雪上一枝蒿與金不換不同比例配伍的急性毒性研究

王 晶，李 梅，王大貴，黃先菊

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430074)

雪上一枝蒿AconitumbrachypodumDiels為毛茛科烏頭屬藥材，是短柄烏頭的干燥塊根，常被民間用來治療各種疼痛和炎癥相關(guān)性疾病[1，2]，主要毒性成分為雙酯類生物堿，服用時(shí)未經(jīng)炮制或炮制不當(dāng)極易中毒，嚴(yán)重者會(huì)引起昏迷甚至死亡，中毒表現(xiàn)主要為心、肝臟毒性和神經(jīng)系統(tǒng)毒性癥狀[3，4]。現(xiàn)有的臨床解毒方法并不能完全消除烏頭類植物所導(dǎo)致的毒性，因此探索雪上一枝蒿的中毒機(jī)制，尋求其中毒的安全解救辦法，提高安全治療的窗口期，具有重大的現(xiàn)實(shí)和社會(huì)意義。

龍膽科黃秦艽屬植物金不換VeratrillabailloniiFranch，又名滇黃芩、大苦參、黃龍膽等，以根入藥，是云南地方習(xí)用中草藥[5，6]，云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)于1974年和2005年版對此藥材進(jìn)行了收載[7]，也是納西族、白族和彝族等少數(shù)民族常用中藥，具有保肝鎮(zhèn)痛、清熱解毒的功效[8-10]，主要用來退燒、抗炎、治療胃痙攣、肺熱咳嗽、扁桃體炎、胃炎、腎炎、燒傷、跌打損傷等癥[11]，民間常用其治療支氣管炎、急慢性胃炎、腸炎、燒傷、胃脘脅痛等[12]，長期以來被云南當(dāng)?shù)丶{西族和傈僳族廣泛使用。本課題組前期研究表明金不換可以中和雪上一枝蒿的急慢性中毒[13，14]，二者配伍可能起到減毒增效/存效的作用。

本研究擬采用上下法(Up and Down法)與改良寇氏法分別測定雪上一枝蒿(CFA)與金不換(WVBF)合并與合煎配伍的急性毒性，以評價(jià)二者配伍前后的安全性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌雄各半的SPF級(jí)昆明小鼠，體重18～22 g，購于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2016-0089，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：NO.42816300001233，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證明編號(hào)：NO.00263059。飼養(yǎng)于SPF級(jí)小鼠實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物飼養(yǎng)嚴(yán)格按照中南民族大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)和國際NIH準(zhǔn)則進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，光照或者黑暗條件下讓老鼠自由進(jìn)食。為避免食物干擾，老鼠在實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。

1.2 藥物與試劑

雪上一枝蒿購于云南大理吉芹中藥材經(jīng)營部，金不換購自云南大理藥材市場周盛藥材行，由中南民族大學(xué)劉新橋博士鑒定為正品。其他試劑均為分析純。

雪上一枝蒿總生物堿和金不換合并合煎液的提取制備方法：將雪上一枝蒿的量固定為50 g，配伍組金不換分別為10 g、25 g、50 g、100 g和250 g，按5∶1、2∶1、1∶1、1∶2以及1∶5比例配伍，分別用5倍量75%乙醇回流提取30 min，4層紗布過濾，置于55 ℃下減壓濃縮至浸膏，冷凍干燥一夜得到供試品，置于干燥器中保存。精密稱取0.006 g上述各干燥物，加2 mL色譜級(jí)甲醇溶解后過0.45 μm濾膜，得到供試品溶液。

雪上一枝蒿和金不換合煎液高效液相色譜檢測條件：WondaSil C18-WR色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，日本島津)，流動(dòng)相甲醇-0.5%三乙胺(66∶34)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長240 nm，檢測時(shí)間0～40 min，進(jìn)樣10 μL。在色譜圖上依據(jù)對照品的保留時(shí)間，在樣品溶液的色譜圖上找到相應(yīng)對照品的譜圖峰。見圖1。

1-苯甲酰烏頭原堿；2-新烏頭堿；3-烏頭堿

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 改良寇氏法測雪上一枝蒿與金不換合煎配伍的LD50

2.1.1 預(yù)試驗(yàn) 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，先腹腔給藥找出每組的上、下限劑量Dmax和Dmin，即100%全死劑量和0%全活劑量(或陽性反應(yīng)的劑量)[15]。測得雪上一枝蒿單煎液組小鼠的100%和0%致死劑量分別約為450 mg·kg-1和200 mg·kg-1，金不換單煎液組100%致死劑量約為4 400 mg·kg-1，0%致死劑量約為1 800 mg·kg-1，雪上枝蒿與金不換5∶1配伍組100%致死劑量約為860 mg·kg-1，0%致死劑量約為400 mg.kg-1，2：1配伍組100%和0%致死劑量分別為1 750和750 mg·kg-1，1∶1配伍組100%致死劑量約為2 100 mg·kg-1，0%致死劑量約為900 mg·kg-1，1∶2配伍組100%和0%致死劑量約為2 000和800 mg·kg-1，1∶5配伍組100%和0%致死劑量約為4 000和1 500 mg·kg-1。

2.1.2 正式試驗(yàn) 設(shè)定劑量間的等比比值i為0.80，上一劑量依次乘以i向下一劑量遞減。取350只小鼠(雌雄各半)，根據(jù)不同配伍將小鼠隨機(jī)分為7組，即雪上一枝蒿和金不換兩個(gè)單煎液組，及雪上一枝蒿-金不換 5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5配伍組，根據(jù)濃度不同按每個(gè)濃度組10只小鼠的方式將每個(gè)藥物組隨機(jī)分為5小組，每組小鼠分別按上述等比數(shù)列濃度遞減的受試溶液以 0.02 mL·kg-1藥物劑量一次性腹腔注射。

2.2 上下法測雪上一枝蒿與金不換合并配伍的LD50

2.2.1 限度試驗(yàn)方法和結(jié)果 2 000 mg· kg-1劑量水平限度試驗(yàn)：先對1只小鼠進(jìn)行給藥，如果小鼠死亡，則進(jìn)行主試驗(yàn)；如果小鼠存活，依次對另外4只小鼠進(jìn)行給藥，小鼠總數(shù)為5只。如果在試驗(yàn)后期死亡1只小鼠，而其他小鼠存活，則停止對其他小鼠給予受試物，觀察全部動(dòng)物，在相同的觀察期內(nèi)是否也出現(xiàn)死亡。記錄試驗(yàn)期間所有死亡的動(dòng)物，對試驗(yàn)結(jié)果作如下評判：有3只或3只以上動(dòng)物死亡時(shí)，LD50小于2 000 mg· kg-1；有3只或3只以上動(dòng)物存活時(shí)，LD50大于2 000 mg· kg-1；如果有3只動(dòng)物死亡，則進(jìn)行主試驗(yàn)[16]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，雪上一枝蒿對雄性動(dòng)物的毒性更加明顯，不同性別老鼠對其敏感性不一樣，為了避免性別因素造成的干擾，只選擇了雄性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果：按雪上一枝蒿-金不換比例為10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10分別以2 000 mg/kg-1給藥7只雄性小鼠，7只小鼠死亡，進(jìn)行主試驗(yàn)。

2.2.2 主實(shí)驗(yàn) 默認(rèn)sigma(級(jí)數(shù)因子)被固定為0.5，相鄰高低劑量間的組距3.2，CFA與WVBF的配比如上，4個(gè)不同比例配伍的總劑量從以下序列中選擇：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2 000 mg· kg-1。若沒有待測藥物的估計(jì)致死量，則先從劑量175 mg· kg-1開始對第1只動(dòng)物進(jìn)行給藥，如果動(dòng)物沒有死亡，則對第2只動(dòng)物進(jìn)行高一劑量給藥；如果第1只動(dòng)物出現(xiàn)死亡或處于將死狀態(tài)，則對第2只動(dòng)物給予低一劑量的給藥。在此過程中每次僅對1只動(dòng)物給予藥物，時(shí)間至少間隔48 h再給另一只，并認(rèn)真記錄動(dòng)物的活動(dòng)。當(dāng)滿足停止實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)之一時(shí)：①在最高劑量下連續(xù)出現(xiàn)3只動(dòng)物存活；②6只動(dòng)物中出現(xiàn)5只連續(xù)出現(xiàn)在高一劑量死亡、低一劑量存活的生死轉(zhuǎn)換；③第1只動(dòng)物出現(xiàn)轉(zhuǎn)換后，至少保證有4只動(dòng)物能夠進(jìn)入試驗(yàn)，而且其LD50估算值的范圍超過臨界值(2.5倍)[17]。

2.2.3 指標(biāo)觀察 對小鼠給予受試物后，詳細(xì)記錄每組不同劑量下，在1、12、24、48及72 h小鼠的中毒反應(yīng)，并記錄小鼠死亡數(shù)，計(jì)算每組小鼠的LD50及其可信限，對死亡小鼠進(jìn)行大體解剖，肉眼觀察并對心、肝、脾、肺、腎、胃等器官做病理分析。

2.3 寇氏法計(jì)算方法

記錄各劑量組小鼠死亡數(shù)n，得出死亡率(P)，按改良寇氏法公式計(jì)算各組LD50值。

2.4 HE染色

大體檢查完畢，將每只動(dòng)物心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃切下，固定于10%甲醛溶液，常規(guī)制片，HE染色，鏡下觀察，做病理分析。

3 結(jié)果

3.1 雪上一枝蒿與金不換合煎配伍的急性毒性

雪上一支蒿單煎液腹腔給藥后，小鼠出現(xiàn)短暫的興奮狀態(tài)，30～60 min后，小鼠陸續(xù)進(jìn)入抑制狀態(tài)，部分小鼠出現(xiàn)反胃嘔吐、肌肉振顫等中毒癥狀，并且伴隨抽搐，肢體癱軟，大小便失禁等，隨著濃度的升高這種現(xiàn)象越明顯，最高劑量組1 h內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)死亡，根據(jù)12～72 h內(nèi)死亡情況求得各配伍組小鼠死亡情況如表1。小鼠各組的半數(shù)致死量，標(biāo)準(zhǔn)誤及95%的可信限結(jié)果如表2。其中雪上一枝蒿單煎液的毒性最大，金不換單煎液的毒性最小，并且隨著金不換比例的增加毒性越來越低，由于每組藥對中雪上一枝蒿的量是固定的，所以可知金不換對雪上一枝蒿的急性毒性具有解毒作用，解毒效果隨金不換比例的增高而增強(qiáng)，但是配伍比例為1∶1的毒性稍小于1∶2，可信限有重合的部分，可能是因?yàn)閯?dòng)物個(gè)體差異所致，但不影響整體趨勢。

表1 雪上一枝蒿及金不換各劑量組對小鼠急性毒性的影響

表2 LD50、lgLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤以及LD50的95%可信限計(jì)算結(jié)果

未死亡小鼠48 h內(nèi)精神狀態(tài)和活動(dòng)能力逐漸恢復(fù)正常。對死亡小鼠進(jìn)行大體解剖，臟器沒有發(fā)現(xiàn)明顯的異常病變，對5個(gè)配比組的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃做病理分析，病理結(jié)果：①心肌組織結(jié)構(gòu)基本正常，心肌細(xì)胞排列整齊有序，無明顯變性，組織無明顯炎癥；②肝臟組織整體結(jié)構(gòu)正?；蜉p度異常，少量肝細(xì)胞可見水腫，胞漿疏松，如黑色箭頭所示，組織無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；③脾組織整體結(jié)構(gòu)基本正常，脾小結(jié)結(jié)構(gòu)清晰，紅髓白髓界限分明，無明顯壞死，無明顯中性細(xì)胞浸潤；④肺組織結(jié)構(gòu)不清晰或輕度異常，部分肺泡萎縮塌陷，肺泡壁增厚，肺實(shí)質(zhì)化，如黑色箭頭所示，部分肺泡融合擴(kuò)張形成較大的囊腔，如紅色箭頭所示，組織無明顯炎性細(xì)胞浸潤；⑤腎組織整體結(jié)構(gòu)輕度異常，部分腎小管刷狀緣脫落，且管腔可見少量淡粉色蛋白液，如黑色箭頭所示，部分腎小管上皮細(xì)胞水腫，胞漿空泡化，如紅色箭頭所示，部分腎小管管腔可見蛋白液，如黃色箭頭所示，組織無明顯炎癥壞死變性；⑥胃組織整體結(jié)構(gòu)基本正常，黏膜層結(jié)構(gòu)正常，上皮細(xì)胞無明顯壞死脫落，組織無明顯炎癥。具體如圖2。

A.心；B.肝；C.脾；D.肺；E.腎；F.胃

3.2 雪上一枝蒿與金不換合并配伍的急性毒性

雪上一支蒿給藥后的小鼠大部分30 min內(nèi)呈現(xiàn)如下急性中毒癥狀：四處攀爬、來回走動(dòng)，呼吸及運(yùn)動(dòng)急促、急躁、打鬧等；30 min后逐漸歸于平靜，并且部分小鼠出現(xiàn)活動(dòng)能力減弱，行為遲緩、氣息薄弱、四肢不調(diào)、癱軟等現(xiàn)象。大多數(shù)小鼠在給藥后12 h內(nèi)出現(xiàn)異常反應(yīng)；6 h后部分有異常反應(yīng)的小鼠可逐漸恢復(fù)正常，之后每天觀察，隔天記錄體重，未出現(xiàn)中毒癥狀。

CFA-WVBF 5∶1、2∶1、1∶2、1∶5配伍組測算出的LD50分別為55.00、155.77、162.71、174.98 mg·kg-1，說明隨著WVBF比例的增加，毒性逐漸下降，因此1∶5配伍組的減毒效果最好。不同比例下小鼠的死亡情況見表3。

表3 CFA-WVBF對小鼠急性毒性的影響

4 討論

本研究上下法急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，CFA-WVBF四個(gè)比例5∶1、2∶1、1∶2、1∶5的LD50依次增加，分別為55.00、155.77、162.71、174.98 mg·kg-1，均大于單獨(dú)給CFA的LD50(37.991 mg/kg-1)[18]，說明CFA與WVBF配伍使用能降低CFA的毒性，同時(shí)隨著WVBF含量增多，減毒效果增強(qiáng)。

寇氏法急性毒性實(shí)驗(yàn)通過病理切片可觀察到各組死亡小鼠的心、肝、脾、胃等臟器組織整體結(jié)構(gòu)基本正常，肺和腎臟整體結(jié)構(gòu)輕度異常，各臟器組織均無炎性細(xì)胞浸潤，沒有明顯炎癥，說明藥物對小鼠急性毒性的臟器未造成明顯影響。CFA-WVBF 5個(gè)配伍組(5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5)測得的LD50分別為526.38、1 047.48、1 437.05、1 242.37和2 280.51 mg·kg。介于雪上一枝蒿(275.29 mg·kg)和金不換(2 618.70 mg·kg)兩個(gè)單煎液的LD50之間，說明合煎配伍與雪上一枝蒿單煎液相比可以明顯降低其誘導(dǎo)的急性毒性，并且金不換的比例越高解毒效果越好。

通過試驗(yàn)可以得出如下結(jié)論：雪上一枝蒿與金不換無論合并還是合煎配伍都降低了對小鼠的急性毒性，并且金不換比例越高解毒效果越好，為進(jìn)一步確定兩者配伍后的藥效提供了依據(jù)。