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    牦牛VGLL2基因多態(tài)性與體尺性狀的關(guān)聯(lián)性分析

    2019-11-14 08:53:14楊玉梅柴志欣信金偉王吉坤張成福鐘金城姬秋梅
    西南農(nóng)業(yè)學(xué)報 2019年10期
    關(guān)鍵詞:牦牛基因型性狀

    楊玉梅,柴志欣,信金偉,王 會,王吉坤,張成福,鐘金城*,姬秋梅*

    (1.西南民族大學(xué) 青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室,四川 成都 610041;2. 省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室,西藏 拉薩 850009)

    【研究意義】牦牛(Bosgrunniens)是生活在高寒缺氧等極端環(huán)境的特有牛種,以食草為生,生性強悍,為青藏高原牧民提供主要的生產(chǎn)和生活資料,是高原草地畜牧業(yè)不可替代的重要畜種[1]。牦牛是一個全能型的優(yōu)質(zhì)資源,其生長性狀是選育工作的重要參考,由于粗放式養(yǎng)殖和不健全的良種體系影響牦牛群體的生產(chǎn)力,具體變現(xiàn)為體格小、體重下降和繁殖率降低等生產(chǎn)性能“退化”癥候,嚴(yán)重限制牦牛業(yè)快速、高效的發(fā)展[2]。因此,提高牦牛生產(chǎn)水平成為了育種工作的重中之重?!厩叭搜芯窟M展】殘跡(Vestigial)基因在果蠅中與TEAD(TEA domain)/轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TEF(transcription enhancer factor)相互作用,在果蠅的翅膀和飛行肌肉分化與發(fā)育過程中起重要作用[3-6],其家族包含4個成員(VGLL1-VGLL4)。哺乳動物VGLL1-4蛋白含有TEF-1相互作用結(jié)構(gòu)域稱為TDU結(jié)構(gòu)域(Tondu domain),并有助與TEAD的組織特異性功能因子結(jié)合[7-8]。其中殘跡相似基因2(Vestigial like family member2,VGLL2/VITO-1)從小鼠肌肉特異表達(dá)基因芯片中篩選出來的,該基因編碼具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1(TEF-1)相互作用結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),編碼的蛋白質(zhì)可以在骨骼肌發(fā)育期間充當(dāng)TEF-1調(diào)節(jié)基因表達(dá)的輔因子,已研究發(fā)現(xiàn)編碼多種同種型的剪接轉(zhuǎn)錄物變體[9]。VGLL2在小鼠發(fā)育過程的體節(jié)肌節(jié)和咽囊中表達(dá),而在成人的骨骼肌中選擇性表達(dá)[10-11]。研究表明,對小鼠進行過表達(dá)研究,過表達(dá)VGLL2增強10T1/2細(xì)胞MyoD介導(dǎo)的肌源性轉(zhuǎn)換[12]。此外,TEAD1的骨骼肌特異性過表達(dá)可誘導(dǎo)成年小鼠快速-慢速纖維型轉(zhuǎn)變[13]。使用反義嗎啉代的敲低研究表明,抑制VGLL2表達(dá)會減弱C2C12成肌細(xì)胞和禽肢肌肉中的MyHC表達(dá)[14]。因此,以上研究均顯示VGLL2可在體外作用于肌肉分化。VGLL2缺陷小鼠在基礎(chǔ)條件下表現(xiàn)出更快的肌肉收縮表型,并且Myh7/miR-208b及其下游轉(zhuǎn)錄抑制蛋白的下游靶標(biāo)在新生兒骨骼肌中表現(xiàn)出緩慢抽搐纖維的顯著表達(dá)變化[15]。VGLL2在正常骨骼肌纖維分布中具有很強的活性,在體內(nèi)直接和間接發(fā)揮作用?!颈狙芯壳腥朦c】鑒于VGLL2基因?qū)俟趋兰》只瘏f(xié)同轉(zhuǎn)錄因子,可作用于生肌細(xì)胞分化,VGLL2基因在骨骼肌中可特異性表達(dá),推測其可能直接或間接影響畜禽的生長發(fā)育。迄今為止,關(guān)于VGLL2基因的作用機制在人、小鼠、斑馬魚等物種進行了較為深入的研究,但尚未有牦牛的相關(guān)研究報道?!緮M解決的關(guān)鍵問題】因此,本研究以VGLL2基因為目標(biāo)基因,分析標(biāo)記位點對牦牛生長性狀的影響,以期為牦牛分子育種提供新的理論方法和技術(shù)途徑。

    1 材料與方法

    1.1 試驗動物

    隨機選取西藏申扎牦牛(53)、帕里牦牛(19)、類烏齊牦牛(44)、斯布牦牛(28)和四川麥洼牦牛(94)健康成年個體,剪取耳組織,置于75 %乙醇帶回實驗室,-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩T跇悠凡杉^程中,同時測定牦牛生長性狀(包括體重、體高、體斜長、胸圍和管圍)。

    1.2 基因組DNA提取和DNA混合池構(gòu)建

    采用動物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取基因組DNA,用1 %瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別檢測DNA的純度和濃度,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    分別從5個不同牦牛群體中隨機抽取10份DNA模板,利用分光光度計法分3次測定DNA樣品濃度(上、中、下層),取其平均值,再分別稀釋至50 ng/μl。每個樣品取1 μl混勻構(gòu)建DNA池,于4 ℃環(huán)境下靜置24~48 h。

    1.3 引物設(shè)計與PCR擴增

    根據(jù)牛VGLL2基因序列(NC_037336.1)設(shè)計引物,分別針對3個外顯子序列利用 Primer 5.0設(shè)計3對引物(表 1),引物送英維捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成。

    引物VGLL2-1和VGLL2-2PCR反應(yīng)體系(25 μl),其中上、下游引物各1 μl、DNA模板1 μl,ddH2O 9.5 μl,Premix ExTaq預(yù)混酶12.5 μl。引物VGLL2-3PCR反應(yīng)體系為25 μl,上、下游引物各1 μl、DNA模板1 μl、金牌MIX 22 μl。

    其中引物VGLL2-2和VGLL2-3PCR擴增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s、退火30 s(各引物退火溫度見表1)、72 ℃延伸45 s,共35個循環(huán),72 ℃延伸8 min,4 ℃保存;VGLL2-1PCR擴增程序:98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s、退火30 s(引物退火溫度見表1)、72 ℃延伸10 s,共30個循環(huán),72 ℃延伸2 min,4 ℃保存;1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    表1 牦牛VGLL2基因的引物序列

    1.4 基因SNP位點的篩查與檢測

    通過構(gòu)建好的DNA池擴增牦牛VGLL2基因,PCR擴增產(chǎn)物送生物技術(shù)擎科有限公司進行正反雙向測序,運用DNAMAN 5.0將測序結(jié)果與NCBI上參考目的片段序列進行比對并校正拼接;使用Chromas軟件篩選雙峰位點(突變位點)。對于篩選到的SNPs位點利用PCR擴增產(chǎn)物直接測序法對各類群牦牛共238個個體進行分型,判定基因型。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCR擴增產(chǎn)物

    用DNA池對所設(shè)計引物進行PCR擴增(圖1)。由圖1可知,PCR擴增產(chǎn)物均為單一特異性條帶,與預(yù)期大小基本一致,確定為目的基因。用BioEdit 7.0.5生物軟件查找雙峰位點,預(yù)測多態(tài)位點,結(jié)果見圖2。

    2.2 VGLL2基因測序結(jié)果

    對上述3對擴增產(chǎn)物進行測序,結(jié)果顯示,在VGLL2-2引物的PCR擴增片段上發(fā)現(xiàn)存在4個突變位點(圖2),一處位于外顯子G5000A,剩余3處位于內(nèi)含子(C4868T、C4872G和G4889A)。

    2.3 VGLL2基因SNPs的篩查和檢測

    3個SNPs位點擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明,G5000A位點包括GG、GA、AA 3種基因型,帕里牦牛包括GA和AA 2種基因型,申扎牦牛、麥洼牦牛、斯布牦牛和類烏齊牦牛包含GG、GA、AA 3種基因型;C4868T位點包括CC和CT 2種基因型,在5個群體中擁有CC和CT 2種基因型;C4872G位點包括CC和CT 2種基因型,麥洼牦牛和類烏齊牦牛含有CC和CT 2種基因型,而申扎牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛僅存在CC基因型;G4889A位點包括GG和GA 2種基因型,麥洼牦牛和類烏齊牦牛含有GG和GA 2種基因型,而申扎牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛僅存在GG基因型。因C4872G和G4889A位點的GC型和GA型僅在麥洼牦牛和類烏齊牦牛中發(fā)現(xiàn)。

    M: DAN Marker D2000, 1、2、3:第一、二、三外顯子的PCR擴增產(chǎn)物M: DNA Marker, 1,2,3: PCR products of first, second and third exons圖1 牦牛VGLL2基因的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophpresis of PCR amplified VGLL2 gene in yak

    2.4 牦牛VGLL2基因的遺傳多樣性

    2.4.1 基因型頻率、基因頻率及χ2適合性檢驗 由表2可知,在C4868T位點中,CC基因型在申扎牦牛、麥洼牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛和類烏齊牦牛中的分布頻率分別為0.9623、0.7872、0.8214、0.9474和0.7727,為優(yōu)勢基因型。C4872G位點中,GG基因型在麥洼牦牛和類烏齊牦牛群體中為優(yōu)勢基因型。G4889A位點中為優(yōu)勢基因型。G5000A位點中,GA基因型在申扎牦牛、麥洼牦牛和類烏齊牦牛群體中為優(yōu)勢基因型;AA基因型在麥洼牦牛和斯布牦牛群體中為優(yōu)勢基因型。C4868T位點中,等位基因C基因頻率在5個群體中分別為0.9811、0.8936、0.9107、0.9737和0.8864,為優(yōu)勢等位基因。C4872G位點中,等位基因G在2個群體中分別為優(yōu)勢等位基因。G4889A位點中,等位基因G在5個群體中為優(yōu)勢等位基因。G5000A位點中,等位基因A在5個群體中為優(yōu)勢等位基因。

    圖2 牦牛VGLL2基因DNA池部分測序Fig.2 The results of sequencing of VGLL2 fragment in yak

    圖3 牦牛VGLL2基因4個SNP位點測序Fig.3 Sequencing of 4 SNP sites in VGLL2 fragment of yak

    對牦牛VGLL2基因4個SNP位點進行卡方適應(yīng)性檢驗(表3),位點C4868T、C4872G、G4889A和G5000Aχ2值均未達(dá)到顯著水平(P>0.05),符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

    表2 5個牦牛類群基因4個SNP位點等位基因及基因型頻率

    續(xù)表2 Continued table 2

    位點Loci牦牛類群Yak group數(shù)量Quantity基因型頻率Genotypic frequency等位基因頻率Allele frequencyCCCTTTCTC4872G麥洼牦牛940.9149(86)0.0851(8)00.95740.0426類烏齊牦牛440.9545(42)0.0455(2)00.97730.0227GGGAAAGAG4889A麥洼牦牛940.9255(87)0.0745(7)00.96280.0372類烏齊牦牛440.9545(42)0.0455(2)00.97730.0227GGGAAAGAG5000A申扎牦牛530.1889(10)0.4151(22)0.3962(21)0.39620.6038麥洼牦牛940.2234(21)0.4362(41)0.3404(32)0.44150.5585斯布牦牛280.0714(2)0.3571(10)0.5714(16)0.250.75帕里牦牛1900.4211(8)0.5789(11)0.21050.7895類烏齊牦牛440.0227(1)0.5227(23)0.4545(20)0.28410.7159

    表3 5個牦牛類群VGLL2基因4個SNP位點的Hardy-Weinberg平衡的χ2檢驗

    2.4.2 群體遺傳多態(tài)性 運用PIC_CALC軟件計算多態(tài)信息含量,位點C4868T、C4872G和G4889A在群體中的PIC含量均低于0.25,屬于低度多態(tài);位點G5000A在群體中的PIC含量均大于0.25低于0.5,屬于中度多態(tài)(表4),可見不同群體的多態(tài)性程度差異較大,其中麥洼牦牛多態(tài)性含量最高,為0.3716,帕里牦牛的最低,為0.2771。

    2.4.3VGLL2基因多態(tài)性與牦牛生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析 運用SPSS16.0分析軟件中的單因素分析,對238頭牦牛個體VGLL2基因的2個SNP位點C4868T和G5000A不同基因型與體高、體斜長、胸圍、管圍和體重等生長性狀進行相關(guān)性分析(表5)。結(jié)果表明,位點C4868T與體高、體斜長、胸圍和體重均具有差異顯著性(P<0.05)。CC基因型個體體高、體斜長、胸圍和體質(zhì)量顯著高于GC基因型。位點G5000A除管圍外其他生長性狀基本遵循GA基因型個體均值略高于AA和GG基因型個體均值的趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。對138頭類烏齊牦牛和麥洼牦牛個體VGLL2基因的2個SNP位點(C4872G,G4889A)不同基因型與體高、體斜長、胸圍、管圍和體重等生長性狀進行相關(guān)性分析(表5),C4872G、G4889A位點兩種基因型在體高、體斜長、胸圍、管圍和體重等生長性狀上無顯著差異(P>0.05)。

    表4 5個牦牛類群VGLL2基因4個SNP位點的遺傳多態(tài)性指標(biāo)

    表5 牦牛VGLL2基因位點不同基因型與生長性狀關(guān)聯(lián)性分析

    注:同列不同字母表示差異顯著(P<0.05),同列相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

    Note: Different letters in the same column indicate significant difference (P<0.05), and the same letter in the same column indicates that the difference is not significant (P>0.05).

    3 討 論

    VGLL2基因與新生兒肌肉中的TEAD1/4形成復(fù)合物,在骨骼肌中發(fā)揮協(xié)同作用。TEAD1的過表達(dá)誘導(dǎo)朝向慢肌收縮表型和衛(wèi)星細(xì)胞增生的過渡[16-17]。VGLL2有助于肌肉特異性基因的TEAD依賴性調(diào)節(jié),特別是在慢肌纖維中,以上研究表明,VGLL2基因可能對生長性狀有所影響。

    目前,對VGLL2基因的研究主要集中在對人的橫紋肌肉瘤的研究[18]及對雞胚胎骨骼肌形成的研究[19],且在其他物種上的研究多集中在調(diào)控機理上,而進行多態(tài)性研究較少,故可用于該基因多態(tài)性研究方面可供參考的文獻(xiàn)較少。目前,對牦牛VGLL2基因多態(tài)性及性狀相關(guān)性的研究尚未有報道。本試驗通過DNA混合池測序和直接測序法分析了牦牛VGLL2基因的3個外顯子的遺傳多樣性及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)性,結(jié)果顯示第一外顯子和第三外顯子高度保守未發(fā)現(xiàn)突變,在第二外顯子上存在1個SNP位點G5000A和第二內(nèi)含子上有3個SNP位點(C4868T,C4872G,G4889A),內(nèi)含子雖為基因中無編碼功能的序列,但其對基因表達(dá)調(diào)控起著重要作用[20],研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)含子突變夠能影響附近的剪切供體和調(diào)節(jié)原件,進而導(dǎo)致基因編碼蛋白發(fā)生改變[21]。許多研究證實了這一結(jié)論,牦牛PPARδ基因第3內(nèi)含子g.10045A/G和g.10226A/G變異與體重顯著相關(guān)[22],牦牛TMEM-18第一內(nèi)含子861(A/C)和1267(C/T)變異與體重顯著相關(guān)[23]??梢奡NP位點(C4868T,C4872G,G4889A)變異可能不同程度影響VGLL2蛋白的活性,進而影響其有關(guān)的生長發(fā)育性狀。

    Hardy-Weinberg平衡說明,4個SNP位點P值均大于0.05,處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài),說明4個SNP位點受選擇、基因突變等影響較小,可能是人工選育、遷徙和遺傳漂變下處于動態(tài)平衡中,且對這些位點可以加強選擇力度。在遺傳多態(tài)性分析中,多態(tài)信息含量(PIC)、純合度(Ho)、雜合度(He)和有效等位基因(Ne)等指標(biāo)從不同方向證實了群體的遺傳變異水平。群體的雜合度一般認(rèn)為與遺傳多樣性密切相關(guān),群體雜合度越高,說明群體的遺傳變異較大,遺傳多樣性較豐富[24]。群體的雜合度一般認(rèn)為與遺傳多樣性密切相關(guān),群體雜合度越高,說明群體的遺傳變異較大,遺傳多樣性較豐富[25]。多態(tài)信息含量數(shù)據(jù)顯示,位點C4868T、C4872G和G4889A在群體中屬于低度多態(tài),低度多態(tài)可能是遺傳分化程度較低,缺乏與其他種群的基因交流,可能在該位點的遺傳變異程度較小,突變少,使得基因的純合型得以積累;位點G5000A在群體中屬于中度多態(tài),中度多態(tài)可能是遺傳分化程度較高,與其他種群的基因交流較豐富,可能在該位點的遺傳變異程度較大,突變大。數(shù)據(jù)顯示C4868T、C4872G、G4889A僅發(fā)現(xiàn)2個基因型,分別缺失TT、CC和AA基因型,這可能是遺傳漂變所致,由于該純合基因型為致死基因,在長期的選擇中被淘汰或者是因試驗樣本數(shù)較少,后期可較大樣本量進行進一步驗證。

    本研究通過對牦牛VGLL2基因4個多態(tài)位點與生長性狀進行相關(guān)性分析,結(jié)果表明,牦牛VGLL2基因C4868T位點處的不同基因型與牦牛體高、體斜長、胸圍和體重顯著相關(guān),表現(xiàn)為CC基因型個體體高、體斜長、胸圍和體質(zhì)量顯著高于GC基因型(P<0.05)。其余3個位點的不同基因型與牦牛體高、體斜長、胸圍、管圍和體重差異不顯著(P>0.05)。因此推斷VGLL2基因上的C4868T位點可能影響牦牛的體高、體斜長、胸圍和體重,可作為與牦牛生產(chǎn)性狀相關(guān)的候選分子標(biāo)記,為今后的牦牛選育提供理論依據(jù)。

    4 結(jié) 論

    牦牛VGLL2基因的C4868T位點與牦牛的體高、體斜長、胸圍和體重顯著相關(guān),可作為牦牛生產(chǎn)性狀分子標(biāo)記輔助育種的候選位點,可對后續(xù)牦牛的體高、體斜長、胸圍和體重性狀的選擇提供理論依據(jù)。

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