[29-30]，具體影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。(4)增加CnVS的拷貝數(shù)時(shí)，PK2-26總萜產(chǎn)量顯著下降至13.4 mg/L，即意味著增加CnVS的拷貝數(shù)不一定能增加產(chǎn)物瓦倫西亞烯的積累，曾有文獻(xiàn)報(bào)道目的基因的拷貝數(shù)與目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量不一定呈正相關(guān)關(guān)系，即不是某目的基因拷貝數(shù)越高，相應(yīng)的產(chǎn)物產(chǎn)量越高[31-32]，LIAN等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用基于CEN/ARS的低拷貝數(shù)質(zhì)粒時(shí)，纖維二糖利用途徑表現(xiàn)出比高拷貝數(shù)質(zhì)粒高得多的效率[33]。

圖7 不同酵母工程菌株體內(nèi)合成瓦倫西亞烯及圓柚醇的產(chǎn)量Fig.7 The yield of (+)-valencene and β-nootkatolin vivo with different strains注：第一個(gè)“+、-”代表erg 9-rox為“+、-”；第二個(gè)“+、-”代表t HMG為“+、-”。

2.4 重組酵母菌株3L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)瓦倫西亞烯及其衍生物

根據(jù)搖瓶水平的結(jié)果，選定最佳組合菌株P(guān)K2-24，按照1.2.3中的方法，進(jìn)行上罐發(fā)酵試驗(yàn)，希望進(jìn)一步提高總萜的產(chǎn)量。如圖8，在發(fā)酵的早期，消耗的半乳糖主要用于菌體的生長(zhǎng)，瓦倫西亞烯和圓柚醇的積累比較緩慢，保持在較低的水平。48 h后，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期，但是產(chǎn)物的積累量仍不斷提高，發(fā)酵158 h后，瓦倫西亞烯和圓柚醇的積累量分別達(dá)到264.6和46.3 mg/L。終OD600為6.8?？梢娭亟M酵母PK2-24生產(chǎn)總萜的能力(45.9 mg/L)是文獻(xiàn)報(bào)道中畢赤酵母總萜的生產(chǎn)能力(0.7 mg/L)的65.6倍[7]。且是目前文獻(xiàn)報(bào)道的釀酒酵母的最高產(chǎn)量(表4)，說(shuō)明該菌株已具備一定的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)。

圖8 3L發(fā)酵罐中PK2-24菌株瓦倫西亞烯和圓柚醇的積累及菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.8 The production of (+)-valencene and β-nootkanoland the growth curve of PK2-24 in a 3L fermentor

表4 釀酒酵母合成瓦倫西亞烯及其衍生物的比較Table 4 Comparison of (+)-valencene and its related terpenoids production by recombinant Saccharomyces cerevisiae

注：a，來(lái)源于黃扁柏的瓦倫西亞烯合成酶；b，來(lái)源于擬南芥的細(xì)胞色素還原酶；c，從文獻(xiàn)中的圖片計(jì)算得到。

綜上，重組酵母PK2-24上罐發(fā)酵過(guò)程中始終有大量的瓦倫西亞烯的積累，表明HPO和AtCPR的活性不足以將瓦倫西亞烯充分轉(zhuǎn)化。無(wú)論是搖瓶水平還是發(fā)酵罐水平，工程菌株的終OD600始終保持在 6.0～9.0的水平，菌體生物量偏低。遺憾的是，始終都沒有檢測(cè)到圓柚酮的生成，這與靜息細(xì)胞試驗(yàn)不相符。其一可能是全細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的其他代謝途徑比較活躍，競(jìng)爭(zhēng)中間體圓柚醇生成了其他副產(chǎn)物；其二可能由于有機(jī)相的覆蓋，瓦倫西亞烯和圓柚醇被過(guò)早萃取至上層有機(jī)相，阻礙底物進(jìn)出細(xì)胞，無(wú)法與酵母體內(nèi)的酶充分接觸；其三，生成的少量圓柚酮部分積累在細(xì)胞內(nèi)膜上[35]，沒有充分釋放到細(xì)胞外，故培養(yǎng)液中沒有檢測(cè)到圓柚酮。

3 結(jié)論

目前，利用微生物合成瓦倫西亞烯及其衍生物已見諸報(bào)道[7, 9, 11]，但仍然面臨著許多挑戰(zhàn)，包括產(chǎn)量低，周期長(zhǎng)，分離純化困難等問(wèn)題[36]。而釀酒酵母作為公認(rèn)的食品安全微生物，具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本文以釀酒酵母PK2-1Ca為宿主菌株，引入來(lái)源于植物的HPO、CnVO、CnVS及AtCPR，重構(gòu)瓦倫西亞烯及其衍生物的生物合成途徑。結(jié)合代謝工程策略，最終獲得瓦倫西亞烯及其相關(guān)衍生物的高產(chǎn)重組酵母菌株，PK2-24，經(jīng)3L發(fā)酵罐上進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，瓦倫西亞烯及圓柚醇的產(chǎn)量分別達(dá)264.6和46.3 mg/L，為目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高產(chǎn)量，展現(xiàn)了釀酒酵母生產(chǎn)倍半萜類物質(zhì)的應(yīng)用前景。值得注意的是，試驗(yàn)中有大量的瓦倫西亞烯的積累，表明HPO和AtCPR的活性不足，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，故后續(xù)研究工作需進(jìn)一步提高HPO和AtCPR的表達(dá)量及其穩(wěn)定性或者挖掘更高效的CYP450，使瓦倫西亞烯充分轉(zhuǎn)化。此外，還需提高菌體生長(zhǎng)密度，促進(jìn)產(chǎn)物積累及挖掘具有潛在應(yīng)用價(jià)值的醇脫氫酶，最終獲得終產(chǎn)物圓柚酮，為未來(lái)利用重組釀酒酵母規(guī)?；a(chǎn)圓柚酮奠定基礎(chǔ)。