雌、孕激素對宮頸腺癌Hela細(xì)胞荷瘤裸鼠的影響

涂開家 陳 偲 羅 美 李明梅 程曉曉 李隆玉

宮頸癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，據(jù) WHO癌癥研究署估計，全球每年新發(fā)病例49.32 萬，中國約 13.15萬(28.88%)。近年來，由于宮頸癌的篩查廣泛開展，宮頸鱗癌發(fā)病率有了明顯的下降，但宮頸腺癌的發(fā)病率卻逐年增加，約占宮頸癌總數(shù)的 20%[1]，其中約 60.3%的宮頸腺癌患者年齡小于 50 歲，而小于 40 歲的患者約57.38%[2]。

激素替代治療 (hormone replacement therapy,HRT)可極大改善圍絕經(jīng)期雌激素缺乏綜合征[3-4]，能明顯提高患者生活質(zhì)量。但由于女性生殖器官為激素的靶器官，眾多學(xué)者認(rèn)為雌激素會促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展[5-6]，但也有學(xué)者提出不同觀點，認(rèn)為雌激素能抑制宮頸腺癌細(xì)胞的增殖和分化[7]，孕酮對乳腺癌有促進(jìn)作用，但卻可以減少和抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展[8]，孕酮還可以減少卵巢癌的發(fā)生[9]，因此，有理由認(rèn)為，宮頸作為孕激素的靶器官[10]，孕激素可能對宮頸病變甚至宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有著重要的影響。Rour等[11]2016年的一項大樣本前瞻性隊列研究，發(fā)現(xiàn)圍絕經(jīng)或絕經(jīng)后婦女使用外源性激素替代治療的患者宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險更低，且激素替代治療持續(xù)時間越長的婦女宮頸癌發(fā)病風(fēng)險越低(≤1年、2～4年及≥5年的HR分別是0.7、0.6及0.4)，同時，相比于單純的雌激素替代治療，研究組更推薦雌孕激素聯(lián)合替代治療，但研究未探討病理類型相關(guān)風(fēng)險。

相對于宮頸鱗，宮頸腺癌患者治療后的激素替代治療的爭議更大，為此，我們用宮頸腺癌Hela細(xì)胞懸液接種裸鼠，建立荷瘤裸鼠模型，用E2(雌二醇)、P(醋酸甲羥孕酮)及E2+P對裸鼠進(jìn)行分組治療，觀察腫瘤大小及裸鼠體重及生存時間的差異，初步評價激素干預(yù)對荷瘤裸鼠體內(nèi)Hela細(xì)胞腫瘤生長的影響，為臨床進(jìn)行宮頸腺癌激素替代治療提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞株及動物

宮頸腺癌Hela細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心，BLAB/c雌性裸鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司。

1.2 實驗方法

采用免疫組化方法檢測體外培養(yǎng)的人宮頸腺癌HeLa細(xì)胞雌、孕激素受體的表達(dá)；

實驗分四組：E2(雌二醇)組、P(醋酸甲羥孕酮)組、E2+P組及對照組，32只4周齡裸鼠隨機分配，各組8只(用剪趾法標(biāo)記)，分別于裸鼠雙側(cè)后肢背部皮下注射Hela細(xì)胞懸混液(0.1 ml細(xì)胞懸液約5×106個細(xì)胞)，其中E2中8號裸鼠組右側(cè)背部接種失敗，E2組只接種成功15個部位，余各均接種16個部位，細(xì)胞懸液注射后24 h分別予E2(1 μg)、P(150 μg)和E2+P(1 μg+150 μg)及實驗組等體積溶劑(1%DMSO+10%羥丙基-β環(huán)糊精的生理鹽水100 μl)腹腔注射治療。

每天觀察各組老鼠的生活狀態(tài)，種瘤當(dāng)天、給藥當(dāng)天和給藥后每3天稱重，共計給藥1個月。給藥期間觀察各組腫瘤形成及生長情況。

每只裸鼠腹腔注射5%水合氯醛1 ml麻醉，后用頸椎脫臼法處死裸鼠，分離取出腫瘤，測量分離出來的腫瘤長徑、短徑并稱重。體積(mm3)=(長徑×短徑×2)/2。抑瘤率=(空白組-實驗組)/空白組×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞株的一般特性

Hela細(xì)胞為貼壁生長細(xì)胞，呈梭形，約2～3天傳代一次。

2.2 Hela細(xì)胞雌、孕激素受體Er、Pr檢測

Hela細(xì)胞Er表達(dá)結(jié)果顯示，與陽性對照乳腺癌MCF7類似，Hela細(xì)胞雌激素受體為強陽性(+++)。

Hela細(xì)胞Pr表達(dá)結(jié)果顯示，與陽性對照乳腺癌MCF7類似，Hela細(xì)胞孕激素受體為強陽性(+++)，證實所購得的Hela細(xì)胞符合實驗要求，進(jìn)一步進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3 荷瘤裸鼠的建立及激素治療

細(xì)胞懸液注射一周后裸鼠腫瘤細(xì)胞接種部位出現(xiàn)不活動的硬結(jié)，直徑約5～8 mm左右，脫臼法處死小鼠取瘤送病理檢查，提示成功建立Hela細(xì)胞荷瘤裸鼠模型，對照組、E2組、P組及E2+P組各組成瘤率分別是：87.5%(14/16)、100%(15/15)、81.25%(13/16)、100%(16/16)，各組間成瘤率無明顯差異(P>0.05)。腫瘤接種后兩周，各組間裸鼠體重相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各組腫瘤體積相比，E2組與對照組相比腫瘤體積較大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，腫瘤促進(jìn)率達(dá)到47.89%，E2組體積較P組更大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 接種兩周各組間小鼠體重、成瘤率、腫瘤體積及腫瘤促進(jìn)率

注：#為E2組腫瘤體積與對照組相比，P<0.05；△為E2組與P組腫瘤體積相比，P<0.05；*為各組間成瘤率相比，P>0.05；▲為各組裸鼠體重相比，P>0.05。

實驗裸鼠用藥82天，對照組、E2組、P組及E2+P組的腫瘤體積分別是105.89 mm3、450.17 mm3、107.96 mm3及168.94 mm3，其中E2與對照組相比，腫瘤體積更大，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，各組裸鼠體重之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，我們觀察到，腫瘤體積最大者出自E2組，E2組的1號鼠(E2-1)有腹腔轉(zhuǎn)移瘤(體重19.5 g)，存活、E2+P組的2號(E2+P-2)和7號鼠(E2+P-7)分別有頭部轉(zhuǎn)移及腹腔轉(zhuǎn)移瘤(二者體重分別為15 g及9.9 g)，并且均死亡，轉(zhuǎn)移率分別為12.5%(1/8)及25%(2/8)，其中E2組的轉(zhuǎn)移瘤體積為171.5 mm3，E2+P的轉(zhuǎn)移瘤體積分別為1070 mm3和600 mm3，E2+P轉(zhuǎn)移瘤體積明顯更大(表2)。

表2 接種82天各組間小鼠體重、腫瘤體積及轉(zhuǎn)移瘤情況

注：*為小鼠體重各組兩兩對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義；#為因腫瘤體積不符合正態(tài)性檢驗，用秩和檢驗對各組進(jìn)行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)P組、E2+P組分別與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，E2組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，E2與P組相比，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

目前大多數(shù)觀點認(rèn)為宮頸鱗狀細(xì)胞癌與雌激素?zé)o關(guān)，可以行激素替代治療，但宮頸腺癌的激素替代治療仍存在較多爭議，有學(xué)者認(rèn)為一定濃度的E2(0.5～10 nmol/l)能促進(jìn)宮頸腺癌Hela細(xì)胞的增殖[12]，隨著E2濃度的增加(1 nmol/l)，促進(jìn)作用增強[13]，Wren 等[14]提出，對于宮頸腺癌患者 HRT被認(rèn)為是1種潛在的致癌促進(jìn)劑，要慎用；而另外一些學(xué)者的研究觀察到不同的結(jié)果，認(rèn)為一定濃度的E2(20～120 nmol/l)能抑制Hela細(xì)胞的增殖，并使細(xì)胞周期抑制在G2/M期，并進(jìn)一步促進(jìn)其凋亡[7]。

在本實驗中，Hela細(xì)胞接種裸鼠后24 h即開始每天給裸鼠腹腔注射E2、P、E2+P，Hela細(xì)胞接種1周后經(jīng)病理證實荷瘤裸鼠構(gòu)建成功，各組成瘤率統(tǒng)計學(xué)無差異(P>0.05)，用藥2周，各組裸鼠體重統(tǒng)計學(xué)無差異(P>0.05)，E2組腫瘤與對照組及P組相比腫瘤體積較大(P<0.05)，E2組腫瘤促進(jìn)率達(dá)到47.89%，腫瘤接種82天，實驗裸鼠中E2組的腫瘤體積與其他組相比更大(P<0.05)，且腫瘤最大者出自E2組，并有1只裸鼠出現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移瘤，我們認(rèn)為E2能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，這與其他作者報道的相似[6,15]。

關(guān)于孕激素對宮頸癌的作用，Harris等[16]對458位致瘤性HPV感染的婦女的研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)使用孕激素(MPA)2年并不增加發(fā)生宮頸病變的風(fēng)險，且觀察到MPA與CIN以上病變成負(fù)相關(guān)，Yoo等[15]基于HPV E6、E7基因轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，孕酮能抑制甚至消除因E2所致的孕激素受體陽性的小鼠下生殖道腫瘤，而對孕激素受體陰性的小鼠沒有這種作用，認(rèn)為孕激素對宮頸病變的抑制作用。我們觀察到，E2+P組2只裸鼠分別有頭部及腹腔轉(zhuǎn)移瘤，并且均體重較輕(二者體重分別為15 g及9.9 g)，明顯低于各組平均體重[對照組、E2組、P組、E2+P組分別是(21.23±1.04)g、(21.0±0.6)g、(20.76±3.61)g、(21.21±1.91)g]，兩只裸鼠均于81天死亡，且E2+P組轉(zhuǎn)移瘤體積明顯較E2更大，考慮E2+P可能促進(jìn)早期腫瘤轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致惡液質(zhì)從而進(jìn)一步導(dǎo)致其死亡，暫未見類似報道。但因本研究觀察時間欠缺，藥物濃度單一，下一步有待進(jìn)一步延長實驗時間、增加激素劑量梯度進(jìn)一步觀察，從而為進(jìn)一步的機制研究奠定基礎(chǔ)。

性激素對宮頸腺癌的影響相關(guān)因素較多，包括激素濃度、作用時間，給藥方法等，但隨著人們的不斷探索，相信未來能對其作用機制有進(jìn)一步的了解。