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    寵物犬體表真菌病原體初步分離與鑒定

    2019-06-24 09:15:58楊曉偉任宏彬賈曉婷郭素萍
    甘肅畜牧獸醫(yī) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:分生孢子顯微鏡孢子

    楊曉偉,任宏彬,賈曉婷,郭素萍

    (大同海關(guān),山西 大同 037000)

    真菌是自然界廣泛存在的一類微生物,可引起人類和動(dòng)物過敏性疾病和真菌毒素中毒癥,其中寄生在人和動(dòng)物體表,引起真菌性皮膚病[1]。真菌分有性生殖和無性生殖[2]。

    皮膚性真菌主要寄生于人和動(dòng)物表皮角質(zhì)、毛發(fā)、指甲、爪、角質(zhì)蛋白組織中,使局部皮膚產(chǎn)生組織病變[3],甚至感染組織深部,即致病真菌侵犯皮下組織、黏膜和內(nèi)臟,從而引起器官真菌感染[4]。

    犬皮膚真菌病是犬類常見的臨床疾病,其致病菌主要由犬小孢子菌、石膏狀小孢子菌、須毛癬菌組成,其中犬小孢子菌占70%,石膏樣小孢子菌為20%,須毛癬菌為10%[5]。但健康犬在皮膚防御屏障作用下病原菌無法正常生長,只是簡單地粘附于皮膚或被毛之上。若外界環(huán)境發(fā)生改變,如機(jī)體抵抗力、免疫機(jī)能降低、原發(fā)性疾病或犬廝打的傷口使局部皮膚喪失保護(hù),導(dǎo)致病菌侵入表皮造成感染[6]。部分學(xué)者們認(rèn)為淺部真菌的發(fā)病機(jī)制多與菌絲相關(guān)。因?yàn)檎婢茉诿铱谛纬纱罅烤z伸人毛囊,菌絲變態(tài)形成吸器,吸取營養(yǎng)從而大量繁殖,破壞毛囊、毛根及毛球上部的角質(zhì),并在毛內(nèi)或毛周分支分裂形成緊密的孢子或分節(jié)菌絲,引起毛發(fā)病變及皮膚炎癥而產(chǎn)生癥狀[7]。

    隨著社會(huì)的快速發(fā)展,人民生活水平日益提高,寵物(犬、貓)飼養(yǎng)量急劇上升,又因犬皮膚真菌病作為一種常見的人畜共患疾病,關(guān)系到人與動(dòng)物的健康,故而倍受人們關(guān)注和重視。此病主要通過接觸感染,臨床特征主要有脫毛、瘙癢、紅腫及炎癥,易與其他寄生蟲或細(xì)菌混合感染。

    1 材料

    1.1 試驗(yàn)材料及器材

    瓊脂粉(成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn))、葡萄糖(汕頭市西隴化工廠有限公司生產(chǎn))、蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn))、95%酒精、蒸餾水等。

    平皿、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn))、封閉式調(diào)溫電爐(成都川西行科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)[PYX-DHS-40x50-S])、JPT-1型架盤天平(天津市天馬儀器廠生產(chǎn)(00000297號(hào))、Olympus雙目醫(yī)用顯微鏡(Olympus 公司)、烘箱、高壓鍋、玻棒、錐形瓶、棉塞、無菌操作臺(tái)、打孔器、小勺和酒精燈。

    1.2 試驗(yàn)動(dòng)物的選取

    在大同愛佳寵物醫(yī)院選取患真菌病的寵物犬,經(jīng)伍德氏燈檢查確診患有皮膚性真菌感染。用75%酒精對(duì)寵物犬患部進(jìn)行消毒,再用無菌鑷子取少量患部毛發(fā)裝于無菌采樣袋中。

    2 方法

    2.1 臨床癥狀診斷

    患犬常表現(xiàn)為劇癢、脫屑、脫毛和結(jié)痂。毛發(fā)變脆、毛干易斷、毛根易脫,皮膚上可見到紅疹脫毛區(qū)覆蓋著油性結(jié)痂,刮去痂皮裸露潮紅或潰爛的表皮[12]。

    圖1 寵物犬真菌感染臨床癥狀

    2.2 毛發(fā)直接鏡檢

    患處剪毛消毒,用手術(shù)刀在病健結(jié)合部,呈30°角單向反復(fù)刮皮膚,直至微微滲血。將病料置于載玻片上,加1滴10% KOH制片,蓋上蓋玻片,并在酒精燈上稍微加熱后置于顯微鏡下鏡檢,觀察孢子和菌絲。

    2.3 伍德氏燈檢查(wood’s lamp)

    該技術(shù)是以特制紫外光線燈光(波長253.7 nm),通過鈷或鎳過濾,在感染部位檢測熒光被毛來診斷皮膚癬菌病。

    2.4 真菌培養(yǎng)與鑒定

    2.4.1 制作培養(yǎng)基 配制沙氏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(Glucose Peptone Agar)又稱沙堡瓊脂(SDA),按蛋白胨1 g,瓊脂1.5 g,葡萄糖4 g,蒸餾水100 ml的比例配制培養(yǎng)基,煮沸溶解,高壓115℃,滅菌20 min。趁熱在無菌操作臺(tái)中倒平板,待其凝固。

    2.4.2 分離培養(yǎng) 在無菌操作臺(tái)中用小鑷子將采取的毛發(fā)和皮屑接種到培養(yǎng)基上,并編號(hào),放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)3~7 d,觀察菌落的生長狀況,在無菌操作臺(tái)中對(duì)顏色不同、質(zhì)地不一、形狀不同的菌落進(jìn)行分離純化:打孔器打孔,小勺挑起菌落轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中,編號(hào),放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),再培養(yǎng)3~7 d,觀察整個(gè)菌落是否已經(jīng)純化,若沒有純化還需繼續(xù)分離,直到純化菌落。

    2.4.3 光鏡鑒定 分離純化的真菌培養(yǎng)3 d后,挑取菌落,直接制作涂片,鏡檢或染色后鏡檢,觀察其顯微結(jié)構(gòu),主要觀察孢子和菌絲。檢查是否有大、小分生孢子;大分生孢子的形狀、分隔多少、孢子壁及其它特點(diǎn);小分生孢子的形狀、特點(diǎn)、排列方式等;菌絲的粗細(xì)、分枝特點(diǎn)、菌絲是否分隔;各種特殊菌絲(如鹿角狀菌絲、球拍狀菌絲、螺旋菌絲、結(jié)節(jié)菌絲、梳狀菌絲等);若宏觀形態(tài)和微結(jié)構(gòu)相矛盾,以微觀結(jié)構(gòu)為準(zhǔn)。

    2.4.4 結(jié)果判定 分離純化后,每天定時(shí)記錄菌落的生長情況:菌落的大小、菌落的直徑、菌落的顏色、菌落的表面、菌落的質(zhì)地、菌落的邊緣、菌落的高度、培養(yǎng)基顏色變化、滲出物、氣味等。根據(jù)菌落特征來判定皮膚真菌種類[13]。若根據(jù)以上結(jié)果還不能鑒定真菌的種類,則需借助鑒別培養(yǎng)基。

    3 試驗(yàn)結(jié)果

    3.1 在沙氏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基分離培養(yǎng),結(jié)合鏡鑒

    結(jié)果顯示:犬小孢子菌、須毛癬菌、阿耶羅毛癬菌、尖端賽多孢子菌、念珠菌、共頭霉、馬內(nèi)菲青霉、黑葡萄橞 霉、犁頭霉、雜色曲霉、黃曲霉、以及鑒定到屬的曲霉和暗色真菌。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。檢; H:近平滑念珠菌培養(yǎng)和鏡檢;I:共頭霉培養(yǎng)和鏡檢;J:暗色真菌培養(yǎng);K:煙曲霉培養(yǎng))

    圖2 真菌的分離與鑒定

    3.2 形態(tài)特征

    須毛癬菌 菌落特征:菌絲生長快,五天后長滿平皿,質(zhì)地疏松,邊緣絨毛狀,有同心圓狀,表面初期呈乳白色,后期顏色加深,背面由米黃色變?yōu)橥咙S色再變?yōu)榘导t色;顯微鏡特征:小分生孢子,圓形到梨形,呈簇狀或未成熟的葡萄狀,常存在螺旋菌絲。

    阿耶羅毛癬菌 菌落特征:生長較快,一周后長滿平皿,絲絨毛樣生長,質(zhì)地疏松,邊緣呈放射狀生長,表面呈米黃色,背面呈淡土黃色;顯微鏡特征:大分生孢子,多有分隔,長梭形,壁厚,光滑。

    尖端賽多孢子菌 菌落特征:生長較快,六天后長滿平皿,絨毛狀生長,質(zhì)地較密,邊緣微絨毛,表面白色,背面由淡黃色變?yōu)辄S色;顯微鏡特征:菌絲較粗,有分隔,分生孢子呈卵圓形。

    雜色曲霉 菌落特征:生長較慢,呈粉狀生長,質(zhì)地疏松,邊緣平整,表面顏色逐漸變色,由咖啡色→淡藍(lán)綠色→灰色,背面為黃白色→灰白色,有散在菌落;顯微鏡特征:分生孢子頭疏松呈放射狀,分生孢子球形且有刺。

    犁頭霉 菌落特征:生長速度中等,纖毛狀豎直生長,質(zhì)地較疏松,邊緣不整,短纖毛狀生長,表面灰白色,背面灰白色,時(shí)間久后纖毛尖端有黑色小點(diǎn);顯微鏡特征:大分生孢子囊,梨形,有囊托,有匍匐菌絲。

    馬內(nèi)菲青霉 菌落特征:生長速度較慢,中間呈粉狀生長,四周為纖毛狀生長,質(zhì)地較密,邊緣平整,表面顏色為淺咖啡色→脂粉色→墨綠色→灰白色,背面中間為黃色,四周為乳黃色,有散在菌落生長;顯微鏡特征:無色透明分隔菌絲,分生孢子梗光滑,帚狀枝雙輪生,散在,少不對(duì)稱,頂端狹窄。

    犬小孢子菌 菌落特征:生長快速,絨毛狀生長,質(zhì)地較密,邊緣平整,表面白色到米色,背面乳黃色到米黃色;顯微鏡特征:大部分為大分生孢子,梭形,紡錘形,在頂點(diǎn)稍有彎曲,壁厚和棘狀突起。

    近平滑念珠菌 菌落特征:生長很慢,形成酵母樣菌落,奶油樣,邊緣不整,有皺褶,表面米黃色,背面乳黃色;顯微鏡特征:酵母細(xì)胞多呈卵圓形或長倒卵形。

    共頭霉 菌落特征:生長較快,絨毛狀豎直向上生長,微絨毛向四周發(fā)散,邊緣不整,表面灰白色,背面灰白色;顯微鏡特征:菌絲透明,多分枝,無分隔,孢子梗呈球形至倒卵狀。

    3.3 真菌生長規(guī)律

    根據(jù)表1和圖3,須毛癬菌、尖端賽多孢子菌、阿耶羅毛癬菌、犁頭霉菌絲在5天內(nèi)菌絲的長度逐漸生長延伸,其菌絲在后期不在生長。犬小孢子菌、馬內(nèi)菲青霉、暗色真菌、念珠菌其菌絲在10天內(nèi)菌絲逐漸延伸。須毛癬菌生長速度最快,犬小孢子菌適中,念珠菌最慢。

    圖3 不同菌菌絲長度變化曲線

    4 分析與討論

    沙氏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(SDA)由于具備真菌生長所必需的碳源、氮源等,適合絕大多數(shù)真菌的生長,由于SDA 培養(yǎng)基PH值偏酸,較低,可以抑制細(xì)菌的生長,減少培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌污染的情況[14]。皮膚真菌在25℃生長培養(yǎng),皮膚真菌菌落特征明顯,便于觀察和研究。由于患犬多數(shù)為真菌混合感染,需要多次分離與純化。在試驗(yàn)過程中菌種容易變異,特別是長時(shí)間培養(yǎng),多次移種等均可造成菌落顏色、質(zhì)地、形態(tài)、菌體的改變,如有些菌落因培養(yǎng)時(shí)間過久由原來的白色變?yōu)榘导t色,菌體由粉狀變?yōu)榻q毛狀。同時(shí)要注意病原真菌對(duì)營養(yǎng)的要求高于一般的真菌,有些菌種更需要供給特殊的營養(yǎng)[15]。

    毛癬菌、犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌等引起淺部皮膚感染。資料表明,非皮膚癬菌類如念珠菌、曲霉菌等感染引起的真菌病的比例在逐漸增多[16]。淺部皮膚真菌主要侵犯含有角質(zhì)的組織,如皮膚、毛發(fā)和指甲等,引起各種癬病。深部真菌,如須毛癬菌、阿耶羅毛癬菌、尖端賽多孢子菌、雜色曲霉侵犯皮膚深層和內(nèi)臟,如肺、腎、腦、消化道等器官,危害非常嚴(yán)重[17]。寵物犬臨床表現(xiàn)為食欲下降,呼吸困難,體表被毛易脫落,有膿性結(jié)痂和出血癥狀。

    真菌的鑒定方法主要有直接鏡檢、電鏡觀察法、分子生物學(xué)方法,如:多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、分子雜交、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析DNA、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、DNA序列分析(DNA sequencing)、基因芯片技術(shù)[18]。本試驗(yàn)采用菌落形態(tài)結(jié)合顯微鏡進(jìn)行真菌的鏡鑒,用小培養(yǎng)的方法來進(jìn)行真菌的鑒定。該方法簡單,易操作,成本不高,既可以觀察菌絲的生長情況,又可以觀察真菌的產(chǎn)孢方式,為真菌的鑒定起了一定的指導(dǎo)作用。但這種方法容易被污染,因此,培養(yǎng)的時(shí)候要注意一個(gè)菌落一個(gè)袋子的方法單獨(dú)培養(yǎng)。

    表1 真菌在一定時(shí)間內(nèi)菌絲長度

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