飼草型高羊茅引進(jìn)品種的表型變異分析

伍文丹，雷 雄，趙文達(dá)，楊曉鵬，熊 毅，熊艷麗，張新全，馬 嘯

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川 成都 611130；2. 四川省草業(yè)技術(shù)研究推廣中心，四川 成都 610041；3. 四川省草原科學(xué)研究院，四川 成都 611731）

高羊茅(Festuca arundinacea)，又稱葦狀羊茅，是世界溫帶地區(qū)廣泛生長的主要冷季型多年生草本植物[1]。其自然種群分布在歐洲、非洲西北部、北美洲、西亞和中亞的溫帶地區(qū)[2]。相對于多年生黑麥草等其他冷季型禾草，它具有生長旺盛、對土壤和氣候的廣泛適應(yīng)性、對氮肥敏感、高度耐牧性、以及生長季利用時間長等特點[3]。在全球氣候變暖的情況下，高羊茅相對較強的耐旱性使得它在溫帶和亞熱帶之間的過渡性氣候帶(包括我國長江中下游地區(qū))中的栽培需求大大增加[3-5]。按其功能劃分，高羊茅一般分為飼草型和草坪型兩類，其中飼草型高羊茅的顯著特點是葉片粗糙、直立生長和植株高大[6]，可用作長期放牧草地的優(yōu)良牧草，能與其他禾草或豆科牧草混播，可作為牛、馬、羊飼養(yǎng)及作為其他反芻家畜的維持口糧。高羊茅是異花授粉的異源六倍體(2n = 6x =42)，基因組組成為PPG1G1G2G2，具有高度的自交不親和性[7]。這些特點使得育種工作通常集中于發(fā)展優(yōu)良綜合品種或改良異質(zhì)群體，這兩種群體都由遺傳上具有許多共同特征的獨特個體組成[7]。20世紀(jì)40年代以來，在北美和歐洲地區(qū)，500多個高羊茅品種得以選育和釋放[8]，其中牧草型高羊茅約有130個[3]。

對種質(zhì)資源進(jìn)行詳細(xì)的形態(tài)和農(nóng)藝性狀描述是對其有效利用的前提。由于所有的羊茅屬物種具有高度異花授粉和自交不親和的特點，在群體內(nèi)和群體中的個體之間表現(xiàn)出高度的遺傳異質(zhì)性。因此，一般利用增加群體中有利等位基因頻率的方法來進(jìn)行品種選育，包括對生態(tài)型或育種群體的表型混合選擇法及綜合品種選育法[3]。綜合品種通常使用半同胞或全同胞家系進(jìn)行后代測試后從親本無性系中構(gòu)建[9]。由于牧草產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、牧草品質(zhì)等重要的農(nóng)藝性狀均為數(shù)量遺傳位點控制，故而表型評價對于設(shè)計有效的選擇育種程序非常重要[9]。利用這些表型數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步獲得關(guān)于遺傳變異、遺傳力、基因型和環(huán)境相互、性狀相關(guān)性和遺傳進(jìn)度預(yù)測的信息[7]。Veronesi和Falcinelli[10]利用多元分析法基于12個表型性狀數(shù)據(jù)描述了意大利高羊茅自然群體間的豐富的表型變異。Chtourou-Ghorbel等[11]發(fā)現(xiàn)突尼斯高羊茅自然群體的表型多樣性受到基因型和環(huán)境互作的強烈影響。Majidi等[7]研究了高羊茅半同胞家系的遺傳變異、遺傳力及遺傳相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)株高、干草產(chǎn)量具有較高的狹義遺傳力。

目前我國登記利用的高羊茅飼草型品種中，引進(jìn)品種占據(jù)絕大多數(shù)，因此對高羊茅優(yōu)良種質(zhì)資源的引進(jìn)、評價和篩選，對于選育擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)飼用型高羊茅品種有重大促進(jìn)作用。本研究將采用簡單相關(guān)分析、方差分析、主成分分析、聚類分析對引種自美國植物種質(zhì)資源庫(National Plant Germplasm System of USDA, NPGS)的19份飼草型高羊茅品種的株高、旗葉長寬、莖粗等14個表型性狀進(jìn)行考察，以期為亞熱帶中高海拔地區(qū)篩選優(yōu)質(zhì)品種提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于四川省雅安市四川農(nóng)業(yè)大學(xué)基地，地 理 坐 標(biāo) 38°08′ N， 103°14′ E， 海 拔 620 m，屬北亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)。年均氣溫16.2 ℃，最冷月(1月)到最熱月(7月)之間的均溫變化為6.1到25.3 ℃，全年最高氣溫37.7 ℃，年降水量1 774.4 mm，年蒸發(fā)量1 011.2 mm，相對濕度79%，日照時數(shù)1 039.6 h，無霜期304 d，＞ 10 ℃年積溫5 231 ℃·d。試驗地系白堊灌口組紫色砂頁巖風(fēng)化的堆積物形成的紫色土，土質(zhì)黏重，pH 6.5。全量養(yǎng)分N、P、K的含量分別為0.14%、0.25%、2.66%，速效養(yǎng)分分別為 83.1、25.5、97.2 mg·kg-1。

1.2 試驗材料和田間小區(qū)

供試高羊茅品種種子來源于美國農(nóng)業(yè)部植物種質(zhì)庫(NPGS)，共19份飼草型高羊茅品種(表1)。每份高羊茅品種取50粒種子進(jìn)行發(fā)芽，發(fā)芽方法為，每個品種的單一種子被放在一層濾紙上，濾紙用水浸泡在培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿在20 ℃下置于黑暗中，直到發(fā)芽。發(fā)芽后將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱中，設(shè)置光周期 14 h，光照強度 300 μmol·(m2·s)-1，光周期溫度22 ℃，暗周期10 h，暗周期溫度18 ℃。2015年9月，將在光照培養(yǎng)箱里發(fā)芽并培養(yǎng)兩周的參試高羊茅植株通過穴播移栽至田間小區(qū)。田間小區(qū)采取隨機區(qū)組設(shè)計，每份高羊茅品種種植3個小區(qū),小區(qū)面積為1.2 m × 1 m，每小區(qū)12株，株行距為30 cm，試驗期間不施肥，適時進(jìn)行除雜和澆水。

表1 供試高羊茅高羊茅品種Table 1 Tall fescue cultivars used in this study

1.3 測定指標(biāo)及方法

2016 - 2017年的春季，在抽穗開花期和成熟期主要觀察測定了14個形態(tài)和農(nóng)藝指標(biāo)(表2)。測定時，每份品種的3個重復(fù)小區(qū)各選取5個單株，合計15株，每個性狀同一單株選取相近分蘗枝重復(fù)測量3次。各性狀均為兩年度的品種內(nèi)單株的均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

獲得性狀指標(biāo)數(shù)據(jù)后，使用DPS 14.5軟件[12]計算各個性狀指標(biāo)的平均值(mean)、最大值(max.)、最小值(min.)和變異系數(shù)(CV，CV = S/，式中，S為標(biāo)準(zhǔn)差，為單個性狀的平均值)。利用性狀指標(biāo)數(shù)據(jù)基于Pearson相關(guān)系數(shù)檢測對各性狀間的相關(guān)性和顯著性進(jìn)行評估；綜合各個性狀進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)：將各性狀的平均值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化(減去平均值再除以標(biāo)準(zhǔn)差)后用于創(chuàng)建相關(guān)系數(shù)矩陣，再用于計算和提取能夠代表供試樣本大部分變異的主成分(特征向量)；利用NTSYS 2.21軟件進(jìn)行基于樣本間歐氏距離的UPGMA聚類分析[13]，根據(jù)UPGMA聚類樹矩陣計算計算其協(xié)表征矩陣(cophenetic matrix)，然后再利用Genlex 6.5軟件進(jìn)行Mantel檢驗，以評估聚類結(jié)果與GS矩陣的符合度[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 表型性狀的描述性分析

在植物育種中，對種質(zhì)資源各個表型性狀進(jìn)行變異系數(shù)統(tǒng)計評價是至關(guān)重要一步[15-16]，在育種工作中，各種質(zhì)資源形態(tài)性狀的變異系數(shù)越高，種質(zhì)資源群體的變異潛力就越大，也越能篩選出優(yōu)良品種。Lou等[17]選取31份美國高羊茅品種形態(tài)性狀綜合評價表明，美國高羊茅種質(zhì)資源形態(tài)性狀的變異較高。本研究對19份飼草型高羊茅品種的14個性狀指標(biāo)的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示(表3)，各性狀指標(biāo)在品種間變異系數(shù)的變化范圍為9.1%～46.9%，所有性狀變異系數(shù)平均值為23.45%，變異系數(shù)依次為節(jié)數(shù) ＜ 株高 ＜ 莖粗 ＜ 小穗數(shù) ＜ 千粒重 ＜花序長 ＜ 旗葉長 ＜ 小花數(shù) ＜ 節(jié)間長 ＜ 旗葉寬 ＜ 單株干重 ＜ 分蘗數(shù) ＜ 營養(yǎng)枝數(shù) ＜ 單株鮮重。一般認(rèn)為，當(dāng)樣本間有明顯差異時，性狀變異系數(shù) ＞ 10%[18]，而14個性狀指標(biāo)變異系數(shù)中只有節(jié)數(shù)小于10%，說明參試品種間各個性狀差異明顯，類型豐富，有利于高羊茅品種的比較和篩選。此外，參試品種的單株鮮重(CV = 46.9%)和營養(yǎng)枝(CV = 45.3%)的變異系數(shù)最大，表明參試品種在產(chǎn)草量性狀上具有很高潛力，有利于選擇高產(chǎn)品種及用于高產(chǎn)育種的親本材料[19]。

表2 形態(tài)性狀及測量標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Morphological and agronomic traits and measurement standards

表3 參試高羊茅品種表型性狀數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 3 Descriptive statistics for 14 phenotypic traits of studied tall fescue cultivars

植株形態(tài)性狀指標(biāo)間往往具有復(fù)雜相關(guān)性，了解表型性狀指標(biāo)間的相關(guān)性有助于評價高羊茅種質(zhì)[20]。利用Pearson系數(shù)對19份引進(jìn)飼草型高羊茅品種的表型性狀進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)各性狀間存在顯著相關(guān)性(表4)。其中，株高與旗葉長(r =0.645, P ＜ 0.01)、單株干重 (r = 0.578, P ＜ 0.01)極顯著正相關(guān)，與單株鮮重(r = 0.551, P ＜ 0.05)顯著正相關(guān)，而與莖粗和小花數(shù)則負(fù)相關(guān)，這在其他禾本科類植物，如水稻（Oryza sativa）[21]、多花黑麥草（Lolium multiflorum）[19]上有相似結(jié)果。旗葉長與單株干重 (r = 0.524, P ＜ 0.05)和節(jié)間長 (r = 0.468, P ＜0.01)顯著正相關(guān)，與莖粗較為明顯的負(fù)相關(guān)。旗葉寬與莖粗(r = 0.625, P ＜ 0.01)、小穗數(shù)(r = 0.771,P ＜ 0.01)極顯著正相關(guān)，與營養(yǎng)枝數(shù)(r = 0.499, P ＜0.05)顯著正相關(guān)。營養(yǎng)枝數(shù)與分蘗數(shù)(r = 0.934, P ＜ 0.01)極顯著正相關(guān)。莖粗與小穗數(shù)(r = 0.550, P ＜0.05)和小花數(shù)(r = 0.646, P ＜ 0.01)分別顯著正相關(guān)與極顯著正相關(guān)。結(jié)果表明，植株越高大，旗葉越長，產(chǎn)草量性狀就表現(xiàn)越好；植株莖稈越粗壯，旗葉越寬，生殖性狀就表現(xiàn)越好，同時，株高與莖粗呈現(xiàn)一定程度的負(fù)相關(guān)（r = -0.345），這與Chtourou-Ghorbel等[11]對35份突尼斯地區(qū)高羊茅進(jìn)行農(nóng)藝評價的結(jié)果相似。

2.2 主成分分析與聚類分析

利用主成分分析法分析19份參試品種14個性狀指標(biāo)并提取主成分，提取標(biāo)準(zhǔn)為特征值大于1[22]，結(jié)果表明前5個主成分累計貢獻(xiàn)率已達(dá)到82.7%(表5)，因此測定的14個性狀指標(biāo)的總信息量可以由這5個主成分概括。其中，第1個主要成分的貢獻(xiàn)率為27.44%，特征值為3.84，表現(xiàn)明顯的性狀是旗葉寬、小穗數(shù)和單株干重；第3個主要成分的貢獻(xiàn)率為23.11%，特征值為3.24，表現(xiàn)明顯的性狀是株高、旗葉長和單株干重；第3個主成分的貢獻(xiàn)率為15.26%，特征值為2.14，表現(xiàn)明顯的性狀是節(jié)數(shù)、花序長和小花數(shù)；第4個主要成分的貢獻(xiàn)率為8.71%，特征值為1.22，表現(xiàn)明顯的性狀是千粒重和節(jié)數(shù)；第5個主成分的貢獻(xiàn)率為8.17%，特征值為1.14，表現(xiàn)明顯的性狀是節(jié)間長、花序長和千粒重。5個主成分綜合來看，代表和反映了參試品種的植株高矮、葉片大小、花序結(jié)構(gòu)、產(chǎn)草量及種子質(zhì)量等特征，是造成參試品種形態(tài)變異的主要因素，可以利用這5個主成分對19份參試品種進(jìn)行綜合評價。此外，第一主成分和第二主成分的二維圖(圖1)反映了參試品種的分組模式，本研究發(fā)現(xiàn)19份參試品種除Fawn和Kenwell外可以被分成兩類。

表4 各表型性狀間的簡單相關(guān)分析Table 4 Bivariate correlation analysis of 14 phenotypic traits

表5 主成分分析結(jié)果匯總Table 5 Summary of principal component analysis for studied tall fescue cultivars

應(yīng)用類平均法UPGMA將19份引進(jìn)飼草型高羊茅的14個形態(tài)性狀指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，并建立聚類樹狀圖。結(jié)果表明，19份品種間歐氏遺傳距離變幅為19.9～137.6，在歐氏遺傳距離取平均值為65.9時，19個參試品種除Fawn和Kenwell外可被分為兩大類，分類結(jié)果與主成分分析得到的分類結(jié)果一致(圖1)：類群Ⅰ包含Kenhy、Safe、Forager、Penngrazer、Nanryo、Martin、Willamet、Missouri-96、Johnstone、Cattleclub共10種品種，類群Ⅱ包含Barcel、Alta、 Kentucky31、 Autriumph、 Carefree、 Cajun、Maximize共7個種品種。基于聚類樹狀圖矩陣計算的協(xié)表征矩陣(Cophenetic matrix)與基于14個形態(tài)指標(biāo)計算的歐式距離矩陣之間的Mantel檢驗顯示兩者顯著正相關(guān)(r2= 0.490 9, P = 0.01)，表明聚類結(jié)果與歐氏距離矩陣的符合度較高(圖2)。

對類群Ⅰ和類群Ⅱ品種的各性狀指標(biāo)進(jìn)行t檢驗(表6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有營養(yǎng)枝數(shù)、分蘗數(shù)和小花數(shù)差異極顯著(P ＜ 0.01)。其中，類群Ⅱ品種的營養(yǎng)枝數(shù)和分蘗數(shù)性狀的表現(xiàn)遠(yuǎn)優(yōu)于類群Ⅰ品種，表明類群Ⅱ品種無性擴繁的能力優(yōu)于類群Ⅰ品種；小花數(shù)屬于植物生殖性狀，在小花數(shù)性狀的表現(xiàn)上，類群Ⅰ品種表現(xiàn)更好，表明類群Ⅰ品種可能在種子繁育方面更有優(yōu)勢。品種Fawn和Kenwell在聚類結(jié)果中各自獨立出來，F(xiàn)awn品種的特點為葉片較小，分蘗數(shù)、小穗數(shù)、小花數(shù)以及千粒重均低，表明它產(chǎn)草量小，種子繁育能力也低，在西南農(nóng)區(qū)表現(xiàn)較差；品種Kenwell葉片狹長，分蘗旺盛，小穗數(shù)與小花數(shù)均比較高，但千粒重表現(xiàn)差。

圖1 基于表型性狀的高羊茅品種的主成分得分二維圖Figure 1 Principal component score plot of 19 tall fescue cultivars by 14 phenotypic descriptors

圖2 基于表型性狀的參試高羊茅品種的聚類分析Figure 2 Clustering Analysis of studied tall fescue cultivars based on phenotypic traits

表6 利用t檢驗比較參試高羊茅品種兩個類群的性狀值Table 6 Comparison of the character values of two groups of tall festuca cultivars by T-test

兩個類群間的部分性狀的顯著差異說明聚類結(jié)果可以一定程度上反映參試品種的特點及表型差異，但是大部分性狀在兩個類群間并無顯著差異，這與表型數(shù)量性狀數(shù)量較少、易受環(huán)境影響有關(guān)，加上人工選育絕大多數(shù)為直立、高產(chǎn)等方向上的選擇育種，導(dǎo)致供試品種的形態(tài)差異較小。另外，高羊茅為典型的異花授粉植物且自交不親和[7]，各品種群體間遺傳相似性較高也可能是導(dǎo)致表型差異較小的原因。因此，一方面需要繼續(xù)擴大參評參試種質(zhì)數(shù)量，進(jìn)行多年多點的評價，另一方面還要結(jié)合生理代謝、分子標(biāo)記等方面的研究，對飼草型高羊茅種質(zhì)資源進(jìn)行更全面精準(zhǔn)的篩選鑒定和育種潛力評估。

3 結(jié)論

豐富的牧草種質(zhì)資源是選育優(yōu)質(zhì)牧草的重要條件。本研究中，參試的19份引進(jìn)飼草型高羊茅品種在部分表型性狀上表現(xiàn)出豐富的變異，有利于新品種的篩選與培育。遺傳變異最大的兩個性狀指標(biāo)分別是單株鮮重與營養(yǎng)枝，可以在飼草型高羊茅選育中考慮將這兩者作為主要目的性狀進(jìn)行篩選評價。參試品種可分為兩大類，Ⅱ類群內(nèi)10份品種具有分蘗旺盛、營養(yǎng)枝數(shù)多等特點，Ⅰ類群內(nèi)7份品種小花數(shù)更多，則更適用于種子生產(chǎn)。