植物MicroRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控在作物改良中的應(yīng)用潛能

劉偉燦 周永剛 王興超 王法微 王南 董園園 李曉薇 李海燕

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長(zhǎng)春 130118）

植物MicroRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控在作物改良中的應(yīng)用潛能

劉偉燦 周永剛 王興超 王法微 王南 董園園 李曉薇 李海燕

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長(zhǎng)春 130118）

植物MicroRNAs（miRNAs）是長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源、單鏈、非編碼、小分子RNA，通過(guò)降解或抑制靶mRNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后沉默。隨著高通量測(cè)序技術(shù)及各種研究技術(shù)的進(jìn)步，越來(lái)越多的microRNA被測(cè)序和驗(yàn)證，為利用基因工程手段進(jìn)行作物改良提供了豐富的候選基因資源。綜述了miRNAs在生物脅迫、非生物脅迫和植物生長(zhǎng)發(fā)育等方面的最新研究進(jìn)展，同時(shí)分析了miRNAs介導(dǎo)的基因調(diào)控在作物改良中的應(yīng)用潛能，并介紹了幾種基于miRNA作用機(jī)制的植物基因工程改良作物的轉(zhuǎn)基因新技術(shù)，如靶基因RNAi，人工miRNAs（amiRNAs），Target Mimics（TM），超表達(dá)miRNA-resistant tagerts；也討論了基于miRNA作用機(jī)制的轉(zhuǎn)基因技術(shù)所面臨的風(fēng)險(xiǎn)和挑戰(zhàn)。

MicroRNAs；靶基因；作物改良；RNAi；amiRNAs；Target mimics；miRNA-resistant tagerts

隨著世界人口的增長(zhǎng)，土地和水資源缺乏，全球氣候變化，使人們擔(dān)憂未來(lái)全球糧食產(chǎn)量能否滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的糧食需求。尤其，我國(guó)是世界人口最多的國(guó)家之一，滿足13億人口的糧食需求，一直是我國(guó)的頭等大事。要解決這個(gè)問(wèn)題，除了保持水土和利用傳統(tǒng)育種方式提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量外，更需要一種新的快速有效的農(nóng)業(yè)新技術(shù)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、高效的新品種，降低農(nóng)藥、肥料投入，對(duì)緩解資源約束，保護(hù)生態(tài)環(huán)境、改善產(chǎn)品品質(zhì)、拓展農(nóng)業(yè)功能等具有重要作用。目前，世界許多國(guó)家都把轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)作為支撐發(fā)展、引領(lǐng)未來(lái)的戰(zhàn)略選擇，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為各國(guó)搶占科技制高點(diǎn)和增強(qiáng)農(nóng)業(yè)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的戰(zhàn)略重點(diǎn)［1］。

MicroRNA（miRNA）是生物體內(nèi)普遍存在的一種內(nèi)源、非編碼、長(zhǎng)度約21-25個(gè)核苷酸的小分子單鏈RNA。在植物中，miRNA通過(guò)與靶m RNA分子不完全互補(bǔ)配對(duì)來(lái)識(shí)別靶基因mRNA，降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯，從而調(diào)節(jié)靶mRNA的豐度和功能［2］。miRNA的表達(dá)不受翻譯過(guò)程影響，比蛋白基因更迅速，調(diào)控效率更高。同一個(gè)miRNA可抑制多個(gè)靶基因的功能，同一個(gè)靶基因又可被多個(gè)miRNA所調(diào)控。miRNA是1993年最早發(fā)現(xiàn)于線蟲中［3］。此后，大量的miRNA被測(cè)序和驗(yàn)證。目前，miRBase（Release 21）數(shù)據(jù)庫(kù)中共收錄了223個(gè)物種的28 645個(gè)前體miRNAs序列和35 828個(gè)成熟miRNA序列信息。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在病原體侵入，環(huán)境脅迫響應(yīng)和植物生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，為利用基因工程手段進(jìn)行作物改良提供了豐富的候選基因資源［4-8］。基于miRNA的轉(zhuǎn)基因技術(shù)可通過(guò)增加植物耐受生物和非生物脅迫的能力及增加生物量來(lái)發(fā)展優(yōu)質(zhì)的作物品種，提高邊際土地的利用率，減少農(nóng)藥的使用量，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力發(fā)展［9］。

本文綜述了miRNAs在生物脅迫、非生物脅迫和植物生長(zhǎng)發(fā)育等方面研究的最新進(jìn)展，同時(shí)分析了miRNAs介導(dǎo)的基因調(diào)控在作物改良中的應(yīng)用潛能，并介紹了幾種主要的基于miRNA作用機(jī)制的植物基因工程應(yīng)用策略，也討論了基于miRNA的轉(zhuǎn)基因技術(shù)所面臨的風(fēng)險(xiǎn)、挑戰(zhàn)。旨在為利用植物基因工程技術(shù)改良作物提供理論參考。

1 植物MicroRNA研究進(jìn)展

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，不可避免地要耐受各種生物脅迫和非生物脅迫的影響。長(zhǎng)期的進(jìn)化也使植物形成了適應(yīng)各種脅迫的機(jī)制。隨著對(duì)大量脅迫處理材料小RNA數(shù)據(jù)信息的分析和對(duì)特定miRNAs功能鑒定研究數(shù)據(jù)的積累，植物miRNAs通過(guò)轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控，在各種脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用的潛在分子機(jī)制陸續(xù)被揭開。此外，miRNAs還參與調(diào)控植物開花、結(jié)實(shí)、分蘗等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，進(jìn)而影響植物形態(tài)構(gòu)建和生物產(chǎn)量。近幾年，基于miRNA機(jī)制的轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為新的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者都希望從中得到改善作物耐受脅迫能力和提高作物產(chǎn)量的新途徑。本部分主要介紹miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控在生物脅迫、非生物脅迫和植物生長(zhǎng)發(fā)育方面的最新研究進(jìn)展（表1）。

1.1 植物miRNA和生物脅迫

目前，miRNA介導(dǎo)的植物抗生物脅迫相關(guān)研究主要集中在通過(guò)深度測(cè)序和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析生物脅迫相關(guān)的miRNAs，特定miRNAs相應(yīng)各種生物脅迫的相關(guān)功能的鑒定仍需進(jìn)一步深入的研究。但迄今獲得的數(shù)據(jù)可清楚地表明，miRNA與植物復(fù)雜的抗生物脅迫防御機(jī)制相關(guān)。

植物病菌（病毒、細(xì)菌和真菌）感染和病蟲害（害蟲和線蟲）是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的兩個(gè)主要的生物脅迫。（1）植物miRNAs與病毒。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物形成了一種RNA沉默（RNA silencing）途徑來(lái)抵抗病毒侵染。相反，植物病毒通過(guò)編碼RNA沉默抑制子（viral suppressors of RNA silencing，VSR）來(lái)抵抗寄主的這種防御反應(yīng)，達(dá)到順利侵染目的。許多證據(jù)表明，植物miRNA與病毒侵染的這種防御過(guò)程有關(guān)。如miR160、miR166、miR167、miR171和miR396家族在水稻響應(yīng)條葉枯病毒（RSV）感染時(shí)被積累［10］。（2）植物miRNAs與細(xì)菌。植物的固有免疫系統(tǒng)依賴于模式識(shí)別受體（PRRs）與病原相關(guān)模式分子（PAMPs）的相互作用對(duì)入侵病原體進(jìn)行識(shí)別，導(dǎo)致PAMP觸發(fā)的免疫反應(yīng)PTI，從而參與免疫調(diào)節(jié)［11］。miRNA也是這種防御機(jī)制的一部分。擬南芥miR393 就是最早系統(tǒng)報(bào)導(dǎo)的通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物抗丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）等細(xì)菌性病中起作用的miRNA［12，13］。另外，植物進(jìn)化出NBS-LRR免疫受體，特異識(shí)別在感染過(guò)程中注入植物細(xì)胞內(nèi)的病原體效應(yīng)因子，導(dǎo)致觸發(fā)免疫反應(yīng)ETI，作為植物免疫的第二道防線［11］。MicroRNAs作為一種緩沖調(diào)節(jié)劑調(diào)控著NBS-LRR類R基因，使植物在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下，NBS-LRR類基因的轉(zhuǎn)錄水平限制在最低水平。當(dāng)植物（如棉花、番茄等）受到病毒，細(xì)菌或真菌等病菌感染時(shí)，某些MicroRNAs（如miR482）的表達(dá)下調(diào)，而其對(duì)應(yīng)的靶基因NBS-LRR上調(diào)，從而調(diào)節(jié)植物相應(yīng)疾?。?4］。（3）植物miRNAs與真菌。miRNAs和植物與根瘤菌的共生固氮作用密切相關(guān)。例如，miR171和 miR397被鑒定與豆科植物生物固氮過(guò)程中的共生感染和結(jié)節(jié)有關(guān)［13］。（4）植物miRNAs與抗蟲。研究表明，在煙草中超表達(dá)人工amiR-24，amiR-24可以靶向作用棉鈴蟲的幾丁質(zhì)酶基因，使棉鈴蟲幼蟲停止蛻皮而死亡［15］。因此，MicroRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控技術(shù)具有替代Bt毒素技術(shù)的潛能。（5）植物與線蟲感染作用相關(guān)。比較分析大豆受大豆胞囊線蟲（SCN）感染后的miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，在大豆胞囊線蟲抗性品種和易感品種之間，有20個(gè)miRNAs特異表達(dá)［16］。

表1 植物MicroRNA在生物脅迫、非生物脅迫和植物生長(zhǎng)發(fā)育方面的最新研究進(jìn)展

1.2 植物miRNA與非生物逆境脅迫

在植物生長(zhǎng)過(guò)程中，常會(huì)受到來(lái)自環(huán)境的多種非生物脅迫影響，非生物脅迫包括干旱、鹽堿、高低溫、氧化、營(yíng)養(yǎng)缺失、重金屬及UV-B輻射等。植物根據(jù)逆境種類及脅迫程度可自身誘導(dǎo)或抑制相應(yīng)miRNA表達(dá)來(lái)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)水平，使植物改變生理狀態(tài)而適應(yīng)不同程度的逆境脅迫。目前，不同逆境條件下或相同逆境的不同脅迫程度處理下，已測(cè)序和鑒定出了大量與逆境相關(guān)的miRNA。2011年，Li等［17］對(duì)干旱、鹽、堿脅迫下的大豆幼苗進(jìn)行小RNA高通量測(cè)序，71、50和45個(gè)miRNA分別在3種脅迫下特異表達(dá)，表明在不同脅迫下有不同的miRNA被特異誘導(dǎo)表達(dá)。2014年，Li等［18］首次以芹菜為材料，利用qPCR對(duì)冷和熱脅迫下的miR160、miR164、miR168、miR394、miR395 和miR408共6個(gè)miRNAs進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，這6個(gè)miRNAs在短時(shí)間內(nèi)與溫度脅迫響應(yīng)有關(guān)。2015年，Panda等［19］對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺失脅迫條件下的miRNA進(jìn)行了綜述，一些植物在磷缺失的土壤基質(zhì)中可誘導(dǎo)miR399，硫缺失可誘導(dǎo)miR395，銅缺失可誘導(dǎo)miR398、miR397和miR408。作者推論植物中被營(yíng)養(yǎng)缺失脅迫誘導(dǎo)的miRNAs可能參與氧化還原和活性氧信號(hào)（ROS）途徑。此外，Ultraviolet-B（UV-B）輻射也是影響作物生長(zhǎng)和發(fā)育的主要因素。Northern blotting發(fā)現(xiàn)在小麥中6個(gè)miRNAs高度響應(yīng)UV-B，其中，miR159、miR167a和miR171上調(diào)，miR156、miR164和miR395下調(diào)［20］。

1.3 MicroRNA與植物生長(zhǎng)發(fā)育

MicroRNA在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，可參與調(diào)控植物分蘗、開花、結(jié)實(shí)、果粒尺寸等過(guò)程，進(jìn)而影響植物生物產(chǎn)量與生物量。挖掘與水稻產(chǎn)量相關(guān)的miRNA分子，闡明其生物學(xué)功能與作用機(jī)理，對(duì)了解作物產(chǎn)量的遺傳調(diào)控機(jī)制、提高作物產(chǎn)量有重要意義。0smiR397是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)能夠正調(diào)控水稻產(chǎn)量性狀的miRNA，在水稻中過(guò)表達(dá)OsmiR397可以顯著增大種子的體積及千粒重，還能促進(jìn)穗分支，使每穗粒數(shù)顯著增多，以及促使開花提前等。研究OsmiR397增加水稻產(chǎn)量的分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)，OsmiR397是通過(guò)切割其靶基因OsLAC實(shí)現(xiàn)功能的［21］。miR397在許多物種中都是高度保守的，這一發(fā)現(xiàn)不僅可以為水稻增產(chǎn)提供新的分子生物學(xué)方法，而且可以應(yīng)用到其他物種中。

2 相關(guān)miRNA的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用策略

隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的植物miRNAs與其靶基因被預(yù)測(cè)和驗(yàn)證，植物miRNAs為利用基因工程手段進(jìn)行作物改造提供了新的豐富候選基因資源。一些基于miRNA作用機(jī)制的轉(zhuǎn)基因技術(shù)也進(jìn)一步發(fā)展并被成功應(yīng)用于植物品種的改造，為開發(fā)優(yōu)良農(nóng)藝性狀的基因工程作物新品系提供新的技術(shù)手段。目前，基于miRNA與其靶基因作用機(jī)制的植物品種改良轉(zhuǎn)基因技術(shù)大致分為兩種策略（圖1）：（1）當(dāng)候選miRNA正向調(diào)節(jié)目標(biāo)農(nóng)藝性狀時(shí)，可以采用超表達(dá)miRNAs或人工amiRNAs的方式加強(qiáng)miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控作用，也可以采用RNAi直接敲除靶基因的方式，削弱靶基因作用，從而促進(jìn)期望的優(yōu)良農(nóng)藝性狀；（2）當(dāng)候選miRNAs負(fù)向調(diào)節(jié)目標(biāo)農(nóng)藝性狀時(shí)，可以采用人工Target Mimics方式吸附miRNA，降低miRNA對(duì)其內(nèi)源靶基因的沉默作用，也可超表達(dá)靶基因或miRNA-resistant靶基因來(lái)直接增強(qiáng)靶基因的有效活性，最終促進(jìn)目標(biāo)性狀。此外，以上轉(zhuǎn)基因技術(shù)可靈活配用組成型，脅迫誘導(dǎo)型或組織特異型啟動(dòng)子，從而使以上基因表達(dá)在特定時(shí)期和特定的組織中實(shí)現(xiàn)時(shí)空調(diào)控，也可通過(guò)更換強(qiáng)或弱啟動(dòng)子調(diào)控基因表達(dá)程度，使以上轉(zhuǎn)基因技術(shù)更將合理的運(yùn)用于改良經(jīng)濟(jì)作物的遺傳性狀。本部分針對(duì)基于miRNA與其靶基因作用機(jī)制的幾種重要的轉(zhuǎn)基因技術(shù)具體介紹如下。

2.1 靶基因RNAi

RNA干擾技術(shù)（RNAi）是由互補(bǔ)的內(nèi)源或外源雙鏈RNA（dsRNA）切割而成的反義siRNA形成的沉默復(fù)合體（RISC），降解同源互補(bǔ)mRNA的現(xiàn)象，RNA干擾技術(shù)可以敲除或沉默某特定基因的表達(dá)。當(dāng)候選miRNA通過(guò)作用的靶基因正向調(diào)控目標(biāo)性狀時(shí)，通常采用miRNA的超表達(dá)策略增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的性能。然而，由于miRNA的基因多效性（即同一miRNA可靶向負(fù)調(diào)控多種mRNA）會(huì)導(dǎo)致非目的靶基因被同時(shí)調(diào)控，而造成負(fù)面影響。因此，此時(shí)可采用RNAi干擾技術(shù)操縱特定miRNA靶基因的沉默來(lái)避免miRNA超表達(dá)導(dǎo)致的邊緣效應(yīng)影響。例如，在水稻中下調(diào)兩個(gè)miR319靶標(biāo)基因OsPCF5和OsPCF8中任意一個(gè)表達(dá)的RNAi植株，都導(dǎo)致低溫馴化后冷抗性的增強(qiáng)［33］。

2.2 amiRNAs

amiRNAs（artificial microRNAs） 是 模 擬 內(nèi)源miRNA的生成途徑人工設(shè)計(jì)合成的miRNA。amiRNA技術(shù)的原理就是將內(nèi)源pre-miRNA序列中的miRNA：miRNA*置換為人工設(shè)計(jì)好的amiRNA：amiRNA*轉(zhuǎn)化到植物中，形成的pre-amiRNA在植物體內(nèi)按照內(nèi)源miRNA的生物合成途徑可產(chǎn)生成熟的amiRNAs，從而介導(dǎo)靶基因的沉默表達(dá)。amiRNA技術(shù)可針對(duì)同一基因的不同靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)多個(gè)amiRNA干擾載體，以此增強(qiáng)基因的沉默效率；也可針對(duì)多個(gè)基因構(gòu)建多個(gè)amiRNA串聯(lián)的表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)多基因的同時(shí)沉默。WMD3（http://wmd3.weigelworld. org/）設(shè)計(jì)平臺(tái)即可實(shí)現(xiàn)植物amiRNA序列，載體及擴(kuò)增引物的自動(dòng)化設(shè)計(jì)。近期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因衍生或病毒誘導(dǎo)的siRNA能通過(guò)植物大分子運(yùn)輸系統(tǒng)擴(kuò)散到其他組織，因此可能會(huì)對(duì)正常植物組織和器官造成損傷，而amiRNAs卻很少有非期望的沉默信號(hào)的傳播發(fā)生，具有較高的生物安全性［54-56］。此外，siRNAs不僅靶向候選的RNA，也影響那些不能精確互補(bǔ)的RNA（脫靶效應(yīng)），而amiRNAs設(shè)計(jì)可選擇與靶mRNA序列作用特異性高的序列，提高作用的精準(zhǔn)性［57］。因而，amiRNA可能成為作物改良的最有效工具之一，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，amiRNA技術(shù)已被成功應(yīng)用于水稻［58］，馬鈴薯［59］、棉花［60］及煙草［61］等多種作物的抗病毒品種培育研究中。在實(shí)際生產(chǎn)中，作物常常遭遇多種病毒聯(lián)合侵染，傳統(tǒng)的RNAi干擾技術(shù)只能使作物抵抗部分病毒株系，無(wú)法培育獲得具有持久廣譜病毒抗性的作物。amiRNA與靶mRNA之間允許存在一定數(shù)量的錯(cuò)配堿基，針對(duì)病毒基因組保守區(qū)設(shè)計(jì)amiRNA，能使轉(zhuǎn)基因作物有效抵抗大多數(shù)病毒株系，并且即使病毒基因發(fā)生了突變也依然保持對(duì)該病毒的抗性。

2.3 MiRNA Target Mimics（TM）

在miRNAs負(fù)調(diào)控目標(biāo)農(nóng)藝性狀時(shí)，抑制miRNAs的表達(dá)或上調(diào)它們的靶基因是改良作物的有效策略，采用的手段分別是超表達(dá)MiRNA Target Mimics（TM）和超表達(dá)抗miRNA作用的同義突變靶基因。MiRNA Target Mimics是一種調(diào)節(jié)內(nèi)源特定miRNA豐度的miRNA缺失技術(shù)。具體方法是通過(guò)超表達(dá)mimicry RNA，使其吸附大量與其互補(bǔ)配對(duì)的成熟miRNA，降低miRNA與其相應(yīng)靶mRNA的結(jié)合機(jī)會(huì)，從而阻止miRNA對(duì)其內(nèi)源靶基因的沉默作用。針對(duì)不同miRNA家族成員形成的成熟miRNA，設(shè)計(jì)相應(yīng)的Target Mimics，可以對(duì)miRNA特定家族成員進(jìn)行抑制沉默，也可用來(lái)沉默整個(gè)miRNA家族成員［62］。Target Mimics的作用最早是在研究Pi平衡時(shí)被發(fā)現(xiàn)的。植物在缺磷脅迫下，miR399被誘導(dǎo)降解靶基因PHO2，PHO2編碼的E2泛素相關(guān)結(jié)合蛋白能夠影響植物中磷的含量及磷的再利用過(guò)程［63］。還發(fā)現(xiàn)IPS1家族基因在缺磷條件下被誘導(dǎo)產(chǎn)生，其可通過(guò)保守區(qū)的互補(bǔ)序列與miR399互補(bǔ)結(jié)合，占據(jù)miR399，卻不被降解，從而減少了miR399與靶基因PHO2的結(jié)合，影響miR399調(diào)節(jié)PHO2基因的能力［64］。在擬南芥中，miR165/miR166調(diào)控的REVALUTA（REV）基因是頂端分生組織的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，該基因的突變將影響植株的側(cè)枝數(shù)量，是分支性狀的一個(gè)正調(diào)控因子。MIM165/MIM166可吸附miR165/miR166而不被降解，增加靶基因REVALUTA（REV）的作用［65］。如果這種作用被應(yīng)用到單子葉植物的分蘗，可提高作物產(chǎn)量而獲得農(nóng)業(yè)收益。

Target Mimics植株對(duì)研究miRNA功能提供了一個(gè)很好的研究材料和手段。Target Mimics作為調(diào)節(jié)內(nèi)源miRNAs水平的一項(xiàng)新技術(shù)可應(yīng)用于改良農(nóng)業(yè)性狀和提高作物產(chǎn)量。然而，需要明確的是Target Mimics對(duì)某一miRNA的限制作用，會(huì)導(dǎo)致miRNA對(duì)應(yīng)所有靶基因的水平提高，而不是特定的某一目的靶基因［54］。并且內(nèi)源Target Mimics是否僅限于非編碼區(qū)尚不明確。所以，應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)面臨挑戰(zhàn)。例如，擬南芥miR319 和 miR159 序列相近但屬于不同的miRNA家族，它們的靶基因分別是TCP 和MYB基因。在MIM319 和 MIM159植株中，miR159和miR319 表達(dá)水平均減少，相應(yīng)MYB 和TCP 表達(dá)水平均提高，說(shuō)明兩種Target Mimics產(chǎn)生了意外的交叉脫靶效應(yīng)，對(duì)序列相近的miR159和miR319同時(shí)產(chǎn)生了抑制作用［66］。

另外，已經(jīng)證實(shí)通過(guò)miRNA基因缺失來(lái)研究microRNA基因的功能是很難的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)miRNA家族具有遺傳冗繁性［67］。利用miRNA誘捕技術(shù)，如target MIMICs（MIMs）、short tandem target MIMICs（STTMs）和molecular SPONGEs（SPs），可通過(guò)影響內(nèi)源性miRNA的活性而產(chǎn)生miRNA功能缺失表型［67］。如cmSP165/166 與 STTM165/166和MIM165/166相比表現(xiàn)出較強(qiáng)的效應(yīng)。MIM159比cmSP159與 STTM159效應(yīng)強(qiáng)。總之，沒(méi)有哪一種方法能保證最強(qiáng)的miRNA抑制，而不同的miRNA家族對(duì)各種方式有不同的反應(yīng)。建議多種方式相結(jié)合，可以獲得期望的功能缺失結(jié)果［67］。

2.4 超表達(dá)miRNA-resistant tagerts

miRNA-resistant tagerts即抗miRNA作用的同義突變靶基因，指的是通過(guò)改變靶基因與miRNA互補(bǔ)區(qū)的核苷酸序列（不改變氨基酸序列），而打斷miRNA與靶基因之間的序列配對(duì)連續(xù)性關(guān)系，從而得到新的不受內(nèi)源miRNA調(diào)節(jié)的靶基因。在植物中超表達(dá)miRNA-resistant tagerts與直接超表達(dá)植物miRNA的內(nèi)源靶基因相比，它們翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)編碼序列不變從而保證了靶基因功能的性質(zhì)不變，但由于miRNA-resistant tagerts基因可以避免內(nèi)源miRNA的調(diào)控影響，因此，miRNA-resistant tagerts可以在轉(zhuǎn)基因植物中積累更高的表達(dá)水平，功能更顯著。在實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，在植物中超表達(dá)miRNA-resistant tagerts與超表達(dá)MiRNA target mimicry所展現(xiàn)的表型相似，但和超表達(dá)miRNA/amiRNAs與靶基因RNAi展現(xiàn)的表型相反。例如，在擬南芥中超表達(dá)miR394和其靶基因LCR突變體均表現(xiàn)出鹽敏感性和抗寒性增強(qiáng)，但超表達(dá)抗miR394作用的同義突變靶基因mLCR，轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)出耐鹽性增強(qiáng)和抗寒性降低［68，69］。在水稻中，魯玉柱等成功克隆出了水稻的OsCSD2基因，并根據(jù)密碼子的兼并性，突變了miR398作用的位點(diǎn)，但不改變其氨基酸序列，得到了新的抗miR398的OsmCSD2，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入水稻中。結(jié)果表明，在重金屬銅脅迫下，過(guò)表達(dá)抗miR398的OsmCSD2轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出良好的抗逆性，H2O2含量顯著低于野生型（圖2）［42］。

3 基于miRNA的轉(zhuǎn)基因技術(shù)所面臨的風(fēng)險(xiǎn)和挑戰(zhàn)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)自誕生時(shí)起，爭(zhēng)論就從未停息過(guò)。基于miRNA原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是進(jìn)行作物改良的有效技術(shù)手段之一。其安全性問(wèn)題同常規(guī)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)一樣是社會(huì)各界爭(zhēng)論的焦點(diǎn)，至今懸而未決。2012年，Zhang等［70］研究發(fā)現(xiàn)，水稻MIR168a基因是中國(guó)人血清中含量較高的一種植物小RNA，它可以負(fù)調(diào)控人和小鼠的低密度脂蛋白受體銜接蛋白的mRNA，從而減緩低密度脂蛋白從血漿中的清除。這項(xiàng)研究證明了外源的植物miRNA可以通過(guò)日常攝取食物的方式進(jìn)入動(dòng)物的血液和組織器官，并且可通過(guò)調(diào)控人體內(nèi)靶基因表達(dá)的方式影響人體的生理功能。這項(xiàng)研究結(jié)論引發(fā)了多方關(guān)注。一方面，如果真的存在一種高效的小分子RNA進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)基因表達(dá)沉默的方式，將對(duì)小分子RNA傳輸?shù)闹委熓侄斡兄匾囊饬x；另一方面，又讓人擔(dān)心植物miRNA進(jìn)入人體內(nèi)后是否會(huì)調(diào)控非目標(biāo)基因而對(duì)人體生理產(chǎn)生不良影響。

4 展望

在轉(zhuǎn)基因技術(shù)的激烈爭(zhēng)論中，美國(guó)搶占先機(jī)，成了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的全球霸主，其他國(guó)家也一直保持著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展態(tài)勢(shì)。我國(guó)是世界第一人口大國(guó)，解決吃飯問(wèn)題始終是國(guó)家的頭等大事。目前，推進(jìn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究與應(yīng)用是確保國(guó)家糧食安全和促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的必然要求和重要途徑，我國(guó)也明確了“積極研究、慎重推廣、自主創(chuàng)新”的國(guó)家態(tài)度。

在近十幾年來(lái)，miRNA的研究越來(lái)越備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。目前，在植物中，大量的miRNA已被測(cè)序和鑒定。隨著miRNA研究手段的不斷進(jìn)步，一些miRNA在植物體中的生物學(xué)功能及分子作用機(jī)制也逐漸被闡明。miRNA具有調(diào)控植物適應(yīng)各種脅迫及生長(zhǎng)發(fā)育的能力。miRNA已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。MiRNA及其靶基因?yàn)槔棉D(zhuǎn)基因技術(shù)手段進(jìn)行作物改良提供了新的豐富候選基因資源。國(guó)內(nèi)外學(xué)者都希望從中找到作物品種改良的新途徑。

另外，一些人可能會(huì)擔(dān)憂在轉(zhuǎn)基因植物中改變miRNAs表達(dá)可能導(dǎo)致目標(biāo)物種中某些基因的非目的調(diào)控，使miRNA轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化和發(fā)展也面臨風(fēng)險(xiǎn)和挑戰(zhàn)［71］。建議要大力加強(qiáng)miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控機(jī)制研究，加強(qiáng)序列同源性檢測(cè)，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的正確設(shè)計(jì)，降低脫靶效應(yīng)，并開發(fā)組織特異性或誘導(dǎo)型表達(dá)策略，更全面的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室和田間試驗(yàn)。基于miRNA的轉(zhuǎn)基因技術(shù)匹配國(guó)家風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和管理辦法，促進(jìn)植物MicroRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物改良中的應(yīng)用得到充分的發(fā)展。

圖2 基于miRNA與其靶基因作用機(jī)制的轉(zhuǎn)基因技術(shù)

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

The Potential Application of microRNA-mediated Gene Regulation in Crop Improvement

LIU Wei-can ZHOU Yong-gang WANG Xing-chao WANG Fa-wei WANG Nan DONG Yuan-yuan LI Xiao-wei LI Hai-yan
（College of Life Sciences，Engineering Research Center of Chinese Ministry of Education for Bioreactor and Pharmaceutical Development，Jilin Agricultural University，Changchun 130118）

Plant microRNAs（miRNAs）are small RNAs of approximate 22 nt，endogenous，single-strand，and non-coding. They play regulatory roles at post-transcription level by inhibiting translation or promoting the degradation of target mRNAs. With the advances in highthroughput sequencing technology and a variety of research techniques，more and more microRNAs have been predicted and validated，which provide a rich candidate gene resources for crop improvement through genetic engineering. This review highlights the recent advances in studies of biotic stress，abiotic stress，as well as plant growth and development，and then analyzes the potential of miRNA-mediated gene regulation for crop improvement. In addition，several transgenic technologies for genetically modified crops in plant genetic engineering with miRNA-based gene regulation are introduced，including RNAi of target gene，artificial miRNAs（amiRNAs），target mimics（TM）and over-expressing miRNA-resistant targets. Also the potential risks and challenges of miRNA-based genetic modification technology are discussed.

microRNAs；target gene；crop improvement；RNAi；amiRNAs；target mimics；miRNA-resistant targets

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.001

2015-8-24

農(nóng)業(yè)部國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2014ZX08010-002），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目，（31271746，31201144，31101091），吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20150204027NY）

劉偉燦，女，博士研究生，研究方向：植物抗逆分子生物學(xué)與基因工程，E-mail：liuweican602@163.com；周永剛同為本文第一作者

李海燕，女，博士，教授，研究方向：植物抗逆分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：hyli99@163.com