應(yīng)用人造口腔模擬擠壓裝置研究口含煙煙堿釋放的影響因素

田永峰，李 鵬，劉 澤，孫世豪，董高峰，張 杰，王昆淼，段沅杏，湯建國，楊 柳，楊 繼，陳永寬，繆明明，劉志華*

1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明市五華區(qū)紅錦路367 號(hào) 650231

2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

3.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司北京卷煙廠，北京市通州區(qū)萬盛南街99 號(hào) 100024

口含煙包括嚼煙（chewing tobacco）、瑞典含煙（snus）、美式含煙（moist snuff）、煙草膏（tobacco paste）、牙 粉（tooth powder）、可 溶 煙 草 片（dissolvable tobacco）等，目前主要的市售產(chǎn)品為瑞典含煙和美式含煙［1-3］?？诤瑹熥钤绯霈F(xiàn)于17 世紀(jì)，1730 年美國成立了口含煙加工廠，1822 年第一個(gè)口含煙品牌“Ettan”誕生于瑞典［1］?？诤瑹熡捎跓o須燃燒、不產(chǎn)生煙氣，因此具有使用場(chǎng)所不受限制的特點(diǎn)。隨著全球控?zé)熜蝿?shì)的日趨嚴(yán)峻，口含煙因其獨(dú)特的使用方式而成為解決公共場(chǎng)所吸煙和消除環(huán)境影響的有效解決方案，并成為各國煙草公司的研究重點(diǎn)之一［2］?？诤瑹熓褂脮r(shí)，將其放入唇部和牙齦之間，煙堿經(jīng)口腔黏膜吸收后進(jìn)入血液，進(jìn)而使消費(fèi)者獲得生理滿足感。因此，使用口腔模擬裝置研究口含煙中煙堿釋放的影響因素對(duì)于該類產(chǎn)品的配方開發(fā)、工藝優(yōu)化及質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義［3］。張杰等［4-5］使用一種模擬裝置分析了無煙氣煙草制品的煙堿體外釋放特征；張文娟等［6］對(duì)上述模擬裝置進(jìn)行了改進(jìn)，并研究了膠基型無煙氣煙草制品中煙堿的釋放行為；李鵬等［7］考察了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法在測(cè)試口含煙化學(xué)指標(biāo)中的適用性；段沅杏等［8］測(cè)定了口用型無煙氣煙草制品中的煙堿含量。目前，口含煙相關(guān)研究中主要參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法中的前處理方法及色譜質(zhì)譜檢測(cè)條件，針對(duì)口含煙分析裝置及方法的報(bào)道較少，煙堿釋放的影響因素研究也不夠深入、全面。為此，本研究中使用自主研發(fā)的能夠模擬唇齒之間擠壓力的口腔模擬溶出裝置，考察口含煙含水率、煙粉粒徑和pH 對(duì)口含煙煙堿釋放率的影響，旨在為口含煙的質(zhì)量評(píng)價(jià)及煙堿釋放調(diào)控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

不同含水率、煙粉粒徑和pH 的Showker Mint系列口含煙樣品，由云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司根 據(jù)Swedish Match GothiaTek?standard［9］制 備。樣品含水率分別為11%、32%和51%，煙粉粒徑分別為180 μm（10 目）、380 μm（40 目）和1 700 μm（80 目），pH 分別6.7、7.5 和8.4。實(shí)驗(yàn)前所有樣品均密封儲(chǔ)存于冰箱中，樣品信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；氯化鎂（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；磷酸氫二鉀（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；苯甲酸鈉、山梨酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀（分析純，西隴化工股份有限公司）；實(shí)驗(yàn)中所用3 種人工唾液［10］的配方見表2。

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；口腔模擬溶出裝置［11］（云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司研發(fā)）；BT100-02 恒流泵（保定齊力恒流泵有限公司）；PHS.3C 型pH 計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q50 超純水儀（美國Millipore 公司）；CP2245 型電子天平（感量：0.000 1 g，德國Sartorius 公司）。

表2 人工唾液配方組成Tab.2 Artificial saliva formulation

1.2 方法

1.2.1 口腔模擬溶出裝置組成

口腔模擬溶出裝置見圖1。該裝置主要包括集液器（1）、模擬溶出主機(jī)（3）、兩臺(tái)相同規(guī)格的蠕動(dòng)泵（2、4）、模擬口腔組件（5）、砝碼組件（6）和唾液采集盤（9）。其中模擬溶出主機(jī)（3）由擠壓機(jī)械手（7）和模擬口腔（8）組成。

1.2.2 口腔模擬溶出裝置工作原理

圖1 體外煙堿溶出口腔模擬裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of a buccal cavity simulator for in vitro release of nicotine

圖2 體外煙堿溶出口腔模擬裝置工作原理示意圖Fig.2 Schematic diagram of working principle of buccal cavity simulator for in vitro release of nicotine

如圖2 所示，該裝置通過步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)口腔模擬組件往復(fù)運(yùn)動(dòng)并結(jié)合磁力控制最終實(shí)現(xiàn)口腔開合動(dòng)作，通過配合不同質(zhì)量砝碼搭配可實(shí)現(xiàn)不同擠壓力設(shè)定，通過蠕動(dòng)泵可實(shí)現(xiàn)唾液流量調(diào)整。模擬口腔包括溶液皿和開合導(dǎo)向槽。其中，溶液皿具有進(jìn)液管和出液管；開合導(dǎo)向槽則位于溶液皿內(nèi)部，具有一對(duì)夾合組件。夾合組件包括唇板、固定在唇板上的夾板及位于夾板底部的電磁鐵，通過調(diào)節(jié)磁力可實(shí)現(xiàn)模擬口腔的開合。模擬口腔的溶液皿用于放置樣品和人工唾液，溶液皿底部適配加熱板及加熱管，用于保持溶液皿內(nèi)的恒溫環(huán)境。通過設(shè)置開合導(dǎo)向槽的開合度可實(shí)現(xiàn)模擬口含煙使用過程中的口腔環(huán)境，擠壓機(jī)械手的上下移動(dòng)可實(shí)現(xiàn)模擬唇部對(duì)口含煙的擠壓動(dòng)作。

實(shí)驗(yàn)中，將人工唾液泵入儲(chǔ)液瓶中，并置于恒溫槽內(nèi)保持恒溫，由蠕動(dòng)泵泵入人工唾液。出液管路與集液器相連，該部分包含15 工位（14 個(gè)10 mL 試劑瓶和1 個(gè)廢液排出管）唾液采集盤、旋轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)（閉環(huán)控制）、驅(qū)動(dòng)同步輪和同步帶及支架主體。該裝置由電腦控制，除具有咀嚼功能外，還具有唇部蠕動(dòng)、唾液自動(dòng)定量收集等功能，可以實(shí)現(xiàn)樣品的自動(dòng)擠壓和溶出液的實(shí)時(shí)在線采集。

1.2.3 口含煙煙堿體外溶出實(shí)驗(yàn)

將人工唾液加入儲(chǔ)液瓶中，置于37 ℃水浴鍋內(nèi)；開啟蠕動(dòng)泵，待系統(tǒng)穩(wěn)定至37 ℃后，設(shè)定模擬溶出裝置參數(shù)；將口含煙樣品放入溶液皿內(nèi)并開始計(jì)時(shí)，分別在2、4、6、8、10、15、20、25、30 min 時(shí)收集人工唾液，每次收集后立即檢測(cè)人工唾液中煙堿含量；收集人工唾液30 min 后，取出口含煙殘留樣品，置于50 mL 三角瓶中備用。

1.2.4 煙堿釋放率檢測(cè)

利用高效液相色譜儀檢測(cè)樣品中的煙堿。色譜柱：Waters XTerra C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：甲醇，B：20 mmol 的磷酸鹽緩沖溶液（0.2%三乙胺，pH 6.0），A∶B 為18∶82；流動(dòng)相流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃。

1.2.5 煙堿釋放率分析

將口含煙殘留樣品的小袋剪開并連同小袋一起放入50 mL 三角瓶中；加入20 mL 乙醇與5%NaOH溶液（體積比9∶1）的混合溶液，超聲萃取30 min；將煙堿人工唾液和殘留樣品萃取液分別過0.45 μm濾膜后，采用HPLC 進(jìn)行定量檢測(cè)；根據(jù)定量結(jié)果計(jì)算煙堿累計(jì)釋放率，并繪制煙堿釋放曲線。煙堿累計(jì)釋放率由一段時(shí)間的煙堿釋放量除以樣品總煙堿量計(jì)算，其中樣品總煙堿量為樣品30 min的煙堿釋放量與殘留樣品中煙堿量的總和。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 軟件對(duì)煙堿釋放結(jié)果進(jìn)行t 檢驗(yàn)，取顯著水平0.05，定量結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 口含煙煙堿口腔模擬溶出檢測(cè)方法評(píng)價(jià)

2.1.1 檢出限和定量限

取pH 5.2 的人工唾液分別配制質(zhì)量濃度為5、20、50、100、200、400、600、1 000 μg/mL 的煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用HPLC 進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)3 次并取平均值，以煙堿質(zhì)量濃度（x，μg/mL）對(duì)煙堿峰面積（y）進(jìn)行線性回歸分析，得到煙堿的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為y=10.60 x-11.72，R2=0.999 9。分別以3倍和10 倍信噪比計(jì)算方法的檢出限和定量限，分別為3.9 和13.0 μg/g。

2.1.2 精密度和回收率

取口含煙樣品Showker Mint（1#），分別按照低、中、高3 種水平加入煙堿標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)添加水平均重復(fù)5 次。將加標(biāo)樣品按優(yōu)化的方法進(jìn)行前處理，連續(xù)測(cè)定6 d。方法的精密度和回收率結(jié)果見表3?？梢钥闯觯椒ǖ娜諆?nèi)精密度為0.87%～3.35%，日間精密度為3.52%～4.91%，加標(biāo)回收率94.2%～98.5%，表明本方法可以滿足定量要求。

表3 方法精密度與回收率Tab.3 Recovery and precision of the method

2.2 人工唾液使用條件的確定

使用表2 所示的人工唾液配方測(cè)定口含煙煙堿釋放率，結(jié)果顯示，在3 種人工唾液中口含煙煙堿的釋放率均超過99%，可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。煙堿在酸性條件下呈質(zhì)子化形態(tài)分布，堿性條件下向游離態(tài)轉(zhuǎn)化，為使煙堿更快速地溶解在人工唾液中，本研究中選擇3#人工唾液。據(jù)文獻(xiàn)［12］報(bào)道，人體在未接受刺激的條件下，唾液分泌速度約為0.06～1.8 mL/min，而在強(qiáng)烈刺激條件下，唾液的分泌速度會(huì)增加。鑒于口含煙煙堿會(huì)對(duì)使用者產(chǎn)生刺激，使唾液分泌速度加快，因此本研究中選擇人工唾液流速2 mL/min。通常，人體口腔溫度在36.3～37.2 ℃之間，國內(nèi)外口含制劑溶出度測(cè)定中通常選擇37 ℃，因此，本研究中通過恒溫槽、加熱線圈、溫度傳感器使實(shí)驗(yàn)體系維持在（37.0±0.1）℃。

2.3 口含煙品質(zhì)影響因素分析

2.3.1 含水率對(duì)口含煙煙堿釋放率的影響

國際市場(chǎng)市售無煙氣煙草制品的含水率在8%～55%之間［13-15］，因此制備了含水率分別為11%、32%、51%的樣品進(jìn)行分析。每種樣品取3 個(gè)平行，按1.2 節(jié)方法進(jìn)行口含煙煙堿釋放實(shí)驗(yàn)，煙堿釋放率如圖3 所示?？梢钥闯觯蕦?duì)煙堿釋放有一定的影響，含水率高的樣品在初始2 min的煙堿釋放率提高約40%。在煙草物料中，煙堿的釋放需先經(jīng)歷吸收水分溶出的過程，因此口含煙樣品接觸人工唾液后，煙堿的釋放存在一定的滯后，此過程約為20～50 s。含水率低的樣品吸水過程時(shí)間長，其煙堿釋放較慢。本研究中，3 個(gè)不同含水率樣品在使用30 min 后其煙堿釋放率均超過95%，說明含水率較高時(shí)，不同樣品的煙堿釋放行為差異較小。

圖3 不同含水率口含煙煙堿釋放率Fig.3 Release rates of nicotine from snus with different moisture contents

2.3.2 pH 對(duì)煙堿釋放的影響

通常，無煙氣煙草制品的pH 在6.0～8.5 之間［16-17］，因 此 制 備 了pH 分別為6.7、7.5 和8.4 的樣品進(jìn)行分析。每種樣品取3 個(gè)平行，按1.2 節(jié)方法進(jìn)行口含煙煙堿釋放實(shí)驗(yàn)，煙堿釋放率如圖4所示?？梢钥闯?，不同pH 口含煙的煙堿釋放速率具有顯著差異（P＜0.05）。3 種不同pH 樣品煙堿釋放率隨樣品pH 的增大而減小，這是由于煙堿在堿性條件下主要以游離態(tài)存在，相反則主要以質(zhì)子化形態(tài)存在，質(zhì)子化的煙堿更易溶于水中，因此，與pH 高的樣品相比，pH 低的樣品中煙堿釋放率更快。

圖4 不同pH 口含煙煙堿釋放率Fig.4 Release rates of nicotine from snus with different pH values

有研究表明，煙草制品中游離煙堿的含量是影響產(chǎn)品生理滿足感的重要因素，其與pH 呈正相關(guān)［18-20］。因此，調(diào)節(jié)pH 是提高煙草制品中游離煙堿含量的有效途徑。艾明歡等［21］研究了口含煙原料中游離煙堿與含水率和pH 的關(guān)系，結(jié)果表明，在相同的游離煙堿變化量下，不同煙草原料pH 變化幅度為1 時(shí)對(duì)應(yīng)的含水率變化量為0.4%～1.0%。由于口含煙中含水率可調(diào)范圍廣，因此，與pH 調(diào)節(jié)法相比，含水率調(diào)節(jié)是更加有效的口含煙游離煙堿含量調(diào)節(jié)途徑。

2.3.3 煙粉粒徑對(duì)煙堿釋放的影響

圖5 不同煙粉粒徑煙堿釋放率Fig.5 Release rates of nicotine from snus with tobacco powder of different particle sizes

通過對(duì)無煙氣煙草制品的分析發(fā)現(xiàn)，其顆粒分布于10～80 目之間。因此選擇10、40 和80 目3個(gè)樣品進(jìn)行分析。每組樣品取3 個(gè)平行，按照1.2節(jié)方法進(jìn)行口含煙煙堿釋放實(shí)驗(yàn)，煙堿釋放率如圖5 所示。可以看出，不同煙粉粒徑的口含煙煙堿釋放速率存在顯著差異（P＜0.05），煙堿的釋放速率隨著煙粉粒徑的減小快速增加，80 目樣品的煙堿釋放率是10 目樣品的3 倍?？梢?，煙粉粒徑是調(diào)節(jié)口含煙制品中煙堿釋放率的關(guān)鍵影響因素。原因是，隨著煙粉粒徑的減小，煙粉與唾液的接觸面積增加，進(jìn)而使煙堿釋放加快。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，煙粉粒徑大的樣品的煙堿釋放較為持久和柔和，而顆粒小的樣品在開始的6 min 內(nèi)其煙堿釋放率已超過90%。因此，建議使用煙粉粒徑較大的煙草原料制備口含煙，以使煙堿的釋放更緩和。

2.4 口含煙品質(zhì)影響因素模型

含水率、煙粉粒徑和pH 對(duì)口含煙煙堿釋放率的影響符合指數(shù)函數(shù)，a 和b 為常數(shù)。不同影響因素下口含煙的煙堿釋放率可由方程（1）計(jì)算。其中a 和b 值見表4。不同含水率條件下，隨著含水率的升高煙堿釋放率呈加快趨勢(shì)，不同pH 條件下，隨著pH 的升高煙堿釋放率呈降低趨勢(shì)。不同煙粉粒徑條件下，隨著煙粉粒徑的減小，煙堿釋放率呈增大趨勢(shì)。上述模擬結(jié)果與2.3 中實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，不同條件下R2均大于0.95，說明該方程擬合效果良好。

表4 不同條件下煙堿的釋放率方程參數(shù)Tab.4 Fitting equation parameters of release rates of nicotine from snus under different conditions

3 結(jié)論

開發(fā)了一套新型口腔模擬溶出裝置，并通過與高效液相色譜法結(jié)合建立了一種參數(shù)可控、結(jié)果可靠的口含煙煙堿體外模擬溶出研究方法?？诤瑹熤泻蕦?duì)煙堿的釋放時(shí)間影響較顯著，但含水率超過30%后，煙堿釋放速率差異不明顯。不同口含煙原料中煙堿在堿性條件下均能快速溶出?？诤瑹煙煼哿綄?duì)煙堿釋放率的影響最顯著，當(dāng)煙粉粒徑1 700 μm 時(shí)，在模擬口腔環(huán)境中6 min 內(nèi)煙堿的釋放率已超過90%，而煙粉粒徑較大的煙草原料中煙堿的釋放在前10 min 內(nèi)較緩慢。3 個(gè)影響因素?cái)M合模型為指數(shù)方程，擬合系數(shù)R2大于0.95，適用于模擬不同條件影響下口含煙煙堿的釋放率。本研究結(jié)果可為口含煙的質(zhì)量評(píng)價(jià)、煙堿釋放調(diào)控提供技術(shù)支持。