PEG引發(fā)紫花苜蓿種子的最優(yōu)處理方案

趙曉晨，田 雨，張紅香

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2. 中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130102）

紫花苜蓿(Medicago sativa)作為優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的多年生豆科牧草，常作為草地補(bǔ)播、建植栽培草地和草田輪作的首選牧草。在國(guó)家政策的推動(dòng)下，苜蓿產(chǎn)業(yè)在畜牧業(yè)發(fā)展、推進(jìn)種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、“糧改飼”和“種養(yǎng)結(jié)合”模式試點(diǎn)中發(fā)揮著越來(lái)越大的作用。由于苜蓿主要種植區(qū)大多處于干旱半干旱地區(qū)，且無(wú)灌溉設(shè)施，特別是春播時(shí)氣溫低，降水量少且不確定性強(qiáng)；加之苜蓿種子生產(chǎn)存在諸多限制因素[1]，導(dǎo)致市場(chǎng)上流通的種子存在純凈度差，發(fā)芽率低的現(xiàn)象，國(guó)產(chǎn)牧草種子市場(chǎng)流通的草種合格率不到60%[2]。因此，提高苜蓿種子及幼苗的抗旱性已成為干旱半干旱地區(qū)苜蓿栽培利用的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

種子引發(fā)(seed priming)是在一定的控制條件下使種子緩慢的吸收水分膨脹，為種子萌發(fā)提前進(jìn)行生理準(zhǔn)備的一種種子播前預(yù)處理技術(shù)。種子引發(fā)能夠產(chǎn)生“引發(fā)記憶”，不僅能夠打破種子的休眠，提高種子發(fā)芽速度和整齊度，還能提高種子幼苗的抗逆性[3-8]。常用的液體引發(fā)劑包括水、鹽(NaCl、KNO3、H2O2等)、PEG、植物激素 (GA、ABA等)。已有研究結(jié)果證實(shí)，種子引發(fā)能夠促進(jìn)種子的發(fā)芽、幼苗出土以及作物產(chǎn)量。但已有研究主要集中在紫花苜蓿種子引發(fā)的最適條件等[9]，且多集中于引發(fā)作用的定性研究，而不同的苜蓿品種的引發(fā)條件尚需優(yōu)化。

種子的活力是一個(gè)復(fù)雜的屬性，活力的高低決定了幼苗在不同生境中出土的均勻度，種子的萌發(fā)關(guān)系到種苗的建植能否成功，種苗生長(zhǎng)可利用的水熱資源也受到種子萌發(fā)速率的影響。種子的活力受種子的壽命、遺傳因素、貯藏條件等因素的影響[4,10]。PEG (聚乙二醇)的主要功能是減緩種子在萌發(fā)初期吸收水分的速率，減少種子在吸收水分的過(guò)程中膜系統(tǒng)受到的損傷和對(duì)受損膜系統(tǒng)的修復(fù)[11]，激活體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等在內(nèi)的多種保護(hù)酶的啟動(dòng)，但在使用PEG的分子量、PEG濃度、浸種時(shí)間以及浸種溫度上也都存在著多種差異[12]。

因此，本研究通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化PEG引發(fā)紫花苜蓿種子萌發(fā)的最優(yōu)處理方案，以期為紫花苜蓿種子在退化草地和栽培草地建植中提供可行的種子預(yù)處理方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料選用公農(nóng)一號(hào)紫花苜蓿(Medicago sativa‘Gongnong No.1’)，種子由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院草地所提供，試驗(yàn)前于4 ℃貯藏。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引發(fā)方法

以PEG為引發(fā)劑，設(shè)置不同的PEG濃度(5%、10%、15%)、浸泡時(shí)間(12、24、36 h)及浸泡溫度(10、15、20 ℃)為試驗(yàn)因素(表1)，將5 g種子置入廣口瓶中，按表2的組合分別加入PEG溶液，使種子完全浸沒(méi)在溶液里，立即搖晃以使種子與PEG溶液均勻接觸，以保證種子能夠引發(fā)充分，而后將廣口瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行引發(fā)。在引發(fā)期間，每隔2 h將廣口瓶從培養(yǎng)箱中取出，輕輕搖晃，以確保種子能夠均勻地吸收水分[13]。引發(fā)結(jié)束后，將引發(fā)好的種子倒出，用蒸餾水將種子表面的引發(fā)劑充分沖洗干凈，平鋪置濾紙上，室內(nèi)(室溫18.7 ℃，濕度38%)回干直至種子的初始含水量(5.66%)，回干后立即進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。

表1 PEG 6000引發(fā)試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of PEG 6000 priming test

表2 L9 (33)正交表頭設(shè)計(jì)Table 2 L9 (33) orthogonal header design

1.2.2 發(fā)芽試驗(yàn)

按表2對(duì)種子進(jìn)行處理，每個(gè)培養(yǎng)皿50粒，4次重復(fù)，以未引發(fā)處理為對(duì)照 。置于10～15 ℃(春季播種的土壤溫度)的人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)，18 h/6 h(光照/黑暗)。每天計(jì)數(shù)發(fā)芽數(shù)，胚根突出種皮2 mm視為發(fā)芽，第7天測(cè)量幼苗根長(zhǎng)與苗長(zhǎng)，每皿隨機(jī)取10株進(jìn)行測(cè)量，并計(jì)算平均值。在第14天時(shí)統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)皿中的正常和不正常苗、死種子、新鮮種子及種子的硬實(shí)數(shù)。

最終發(fā)芽率 = 發(fā)芽終期全部正常種苗數(shù)/(供試種子數(shù) - 種子的硬實(shí)數(shù)) × 100%；

發(fā)芽速度(timson index) = 。

目前,通過(guò)水下機(jī)器人的協(xié)同作業(yè)來(lái)定期對(duì)船舶開(kāi)展無(wú)損檢測(cè)和清污的維護(hù)工作,使其避免危險(xiǎn)狀況的發(fā)生。然而,水下機(jī)器人協(xié)同作業(yè)通信中存在的傳輸數(shù)據(jù)率低,傳輸慢、安全性不高、干擾性大等問(wèn)題,導(dǎo)致協(xié)同作業(yè)時(shí)的協(xié)調(diào)性和精確度降低。

式中：G為每天累計(jì)發(fā)芽率，t為試驗(yàn)天數(shù)，在本試驗(yàn)中發(fā)芽速度最大值為100，該數(shù)值越大，說(shuō)明種子的發(fā)芽速度越快。

式中：N為最后一天的發(fā)芽數(shù)，ti為第i天，tj為第j天，ni為第i天的發(fā)芽數(shù)，nj為第j天的發(fā)芽數(shù)。

種子活力指數(shù) = (根長(zhǎng) + 苗長(zhǎng)) /T50，1/T50為萌發(fā)速率，即種子發(fā)芽率達(dá)到最終發(fā)芽率的50%所需要的時(shí)間的倒數(shù)。

1.2.3 丙二醛(MDA)含量及SOD、POD、CAT酶活性的檢測(cè)

通過(guò)正交設(shè)計(jì)方案測(cè)定各發(fā)芽指標(biāo)，首先篩選出幾個(gè)優(yōu)良組合，然后進(jìn)一步檢測(cè)其MDA(丙二醛)含量及SOD、POD、CAT酶活性，并最終篩選出PEG引發(fā)紫花苜蓿種子最優(yōu)的處理方案。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 19.0軟件對(duì)所測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示試驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果，對(duì)同一處理濃度不同處理時(shí)間和溫度、同一處理時(shí)間不同處理濃度和溫度、同一處理溫度不同處理濃度和時(shí)間以及4種酶的活性進(jìn)行單因素方差分析，并對(duì)各試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Duncan法進(jìn)行多重比較；圖表制作采用Excel 2010。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子發(fā)芽指標(biāo)及方差分析結(jié)果

處理組合Ⅰ(A1B1C1)的最終發(fā)芽率最低(圖1A)，平均只有95.12%，而處理組合Ⅶ(A3B1C3)的平均發(fā)芽率最高，平均可達(dá)98.17%。在達(dá)到最終發(fā)芽率50%所需的時(shí)間T50中，處理組合Ⅳ～Ⅷ顯著低于其他 5 種處理組合（P ＜ 0.05）(圖 1B)。引發(fā)后各處理的種苗長(zhǎng)度均高于對(duì)照處理，并且除處理組合Ⅷ外其余處理均顯著高于對(duì)照（P ＜ 0.05）(圖 1C)。在種苗的活力指數(shù)中，處理組合Ⅳ～Ⅶ高于其他引發(fā)處理，處理Ⅳ、Ⅴ和Ⅶ顯著高于對(duì)照組（P ＜ 0.05）(圖1D)。除此之外，引發(fā)還增加了組合Ⅳ～Ⅷ的發(fā)芽速度，處理組合Ⅳ顯著高于對(duì)照(圖1E)。綜上，引發(fā)加快了紫花苜蓿的發(fā)芽，促進(jìn)了紫花苜蓿種苗的生長(zhǎng)，增加了紫花苜蓿種苗的活力指數(shù)。

圖1 PEG引發(fā)后紫花苜蓿種子的發(fā)芽指標(biāo)Figure 1 Germination index of alfalfa seeds after PEG priming

從方差分析表可知，A因素即PEG濃度對(duì)紫花苜蓿種子的發(fā)芽速度有顯著影響（P ＜ 0.05）(表3)，而處理時(shí)間和處理溫度對(duì)紫花苜蓿種子發(fā)芽速度則無(wú)顯著影響（P ＞ 0.05）。PEG濃度A的極差為27.806，處理時(shí)間B的極差為12.927，處理溫度C的極差為10.617 (表4)。綜上分析可判斷，3種試驗(yàn)因素對(duì)紫花苜蓿發(fā)芽速度的影響程度大小依次為處理濃度、處理時(shí)間、處理溫度。

表3 方差分析表Table 3 RANOVA table

在各試驗(yàn)因素水平中，PEG濃度為A2(10%)時(shí)對(duì)紫花苜蓿種子的引發(fā)效果最好，發(fā)芽速度達(dá)到91.603；處理時(shí)間B1(12 h)的效果最好，發(fā)芽速度達(dá)到84.527；處理溫度C3(20 ℃)的效果最好，發(fā)芽速度達(dá)到82.637 (表4)。但由于PEG濃度對(duì)紫花苜蓿的發(fā)芽速度影響顯著，而處理時(shí)間和處理溫度無(wú)顯著影響，因此，在選擇處理組合時(shí) 10%PEG濃度作為組合指標(biāo)優(yōu)選之一，與處理時(shí)間和處理溫度組合后通過(guò)生理指標(biāo)測(cè)定來(lái)進(jìn)一步篩選優(yōu)選組合。

2.2 PEG處理對(duì) MDA、SOD、POD、CAT酶活性的影響

為進(jìn)一步比較優(yōu)良組合，根據(jù)PEG濃度對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響結(jié)果，確定組合IV、V、VI進(jìn)行MDA含量及SOD、POD和CAT酶活性的測(cè)定[14]。結(jié)果表明，處理Ⅴ(A2B2C3)紫花苜蓿種子MDA含量較少(表5)，SOD和POD酶的活性最高，且SOD與POD酶的活性顯著高于組合Ⅳ(A2B1C2)和組合Ⅵ(A2B3C1) ( P ＜ 0.05)，CAT酶的活性也具有較高的水平。處理Ⅳ各指標(biāo)次之，處理Ⅵ相對(duì)較差。因此，處理組合Ⅴ為最優(yōu)組合。

3 討論與結(jié)論

在衡量種子活力時(shí)，通常將種子的發(fā)芽指數(shù)與幼苗的生長(zhǎng)勢(shì)結(jié)合在一起，種子的活力水平可以用活力指數(shù)來(lái)反映[15]。種子活力受種子壽命、遺傳因素、貯藏條件等因子影響，可通過(guò)引發(fā)技術(shù)得到提高[4,10]。種子引發(fā)作為一種種子播前預(yù)處理技術(shù)，常用于改善作物的田間表現(xiàn)[16]，能提高逆境下的種子活力，改善發(fā)芽和幼苗出土情況[17-18]。

一般來(lái)說(shuō)，引發(fā)溫度15～25 ℃為大多數(shù)物種的最適溫度。而在本研究所得出的最優(yōu)引發(fā)方案中，引發(fā)溫度為20 ℃便與此一致。研究表明，在種子最適的萌發(fā)溫度下對(duì)種子進(jìn)行引發(fā)后，引發(fā)效果最佳[19]。引發(fā)效果受溫度的影響，隨溫度的降低而普遍下降，甚至還可能會(huì)影響之后種子的萌發(fā)，而溫度過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致種子發(fā)生霉變[20]。如瓜爾豆(Cyamopsis tetragonoloba)低溫處理后發(fā)芽率僅為2%[21]。用PEG-1000引發(fā)大豆種子在較高溫度(17 ℃)的溶液中容易發(fā)霉[12]。

表4 紫花苜蓿正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 4 Results of orthogonal test

表5 PEG處理對(duì)紫花苜蓿種子MDA含量、SOD、POD及CAT酶的活性的影響Table 5 Effects of PEG treatment on the content of MDA, the activity of SOD, POD and CAT in alfalfa seeds

不同種子的最適引發(fā)時(shí)間也大都不同。例如在關(guān)于孜然(Cuminum cyminum)種子的研究中，用PEG引發(fā)48 h后顯著提高了孜然種子的發(fā)芽性能[22]；而在本研究中通過(guò)正交設(shè)計(jì)及4種酶活性的檢測(cè)所篩選出來(lái)的最優(yōu)組合的引發(fā)時(shí)間為24 h。引發(fā)時(shí)間也同樣是決定引發(fā)成敗的關(guān)鍵。在引發(fā)沙打旺(Astragalus adsurgens)的研究中表明，引發(fā)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)超過(guò)72 h出現(xiàn)負(fù)效應(yīng)，過(guò)短效果則不顯著[23]。用PEG引發(fā)白三葉(Trifolium repens)時(shí)，引發(fā)時(shí)間為最長(zhǎng)72 h時(shí)，顯著縮短了T50[24]。

細(xì)胞抵御活性氧傷害保護(hù)酶系統(tǒng)的主要組成成分是SOD、POD和CAT，對(duì)清除自由基和阻止自由基的形成方面具有重要的作用[15]。在評(píng)價(jià)種子活力時(shí)，通?？梢杂梅N子內(nèi)部對(duì)超氧自由基的清除能力來(lái)評(píng)價(jià)。在這一過(guò)程中，清除系統(tǒng)與許多酶如SOD、POD和CAT等保護(hù)酶密切相關(guān)。大量研究表明，引發(fā)能夠提高種子的發(fā)芽率，加快種子的發(fā)芽速度，改善種子的抗逆性，增強(qiáng)SOD和CAT酶的表達(dá)和活性，從而增加作物的產(chǎn)量。種子在貯藏過(guò)程中導(dǎo)致種子活力下降和阻礙種子萌發(fā)的主要原因之一是膜脂過(guò)氧化所產(chǎn)生過(guò)量的活性氧。膜質(zhì)過(guò)氧化作用的主要產(chǎn)物是MDA，其含量的高低可以反映出膜質(zhì)過(guò)氧化作用的程度[25]。在覃柳燕等[26]關(guān)于山豆根(Sophora tonkinensis)種子的研究中發(fā)現(xiàn)，在一定的范圍內(nèi)SOD、POD和CAT酶的活性越高，對(duì)種子組織的保護(hù)能力就越強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，引發(fā)加快了種子的發(fā)芽速度，激活了紫花苜蓿體內(nèi) SOD、POD和CAT等保護(hù)酶的啟動(dòng)，增強(qiáng)了清除活性氧和自由基的能力，減輕了紫花苜蓿膜脂過(guò)氧化作用，有效地保護(hù)了紫花苜蓿的細(xì)胞膜系統(tǒng)，減少了影響種子萌發(fā)過(guò)程中帶來(lái)的不利因素，提高了種子的活力。玉米(Zea mays)種子經(jīng)過(guò)引發(fā)后能夠快速萌發(fā)，具有更高的出苗指數(shù)、萌發(fā)速度、活力指數(shù)和幼苗活力，并且改善了根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)以及幼苗的鮮重和干重[27]。同時(shí)，引發(fā)作用能夠增加光合色素、葉綠素a/b，激活SOD和APX酶活性、增加脯氨酸、甜菜堿含量[28]。小麥種子經(jīng)-0.9 MPa PEG引發(fā)后，植株遇到干旱脅迫時(shí)生理指標(biāo)均顯示出優(yōu)于未引發(fā)的植株，如相對(duì)生長(zhǎng)率、產(chǎn)量、葉綠素a/b、凈光合速度、氣孔導(dǎo)度等降低的程度較小，CAT、APX和GR酶活性較高等[29]。

本研究的最佳引發(fā)組合，即在溫度為20 ℃的條件下，濃度為10%的PEG-6000溶液中浸泡24 h后能顯著提高紫花苜蓿的萌發(fā)速率，提高種子活力。

PEG引發(fā)就是通過(guò)不同濃度的PEG調(diào)節(jié)溶液的滲透壓來(lái)達(dá)到引發(fā)種子的目的，所以引發(fā)成敗的關(guān)鍵在于選擇適宜濃度的PEG。最適濃度的PEG是能最大限度地水合而不讓其發(fā)生可見(jiàn)的萌發(fā)[12]。研究表明，不同PEG的濃度對(duì)引發(fā)的效果也存在著影響。對(duì)孜然種子的研究發(fā)現(xiàn)，用7% PEG引發(fā)的種子的最終發(fā)芽率顯著高于用9% PEG引發(fā)的種子和未引發(fā)的種子。在15 ℃下用7% PEG引發(fā)2 d的孜然種子增強(qiáng)了種子的耐旱性；在9% PEG引發(fā)的孜然種子則表現(xiàn)出對(duì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的提高[22]。用PEG引發(fā)3種老化大豆發(fā)芽時(shí)，20%和30%的PEG的引發(fā)效果要高于10%的PEG[30]。