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    LC-Q-TOF-MS高分辨質(zhì)譜法測定保健食品中24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物

    2019-11-13 01:25:24王志元陳文銳謝建軍曾廣豐
    中國食品學(xué)報 2019年10期
    關(guān)鍵詞:凈化劑安神保健食品

    丁 博 王志元 陳文銳 謝建軍 曾廣豐

    (1 廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 廣州 511436

    2 廣州海關(guān)技術(shù)中心 廣州 510623)

    隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們健康意識的提高,食用保健食品來調(diào)節(jié)和改善人體功能成為更多人的選擇,保健食品行業(yè)也隨之迅速發(fā)展起來。截至2017年,我國批準(zhǔn)的保健食品共16 632種,其中國產(chǎn)保健食品15 880種,進(jìn)口保健食品752種[1]。2014年國內(nèi)保健品銷售總額已達(dá)到1 858億元,預(yù)計到2020年醫(yī)藥大健行業(yè)更會達(dá)到驚人的8萬億元,中國保健食品行業(yè)呈現(xiàn)高速發(fā)展的趨勢[2]。作為最具有投資價值的行業(yè)之一,保健品行業(yè)的監(jiān)管體系仍未完善,企業(yè)素質(zhì)參差不齊,保健食品檢出違禁藥物的事件屢有報道[3-4]。保健食品不以預(yù)防、治療疾病為目的。在各種保健食品中,調(diào)節(jié)血糖類、減肥類、抗疲勞類、增強免疫力類、改善睡眠類、降血壓類等功能保健食品的非法藥物添加問題比較嚴(yán)重。目前保健食品中非法添加藥品的總體狀況有以下4個特點[5]:(1)添加物來源不明;(2)非法添加藥物劑量隨意;(3)非法添加藥物的兼容性不明確;(4)藥物復(fù)合添加。2008年,南京市食品藥品監(jiān)督局曝光119種壯陽類的保健品違法添加西地那非類藥物[6]。2015年11月國家食品藥品監(jiān)督管理總局在市場上查獲31種假冒并涉嫌違法添加藥物成分的保健食品,其中檢出二甲雙胍、苯乙雙胍、格列苯脲、羅格列酮、西布曲明、西地那非、酚酞等違禁藥物[5]。國家食品藥品監(jiān)督管理局在2012年發(fā)布了《關(guān)于發(fā)布保健食品中可能非法添加的物質(zhì)名單(第一批)的通知》[7],列出了6類保健品中可能添加的47種違禁藥物,然而這遠(yuǎn)不能涵蓋所有可能的非法添加物質(zhì)。由此可見,迫切需要建立保健食品中高通量違禁藥物篩查檢測方法。

    QuEChERS最早由Anastassiades等[8]報道用來檢測蔬菜與水果中農(nóng)藥殘留,作為一種快速高效地前處理技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品農(nóng)藥殘留檢測分析領(lǐng)域[9-11]。近年來,文獻(xiàn)報道采用QuEChERS技術(shù)提取分離大豆中異黃酮類化合物[12-13],以及保健食品中違禁藥物的檢測[14-15]。文獻(xiàn)報道一些抗風(fēng)濕、哮喘及解熱鎮(zhèn)痛類中成藥物中非法添加抗炎、鎮(zhèn)靜安神類西藥成分[16-17]。由此推測,聲稱提高免疫力功能的保健食品可能非法添加此類藥物成分。本文研究對比分析溶劑提取法與QuEChERS前處理法提取保健食品中違禁藥物成分,依據(jù)IDA-MS技術(shù)獲得目標(biāo)物的高分辨質(zhì)譜信息,建立LC-Q-TOF-MS高分辨質(zhì)譜法檢測保健食品中抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    氯化鈉、無水硫酸鎂(AR),廣州化學(xué)試劑廠;甲醇、乙腈(HPLC純),美國賽默飛世爾科技ThermoFisher Scientific公司;試驗所用水由德國默克公司的Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)提供。標(biāo)準(zhǔn)品:醋酸可的松(Hydrocortisone acetate)、醋酸氫化可的松(Cortisone acetate)、醋酸潑尼松(Prednisone 21-acetate)、醋酸氫化潑尼松(Prednisolone acetate)、甲潑尼龍(Methylprednisolone)、氯氟美松(Clobetasol propionate)、曲安奈德(Triamcinolone acetonide)、醋酸氟輕松(Fluocinonide)、甲氧芐啶(Trimethoprim)、新諾明(Sulfamethoxazole)、安替比林(Antipyrine)、酮洛芬(Ketoprofen)、萘普生(Naproxen)、吲哚美辛(Indometacin)、哌唑嗪(Prazosin)、吡羅昔康(Piroxicam)、瑞格列奈(Repaglinide)、地塞米松(Dexamethasone)、阿普唑侖(Alprazolam)、氯硝西泮(Clonazepam)、地西泮(Diazepam)、勞拉西泮(Lorazepam)、硝西泮(Nitrazepam)、奧沙西泮(Oxazepam),德國Dr Ehrestorfor公司,純度大于98%。16個食品樣品購買于廣州某超市。

    1.2 儀器與設(shè)備

    TripleTOFTM5600高分辨質(zhì)譜儀,美國AB SCIEX公司;島津LC-20AD液相色譜系統(tǒng),日本島津公司;Sartorius BT223S電子天平、Sartorius CPA225D 電子天平,德國Sartorius公司;Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng),法國Merck Millipore公司;Sonoswiss SW30H超聲波清洗機、Transferpette 單道數(shù)字可調(diào)移液器(20~200 μL,200~1000 μL),德國 Brand公司。

    1.3 分析方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精確稱量5.00~10.00 mg抗炎鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜安神類標(biāo)準(zhǔn)品,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解定容,得到單一標(biāo)準(zhǔn)母液。再根據(jù)計算結(jié)果,各取一定量母液至一個10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度線,搖勻。得到25 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,甲醇稀釋 10,25,50,100,200 μg/L和400 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

    1.3.2 儀器分析條件 色譜柱:XBridge BEH C18 XP 色譜柱(2.5 μm,4.6 mm×100 mm),流動相:A-0.1%甲酸,B-乙腈,梯度洗脫,初始 30%B,3 min升至40%,4 min升至70%,8 min升至80%,9 min升至100%,11 min保持100%,11.5 min降至30%,保持至13 min結(jié)束;流速0.5 mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量 1 μL。

    質(zhì)譜條件:離子源:ESI和APCI復(fù)合源;掃描方式:正離子;APCI源:連接ABsciex公司自動校正系統(tǒng)(CDS),每15個樣品自動校正1次,校正液流速0.35 mL/min;氣簾氣:40 psi,霧化氣:50 psi,輔助氣:50 psi;離子源溫度:500 ℃;離子源電壓:5 500 V;一級TOF-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍:100~1 000 u;數(shù)據(jù)采集時間:100 ms;DP:100 V;CE:10 V;二級IDA-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍:50~1 000 u;DP:100 V;CE:(35±15)V;高靈敏模式;數(shù)據(jù)采集時間:50 ms;信號閾值:100 cps;IDA 實驗每循環(huán)采集6次數(shù)據(jù),動態(tài)背景減法扣除。

    所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)由ABSciex公司的Analyst TF 1.6軟件采集,數(shù)據(jù)在PeakView 2.0和MultiQuant 3.0軟件上進(jìn)行分析。使用峰面積進(jìn)行定量。

    1.3.3 樣品前處理 QuEChERS法:片劑、沖劑、丸劑粉碎后混勻,膠囊剪開取內(nèi)容物,稱取0.500 g于50 mL聚丙烯離心管中,與0.25 g氯化鈉和1 g硫酸鎂混合,再加入凈化劑,然后加入15 mL 70%乙腈水溶液,搖勻,超聲處理15 min后以10 000 r/min,5 min離心,將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL具塞刻度試管,用70%乙腈定容至刻度線,搖勻,取約1 mL過0.22 μm有機濾膜待測。本試驗選取空白(不加凈化劑)、50 mg C18、50 mg GCB、25 mg C18+25 mg GCB作為凈化劑,探究凈化劑對提取率的影響。

    溶劑提取法:沖劑、丸劑粉碎后混勻,膠囊剪開取內(nèi)容物,稱取0.500 g樣品于50 mL聚丙烯離心管中,分別加入15 mL提取溶劑,超聲處理15 min。10 000 r/min,5 min離心后將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL具塞刻度試管,用相應(yīng)提取溶劑定容至刻度線,搖勻。取定容后的溶液約1 mL過0.22 μm有機濾膜待測。本試驗選取80%甲醇-水溶液、50 mmol/L甲酸-80%甲醇-水溶液、80%乙腈-水溶液、50 mmol/L甲酸-80%乙腈-水溶液為提取溶劑,探究不同提取溶劑對目標(biāo)物提取的影響。

    表1 定性定量分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table1 Mass fragmentation patterns of anti-inflammatory and sedative drugs

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高分辨質(zhì)譜定性定量分析依據(jù)

    利用IDA-MS高分辨質(zhì)譜技術(shù)檢測分析保健食品樣品中非法添加24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物,目標(biāo)違禁藥物一級母離子的精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比、二級碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)和理論質(zhì)量與測得質(zhì)量誤差等信息見表1。

    2.2 超聲輔助溶劑提取

    參考研究報道利用甲醇、乙腈、酸化甲醇和酸化乙腈等溶劑提取復(fù)雜食品樣品基質(zhì)中目標(biāo)分析物[18],本試驗選擇80%甲醇、80%甲醇與50 mmol/L甲酸、80%乙腈和80%乙腈與50 mmol/L甲酸4種溶劑提取保健食品中24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物成分,選擇固體藥片和魚油膠囊兩種樣品作為基質(zhì)考察對象(圖1),違禁藥物加標(biāo)質(zhì)量濃度是 50 μg/L。

    由圖1a可知,4種溶劑對固體藥片基質(zhì)樣品中違禁藥物提取回收率差異不顯著,除了哌唑嗪之外,其它23種違禁藥物回收率均在80%以上。圖1b顯示4種溶劑提取方式對油狀膠囊樣品基質(zhì)中違禁藥物提取回收率差異顯著,80%乙腈與50 mmol/L甲酸溶劑提取回收率明顯高于其它3種溶劑,另外,油膠囊樣品基質(zhì)中哌唑嗪提取回收率也低于80%。結(jié)合兩種樣品基質(zhì)回收率考察結(jié)果,試驗選擇80%乙腈與50 mmol/L甲酸溶劑提取保健食品中24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物,并與QuEChERS前處理方法進(jìn)行對比試驗。

    圖1 溶劑萃取不同樣品基質(zhì)中違禁藥物的回收率Fig.1 The recoveries of illicit anti-inflammatory and sedative drugs with solvent extraction in the different matrix samples

    2.3 QuEChERS前處理

    選擇固體藥片和油狀膠囊兩種樣品考察QuEChERS萃取違禁藥物的回收率情況,選擇C18、GCB等不同類型凈化劑,試驗結(jié)果見圖2。在無凈化劑、C18、GCB、GCB 與 C18等條件 QuEChERS前處理法提取固體藥片基質(zhì)保健食品中違禁藥物的回收率差異不顯著,其中甲潑尼龍(Methylprednisolone),氯氟美松(Clobetasol propionate)違禁藥物的回收率較低(圖2a);油狀膠囊基質(zhì)保健食品樣品中違禁藥物在不同凈化劑條件下的回收率較為顯著,其中在C18凈化劑條件下,醋酸氫化可的松(Cortisone acetate),醋酸氫化潑尼松(Prednisolone acetate),甲潑尼龍(Methylprednisolone),氯氟美松(Clobetasol propionate),曲安奈德(Triamcinolone acetonide),醋酸 氟 輕 松(Fluocinonide),甲氧芐啶(Trimethoprim),新諾明(Sulfamethoxazole),安替比林(Antipyrine),酮洛芬(Ketoprofen),吲哚美辛(Indometacin),哌唑嗪(Prazosin),吡羅昔康(Piroxicam),瑞格列奈(Repaglinide),阿普唑侖(Alprazolam),氯硝西泮(Clonazepam),地西泮(Diazepam),勞拉西泮(Lorazepam),硝西泮(Nitrazepam),奧沙西泮(Ox-azepam)等違禁藥物的回收率較好(圖2b)。為此,試驗選擇C18作為QuEChERS前處理方法的凈化劑,并與溶劑超聲輔助提取法比較。

    圖2 QuEChERS前處理法提取違禁藥物的回收率Fig.2 The recoveries of illicit anti-inflammatory and sedative drugs with the QuEChERS pretreatment in the different matrix samples

    試驗選擇80%乙腈與50 mmol/L甲酸溶劑超聲輔助提取法和C18凈化劑QuEChERS前處理方法提取固體藥片基質(zhì)樣品中違禁藥物的回收率情況,試驗結(jié)果見圖3。除了溶劑提取法萃取哌唑嗪低于80%之外,QuEChERS和溶劑提取方法提取違禁藥物回收率均在80%以上,QuEChERS法檢測24種違禁藥物回收率整體高于溶劑提取法,基于加標(biāo)回收率判斷標(biāo)準(zhǔn),QuEChERS法與溶劑提取法萃取保健食品中抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物的回收率滿足檢測分析標(biāo)準(zhǔn)要求。因此,QuECh-ERS和溶劑提取法兩種前處理方法均滿足保健食品中抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物檢測要求,試驗選擇QuEChERS前處理與LC-Q-TOF-MS高分辨質(zhì)譜法檢測保健食品中24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物。

    2.4 方法線性范圍、檢測限與定量限

    LC-Q-TOF-MS高分辨質(zhì)譜法檢測保健食品中24中抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物,根據(jù)目標(biāo)分析物一級TOF-MS母離子精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比、二級碎片離子IDA-MS精準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)及理論質(zhì)量數(shù)與測量質(zhì)量數(shù)誤差等信息,定性定量分析24種違禁藥物。QuEChERS法與溶劑提取法萃取保健食品中抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物的回收率滿足檢測分析標(biāo)準(zhǔn)要求。因此,QuEChERS和溶劑提取法兩種前處理方法均滿足保健食品中對抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物的檢測要求。以3倍信噪比對應(yīng)的濃度和10倍信噪比對應(yīng)的濃度確定24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。目標(biāo)分析物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限見表2。24違禁藥物線性范圍在2個數(shù)量級范圍之內(nèi),相關(guān)系數(shù)在0.9990以上,檢測限在0.3~3 μg/L之間。

    圖3 QuEChERS與溶劑提取法萃取違禁藥物的回收率Fig.3 The recoveries of illicit anti-inflammatory and sedative drugs with the QuEChERS pretreatment and solvent extraction

    表2 線性范圍、檢測限和定量限Table2 Analytical performance data of 24 anti-inflammatory and sedative drugs for linearity of calibration curves,coefficient of determination,LOD and LOQ

    2.5 回收率

    進(jìn)一步考察QuEChERS前處理技術(shù)與LCQ-TOF-MS高分辨質(zhì)譜法測定保健食品中24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物的分析方法可行性與準(zhǔn)確性,試驗選擇某膠囊狀保健食品樣品,做加標(biāo)回收率驗證試驗,在目標(biāo)物分析線性范圍內(nèi),選取50 μg/L和150 μg/L兩個水平加標(biāo)濃度,每個濃度平行做3次,平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。24種違禁藥物50 μg/L加標(biāo)濃度水平的回收率在82.3%~94.4%之間,RSD為1.5%~8.4%,150 μg/L加標(biāo)濃度水平的回收率在81.8%~103%,RSD在0.8%~8.7%之間,試驗結(jié)果顯示QuEChERS前處理技術(shù)與LC-Q-TOF-MS高分辨質(zhì)譜法適合保健食品中違禁藥物的檢測。

    表3 加標(biāo)回收率Table3 The recoveries of 24 anti-inflammatory and sedative drugs

    3 結(jié)論

    建立了同時測定保健食品中24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物的LC-Q-TOF-MS方法,試驗優(yōu)化了QuEChERS與溶劑萃取前處理條件,利用IDA-MS高分辨質(zhì)譜技術(shù)分析目標(biāo)物,有效避免了樣品其它組分的基質(zhì)干擾,前處理方法簡單,檢測時間短,可快速檢測保健食品中違禁藥物成分。

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