延胡索乙素在氣虛大鼠皮膚上的滲透動力學研究

梁慶，王暉

(1.廣東安健醫(yī)藥有限公司，廣東 廣州 510224； 2.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

氣虛證是臨床常見證型，影響體內多個組織、系統，與多種疾病相關，多由久病體虛、勞累過度、年老體弱、營養(yǎng)不良等原因引起，主要臨床表現有少氣懶言、神疲乏力、頭暈目眩、自汗等，活動時諸癥加劇，舌淡苔白、脈虛無力等[1-2]。近年來，對氣虛證的研究主要集中在臨床表現的量化評分、免疫指標的變化、呼吸和循環(huán)功能檢測等方面，而對于氣虛證對皮膚的影響較少涉及。本研究通過游泳疲勞法制造氣虛模型，考察模型藥物延胡素乙素在氣虛動物皮膚上的滲透動力學情況，為經皮給藥制劑在氣虛證患者的使用提供指導。

1 材料與方法

1.1 動物

SD大鼠，SPF級，雄性，體質量(300±20)g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK粵2016-0041。

1.2 藥品與試劑

延胡索乙素(湛江南國藥廠惠贈，批號：160109，質量分數：99.5%)；延胡索乙素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110726-2010)；無水乙醇(廣州化學試劑廠，分析純)。

1.3 儀器

UV-1800紫外分光光度計(北京瑞利儀器有限公司)；THZ-82型水浴恒溫振蕩器(金壇市宏華儀器廠制造)；FEJ-H3000電子天平(福州富日衡之寶電子有限公司)；YP102N型電子天平(上海恒平科學儀器有限公司)；透皮擴散裝置(自制)；RM2235手動轉輪切片機(德國徠卡)；EG1160包埋機(德國徠卡)；IX51倒置光學顯微鏡(日本Okympus公司)。

1.4 延胡索乙素質量分數測定方法[3]

1.4.1 檢測波長的確定 取質量分數1%延胡索乙素的95%(體積分數，下同)乙醇溶液，以95%乙醇為參比溶液，于200～400 nm波長掃描延胡索乙素紫外吸收光譜，結果顯示在281 nm波長處有最大吸收值，故選取281 nm作為檢測波長。

1.4.2 標準曲線的制備 精密稱定延胡索乙素對照品0.051 3 g，用95%乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中作為儲備液。精密量取以上儲備液1.5、2.5、4.0、5.0、6.0 mL分別置于100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，即得質量濃度為15.39、25.65、41.04、51.30、61.56 μg/mL延胡索乙素對照品溶液。在281 nm波長下測定各溶液的吸光度(A)，得回歸方程A=0.014 3ρ-0.000 1，r=0.999 0，線性范圍為15.39～61.56 μg/mL。

1.4.3 方法學試驗[4]

1.4.3.1 精密度試驗 取質量濃度為41.04 μg/mL的延胡索乙素對照品溶液，連續(xù)測定5次，測定吸光度，計算RSD值。結果顯示，RSD值小于2%，說明儀器精密度良好。

1.4.3.2 穩(wěn)定性試驗 取質量濃度為41.04 μg/mL的延胡索乙素對照品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h測定吸光度，計算RSD值。結果顯示，RSD小于2%，說明樣品在室溫下放置24 h內穩(wěn)定。

1.4.3.3 回收率試驗 精密量取“1.4.2”項下儲備液1.5、3.0、6.0 mL，分別置于100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，得質量濃度為15.39、30.78、61.56 μg/mL的樣品溶液，測定吸光度，計算回收率及RSD值。結果顯示，回收率在95%～105%之間，RSD小于2%，說明測定方法準確、可靠。

1.5 透皮吸收試驗方法

1.5.1 大鼠分組及氣虛模型的建立[5]大鼠適應性飼養(yǎng)3 d，隨機分成正常組與氣虛組。正常組常規(guī)飼養(yǎng)；氣虛組控制食量，每天8:00～20:00正常給食，20:00～次日8:00不給食，每天14：00將大鼠放進恒溫水槽[水溫(32±2)℃，水深45 cm]中游泳，當出現自然沉降時從水槽中撈出，有60%以上的大鼠出現自然沉降時全部撈出，連續(xù)進行2周，完成造模。造模完成后，觀察并對比正常大鼠與氣虛大鼠的外觀表現；通過制備病理切片，從微觀角度對比正常皮膚與氣虛皮膚的特點。

1.5.2 離體皮膚的制備 氣虛大鼠和正常大鼠分別用手術剪刀將背部的毛剪短，再用電動剃須刀剃至無毛狀態(tài)，用溫水洗凈皮膚，繼續(xù)適應性飼養(yǎng)24 h。24 h后麻醉處死，剝取背部皮膚，選擇無肉眼可見傷痕的皮膚，去除皮下脂肪，用生理鹽水反復沖洗，直至無混濁為止，放-4 ℃冰箱中保存，于第2天使用。

1.5.3 釋放液和接收液的制備 釋放液的制備：精密稱取延胡索乙素0.104 2 g，溶解于10 mL 95%乙醇中，避光保存。接收液為20%乙醇生理鹽水溶液。

1.5.4 透皮試驗[6]上述大鼠皮膚，常溫下解凍，在雙室透皮擴散裝置進行體外透皮實驗。大鼠皮膚固定于樣品池與接收池之間，角質層面向樣品池，樣品池注入釋放液0.1 mL，接收池注入接收液5 mL，溫度為(32.0±1.0) ℃，振速為120 次/min，擴散面積為0.502 cm2。在2、4、8、12、24 h 分別取接收液4.0 mL(每次取樣后補回等量的接收液)，樣品經適當稀釋后在281 nm波長下測定吸光度，代入回歸方程計算濃度，再按下式算出不同時間段的累積滲透量(Q)：

式中：Q為累積滲透量，Cn為第n個取樣點的藥物濃度(mg/L)；Ci為第i個取樣點的藥物濃度(mg/L)；A為擴散面積(cm2)。

以累積滲透量(Q)對時間(t)進行線性回歸擬合，所得的方程斜率即為透皮速率(Kp)。

1.6 大鼠皮膚的病理切片(石蠟切片法)[8]

分別取正常大鼠和氣虛大鼠背部皮膚，剪成2 mm×2 mm的片狀，浸泡于5%的中性甲醛溶液中保存。按常規(guī)方法進行HE組織切片，在顯微鏡下觀察。

1.7 數據處理

2 結果

2.1 正常大鼠與氣虛大鼠的形態(tài)比較

2.1.1 正常大鼠與氣虛大鼠外觀比較 造模過程中，正常大鼠活動次數多，精神良好，反應較為敏捷，糞便體積大，排便次數少；而氣虛大鼠相對活動次數少，反應較為遲鈍，糞便體積小，排便次數多。造模后，正常大鼠毛色油亮，呈淡黃色，皮膚油脂較多，而氣虛大鼠毛色枯燥、偏白，皮膚油脂少。正常大鼠離體皮膚較厚，毛孔大、多且密，含有大量油脂，呈粉紅色；氣虛大鼠離體皮膚較薄，毛孔小、少且疏，油脂較少，皮膚顏色較正常組淺。

2.1.2 正常大鼠與氣虛大鼠體質量比較 正常大鼠與氣虛大鼠造模前后的體質量變化情況見表1?？梢?，正常組大鼠在造模前后的體質量沒有明顯變化，而氣虛組大鼠的體質量在造模前后的差異具有統計學意義(P<0.05)；造模后，氣虛組大鼠和正常組大鼠的體質量差異也具有統計學意義(P<0.01)。

表1 造模前后大鼠體質量的比較

組別造模前造模后正常組305.5±15.8317.5±10.1氣虛組304.6±14.7212.8±6.9?##

與造模前比較：*P<0.05；與正常組比較：##P<0.01。

2.1.3 氣虛大鼠與正常大鼠離體皮膚微觀結構比較 從圖1可見，顯微鏡下正常鼠皮上皮細胞排列較為疏松，細胞間隙較大，上皮組織薄，脂肪等吸水性物質較多，脂肪層厚；氣虛鼠皮相對正常鼠皮其上皮組織細胞排列緊密，脂肪較少。

A.正常大鼠皮膚； B.氣虛大鼠皮膚。

圖1氣虛大鼠與正常大鼠離體皮膚的微觀結構(100×)

Figure1Microstructure of skininvitroof Qi deficiency rats and normal rats(100×)

2.2 延胡索乙素的透皮效果

延胡索乙素在正常大鼠和氣虛大鼠皮膚上的累積滲透量與透皮速率結果見表2?？梢?，氣虛大鼠皮膚及正常大鼠皮膚的滲透系數分別為(97.6±8.6) μg/(cm2·h)和(188.3±10.7) μg/(cm2·h)，氣虛組的滲透系數顯著低于正常組(P<0.01)。

表2 延胡索乙素在正常大鼠和氣虛大鼠皮膚上的透皮效果

組別Q/(μg·cm-2)2 h4 h8 h12 h24 hKP/(μg·cm-2·h-1)正常組1 783.4±87.02 268.1±139.82 832.0±207.73 338.3±322.84 011.6±318.5188.3±10.7氣虛組940.4±89.21 113.7±86.61 294.4±110.11 432.5±123.61 683.6±140.997.6±8.6??

與正常組比較：**P<0.01。

3 討論

氣虛包括脾、肺氣虛，是指在疾病過程中，氣的生化不足或耗散太過而致氣的虧損，從而使臟腑組織功能活動減退，抗病能力下降的病理狀態(tài)，可以出現在任何臟腑組織[9]。中醫(yī)認為脾胃為后天之本、氣血化生之源，人體臟腑器官、營衛(wèi)經絡、形體官竅、肌膚皮毛無不仰仗脾胃。脾胃健旺水谷精微化源充足，精氣充盛，臟腑功能強盛，則形健神旺，面色紅潤；若脾胃衰老化源不足，則五臟無以養(yǎng)，氣血日衰，臟腑虛損，導致衰老，皺紋橫生；另一方面，脾胃衰弱，則痰濁瘀血內生，加速衰老而面色晦暗[10]。

《素問·五臟生成篇》說：“肺之合皮也，其榮毛也，其主心也”、“肺主皮毛”、“肺合皮毛”及“肺生皮毛”等都體現了肺與皮毛之間的關系?！捌っ睘橐簧碇恚饕珊瓜?、皮膚與毫毛等組織組成，主要對汗液分泌、水液代謝及呼吸和抵御外邪之功能起調節(jié)作用，是人體中一個強大的免疫器官，助人體抵抗外邪[11-12]?！鹅`樞》所云“肺氣弗營，則皮毛焦，皮毛焦則津液去，津液去則皮枯毛折”[10]，可見氣虛可導致皮膚結構的改變。

皮膚角質層由角質細胞和其間的脂質組成，是多層致密的膜結構，二者共同維持皮膚正常的屏障功能。角質細胞間排列緊密，對水分及一些化學物質具有屏障作用，防止水分的蒸發(fā)。有人將角質層形象地比喻為用磚砌成的墻，角質細胞與脂質構成一道致密的屏障而阻止藥物等外界因素對其的影響。本研究發(fā)現正常鼠皮上皮細胞排列較為疏松，細胞間隙較大，上皮組織薄，脂肪層厚；氣虛鼠皮相對正常鼠皮其上皮組織細胞排列緊密，脂肪較少，說明氣虛導致了皮膚結構的改變。本研究以延胡索乙素為模型藥物，對其在正常皮膚和氣虛模型皮膚上的滲透性差異進行了研究，結果顯示，氣虛模型大鼠皮膚的滲透系數顯著低于正常大鼠的(P<0.01)，表明氣虛導致了皮膚結構的改變，對延胡索乙素的滲透有阻滯作用。