祛瘀生新膠囊藥效學(xué)及急性毒性實(shí)驗(yàn)研究*

穆慶麗，喬 園，郭 冬

（陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

祛瘀生新膠囊為治療缺血性股骨頭壞死的經(jīng)驗(yàn)方，具有通絡(luò)止痛、消腫散結(jié)、溫通經(jīng)脈等功效，臨床應(yīng)用多年，療效確切，不良反應(yīng)較少。其由黃芪、桂枝、三棱、莪術(shù)、土貝母、制馬錢子等水煎、提?。?次）、濃縮至所需質(zhì)量濃度（1 mL藥液中含1 g生藥）而成。本研究中考察了其藥效作用與急性毒性情況。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：KM 小鼠 184 只，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（陜）2007-001。小鼠飼養(yǎng)于恒溫（22～25℃）、恒濕、屏障環(huán)境中，自由飲水。

儀器：BS210S型電子天平（北京賽多利斯天平廠）；721型分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；ZH-ZZY型足趾容積測(cè)量?jī)x（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）

試藥：祛瘀生新膠囊（陜西省中醫(yī)藥研究院研制，批號(hào)為20110801）；吲哚美辛片（臨汾奇林藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H14020549，批號(hào)為20110702，規(guī)格為每片25 mg）；阿司匹林腸溶片（陜西白鹿制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H61023177，批號(hào)為 111201，規(guī)格為每片25mg）；角叉菜膠（遼寧省藥物研究所，批號(hào)為20110822）；冰醋酸為分析純，水為去離子水。

1.2 方法[1-3]

急性毒性預(yù)試驗(yàn)：取KM小鼠24只，分為6組（每組4只，雌、雄各半）進(jìn)行2次實(shí)驗(yàn)，得到動(dòng)物0死亡劑量（Dn）為 25.648g／kg，100% 死亡劑量（Dm）為 57.803g／kg，分別作為上下限。以預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得的Dm作為正式實(shí)驗(yàn)中的高劑量，求得比值為0.85，等比求得其他各劑量。

急性毒性試驗(yàn)：取KM小鼠60只，均編號(hào)標(biāo)記并稱定質(zhì)量，隨機(jī)分為6組（記為A～F組），每組10只，雌雄各半，劑量分別為 57.803，49.133，41.763，35.499，30.174，25.648 g ／kg，給藥前禁食不禁飲 12 h。24 h 內(nèi)灌胃3次，給藥間隔時(shí)間4 h，給藥體積每10 g體質(zhì)量0.4 mL。用藥后連續(xù)觀察30 min，最初6 h內(nèi)每1 h觀察1次，之后每天觀察2次，持續(xù)2周，觀察小鼠的一般活動(dòng)情況及存活情況（見(jiàn)表1），并記錄小鼠行為活動(dòng)、狀態(tài)、飲食、大小便及毛色、分泌物和死亡數(shù)目、死亡時(shí)間及主要毒性反應(yīng)。對(duì)觀察期內(nèi)死亡小鼠進(jìn)行解剖學(xué)檢查，并記錄病理變化。

表1 急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察內(nèi)容

小鼠半數(shù)致死量測(cè)定：按Bliss′s法[4-5]統(tǒng)計(jì)各組死亡數(shù)，計(jì)算死亡率及半數(shù)致死量（LD50）、95%置信區(qū)間（CI）。

角叉菜膠致小鼠足趾腫脹試驗(yàn)[6-8]：取KM小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。模型組小鼠灌胃去離子水20 mL／kg，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠自實(shí)驗(yàn)第3天開(kāi)始灌胃阿司匹林0.2 g／kg，共3次；祛瘀生新膠囊高、中、低劑量組小鼠分別灌胃 1.2，0.6，0.3 g ／kg（分別為人用量的 30，15，7.5 倍）；每天 1 次，連續(xù) 4 d。第 5 天給予角叉菜膠前先測(cè)所有小鼠左后足跖圍（用手術(shù)線在左后足跖同一部位纏繞2周，剪下，量手術(shù)線的長(zhǎng)度作為足跖圍）。末次給藥的同時(shí)，所有小鼠左后足皮下注射1%角叉菜膠0.05 mL，然后每隔1 h測(cè)左后足跖圍1次，共測(cè)4次，作為腫脹值，腫脹值減去致炎前足跖圍即為腫脹度。

冰醋酸致小鼠疼痛試驗(yàn)[2，9]：取KM小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。模型組小鼠灌胃去離子水20 mL／kg，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠在實(shí)驗(yàn)第5天灌胃吲哚美辛腸溶片1次（15 mg／kg），祛瘀生新膠囊高、中、低劑量組小鼠分別灌胃 1.2，0.6，0.3 g ／kg；連續(xù) 5 d，末次給藥后30 min，腹腔注射 0.8%冰醋酸0.2 mL，5 min后，統(tǒng)計(jì)小鼠在10 min內(nèi)的扭體次數(shù)（腹部收縮內(nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行），計(jì)算扭體反應(yīng)抑制率[抑制率（%）=（模型組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù)）／模型組平均扭體次數(shù)×100%]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以表示，組間數(shù)據(jù)行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般生長(zhǎng)狀況

給藥后，部分小鼠初始自發(fā)活動(dòng)減少、倦臥不動(dòng)、嗜睡、瞇眼，繼而動(dòng)物出現(xiàn)震顫、抽搐、麻痹、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、躥動(dòng)、全身肌肉強(qiáng)直性痙攣，直至死亡（死亡癥狀為角弓反張）。第1次給藥后20 min，A組小鼠開(kāi)始死亡，死亡時(shí)間多集中在第1次和第2次給藥后1 h，B組小鼠的死亡時(shí)間多集中在第2次和第3次給藥后1 h，C組和D組小鼠的死亡時(shí)間多集中在第3次給藥后1 h到次日早晨。在 57.803 g／kg，49.133 g／kg 劑量下，存活小鼠大多數(shù)開(kāi)始出現(xiàn)自發(fā)活動(dòng)減少、倦臥不動(dòng)、嗜睡、瞇眼，繼而出現(xiàn)震顫、抽搐、麻痹、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、躥動(dòng)、全身肌肉強(qiáng)直性痙攣等臨床表現(xiàn)，對(duì)死亡小鼠進(jìn)行解剖，肉眼可見(jiàn)其胃充盈，腸管脹氣，余未見(jiàn)異常。最終存活小鼠給藥14 d后逐只處死、解剖，并肉眼觀察，心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃、腸等重要臟器、器官及胸腔、腹腔未見(jiàn)顏色、形態(tài)異常，無(wú)出血點(diǎn)或其他病理改變，胃黏膜顏色紅潤(rùn)，無(wú)出血點(diǎn)或潰瘍，尸檢無(wú)異常。

2.2 半數(shù)致死量

灌胃給予 57.803，49.133，41.763，35.499，30.174，25.648 g／kg祛瘀生新膠囊后，各組小鼠死亡數(shù)分別為10，9，7，3，1，0 只。回歸方程式：P（Probit）=-16.42368+13.512 22 × log（D），r=0.994 185，LD50=38.503 8 ±3.124，95%CI（35.651 3，41.584 6）。

2.3 對(duì)小鼠足趾腫脹的影響

結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 祛瘀生新膠囊對(duì)角叉菜膠所致小鼠足趾腫脹度的影響（X ± s，n=10）

2.4 對(duì)小鼠疼痛的影響

結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 祛瘀生新膠囊對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響（n=10）

3 討論

祛瘀生新膠囊根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)方加工制成，臨床主要用于治療風(fēng)、寒、濕、邪等多種原因引起的髖部疼痛、腫脹、屈伸活動(dòng)受限、行走困難功能障礙性疾病[10]。方中制馬錢子的主要成分為士的寧，可通絡(luò)止痛、消腫散結(jié)[11]；桂枝發(fā)汗解肌、溫通經(jīng)脈，可促發(fā)汗、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗過(guò)敏[12]；三棱行氣破血，消積止痛[13]；黃芪補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌[14-15]。全方共奏通絡(luò)止痛、消腫散結(jié)、溫通經(jīng)脈之功效。

毒理學(xué)研究是藥物研究的中心環(huán)節(jié)，是評(píng)價(jià)藥物安全的重要指標(biāo)，本試驗(yàn)中通過(guò)小鼠灌胃最大給藥量的急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察祛瘀生新膠囊的用藥安全性。結(jié)果該藥的Dn和Dm分別為 25.648 g／kg和 57.803 g／kg。角叉菜膠致小鼠足腫脹法和冰醋酸致疼痛法是常用于評(píng)價(jià)或篩選抗炎作用藥物的經(jīng)典模型，其作用機(jī)制主要是通過(guò)注射角叉菜膠使局部毛細(xì)血管擴(kuò)張、血管通透性增高、滲出、水腫產(chǎn)生炎癥。1.2g／kg（2 ～3h），0.6g／kg（2 ～3h），0.3 g／kg（2 h）劑量的祛瘀生新膠囊可明顯降低模型小鼠足跖的腫脹度，給藥 1.2 g／kg和 0.6 g／kg 可明顯減少模型小鼠扭體次數(shù)，說(shuō)明該藥有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用，但對(duì)其深入的藥效學(xué)研究，長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)及其抗炎鎮(zhèn)痛機(jī)制有待進(jìn)一步研究。