基于近紅外技術(shù)的蛹蟲草成分快速定量分析研究*

馬 健，李盡哲

（信陽農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽 464000）

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又名北蛹蟲草，為子囊菌門（Ascomycota）肉座目（Gibberella fujikuro）麥角菌科（Clavicipitaceae）是一種昆蟲病原真菌。蛹蟲草在很久以前就被東方國家發(fā)現(xiàn)，它不僅具備很高的營養(yǎng)價(jià)值，還擁有珍貴的藥用功效。趙學(xué)敏在《本草綱目拾遺》中把蟲草類的藥用歸之為“能治百虛百損”；李時(shí)珍在《本草綱目》中指出，蟬花能主治“小兒天吊驚痛，夜啼，心悸”。其中蟬花包括蟬草和蛹草等多種寄生于蟬體上的蟲草。由此可見，蛹蟲草的藥用價(jià)值之高。蛹蟲草中含有腺苷、蛋白質(zhì)、多糖、蟲草酸等多種有效成分，在降血脂、抗菌、抗癌、抗衰老等方面都有顯著的功效[1]。蛹蟲草與冬蟲夏草屬同屬真菌，是蟲草屬的模式種。研究結(jié)果表明，蛹蟲草含有的活性物質(zhì)及其藥理作用接近甚至超過冬蟲夏草[2]?，F(xiàn)行常用的腺苷測定方法高效液相法、蛋白質(zhì)測定方法是凱氏定氮法、蟲草酸測定方法是比色法、多糖測定方法是蒽酮-硫酸法，這些方法都具有測定過程復(fù)雜、材料消耗大及分析時(shí)間長等缺點(diǎn)。在使用上述方法分別對蛹蟲草成分進(jìn)行測定的過程中，會(huì)造成大量不可避免的損耗。而且蛹蟲草具有自然資源較少、價(jià)格昂貴、人工培養(yǎng)難等特點(diǎn)[3]，近年來，還在食品方面的開發(fā)利用上取得了很大的進(jìn)展。由此，能對樣品進(jìn)行無損檢測、成本低、分析速度快、效率高、能多組分同時(shí)檢測的近紅外技術(shù)進(jìn)入了蛹蟲草成分研究的領(lǐng)域。

近紅外技術(shù)全稱叫近紅外光譜技術(shù)，近紅外光譜屬于分子振動(dòng)光譜，美國試驗(yàn)和材料協(xié)會(huì)（ASTM）將其定義為波長在780 nm～2526 nm范圍內(nèi)的電磁波，主要反映分子中C-H，N-H與O-H基團(tuán)的振動(dòng)倍頻和合頻吸收。它具有易于采集和處理、吸收弱以及信息豐富等特點(diǎn)。近紅外光譜是人們最早發(fā)現(xiàn)的可見光區(qū)域，但由于吸收信號弱，譜帶重疊，解析復(fù)雜等原因，受到當(dāng)時(shí)技術(shù)水平的限制，它幾乎沉睡了一個(gè)半世紀(jì)。從20世紀(jì)50年代至今，經(jīng)過科學(xué)家們的不懈努力，科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展繁榮，也使近紅外光譜的相關(guān)研究幾乎呈指數(shù)增長，近紅外光譜技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域得到了有效應(yīng)用，并且取得了良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。近紅外光譜技術(shù)在食品、藥材及化工產(chǎn)品領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，在中藥材的成分鑒定和成分提取中具有不可取代的優(yōu)點(diǎn)。利用近紅外技術(shù)，還能夠?qū)χ兴幍漠a(chǎn)地和質(zhì)量差別進(jìn)行區(qū)分?；诮t外技術(shù)，通過對蛹蟲草的成分進(jìn)行快速定量分析研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

優(yōu)質(zhì)人工栽培的蛹蟲草1株，通過化學(xué)誘變法獲得278株誘變蛹蟲草菌株。各項(xiàng)性能長期穩(wěn)定的近紅外光譜分析儀，采用SPSS軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

1.2 方法

采用近紅外光譜分析技術(shù)定量分析的方法，方法步驟分為三步，分別是選取代表性樣品，測量其近紅外光譜；數(shù)據(jù)采集，采用標(biāo)準(zhǔn)或認(rèn)可的參考方法測定所關(guān)心的組成數(shù)據(jù)或性質(zhì)數(shù)據(jù)；建模，通過合理的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立數(shù)學(xué)模型。由于散射效應(yīng)等因素對光譜會(huì)有干擾，為了消除影響，需要對光譜進(jìn)行預(yù)處理。本研究采用FFT、卷積平滑法、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、小波變換等不同的預(yù)處理方法對光譜進(jìn)行預(yù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 校正集與預(yù)測集的選擇

為了取得更好的預(yù)測結(jié)果，在校正時(shí)要求試驗(yàn)者適當(dāng)設(shè)計(jì)校正集樣品和預(yù)測集樣品。本試驗(yàn)以210株蛹蟲草樣品作為校正集，68株蛹蟲草樣品作為預(yù)測集，將兩樣品集均勻分布，校正集樣品與預(yù)測集樣品中各有效成分測定含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果，見表1所示。

表1 蛹蟲草有效成分的質(zhì)量含量統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics on the quality content of active constituents of Cordyceps militaris

2.2 建立最優(yōu)模型

由于在近紅外光譜分析中原始光譜會(huì)受到雜噪音和基線飄移的干擾，對蛹蟲草成分的分析效果可能不佳。為了建立最優(yōu)模型，本研究采用了多種不同的光譜預(yù)處理方法，從窗口大小、尺度大小、不同寬度和不同主因子數(shù)方面對蛹蟲草的成分進(jìn)行比較分析，結(jié)果見表2所示。

表2 各種預(yù)處理方法對PLS模型的影響Tab.2 Effect of various pretreatment methods on the PLS model

比較各個(gè)模型發(fā)現(xiàn)，各模型的內(nèi)部交互驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV）、交互驗(yàn)證預(yù)測值與真實(shí)值間的相交系數(shù)（RV）以及外部預(yù)測均方根誤差（RMSEP）的差別很小。保留了小數(shù)點(diǎn)后4位數(shù)字，才能看到細(xì)微的差別。為了建立最優(yōu)模型，研究者對經(jīng)過不同預(yù)處理的光譜進(jìn)行了如下的選擇：FFT預(yù)處理后建立的蛋白質(zhì)PLS定量分析模型的擬合效果比其他預(yù)處理后建立的模型好，RV= 0.9146，但是預(yù)測能力不如小波變換預(yù)處理后的強(qiáng)（RMSEPFFT= 0.6075＞RMSEP小波= 0.6018），選擇小波變換預(yù)建立蛋白質(zhì)PLS定量分析模型；小波變換的腺苷定量分析PLS模型的擬合效果略高于其他預(yù)處理建立的模型，RV= 0.9771，但是預(yù)測能力不及卷積平滑法建立的腺苷PLS定量分析模型（RMSEP小波= 0.0261＞RMSEP卷平= 0.0189），選擇卷積平滑法建立腺苷PLS定量分析模型；蟲草酸在一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理后建立的PLS定量分析模型的擬合效果不是最好的，但是預(yù)測能力優(yōu)于其他處理后建立的模型；蛹蟲草的多糖成分在經(jīng)過卷積平滑法預(yù)處理后，不管是穩(wěn)定性還是擬合效果和預(yù)測能力（RMSECV= 0.0086，RV= 0.8891，RMSEP= 0.0085），建立的PLS定量分析模型都比其他方法處理后建立的模型好。選定最優(yōu)模型歸納整理后，與原始光譜建立的PLS定量分析模型比較，如表3所示。

表3 原始光譜建立的PLS模型與預(yù)處理的最優(yōu)模型對比Tab.3 Comparison of the PLS model established by the original spectrum with the optimal model of the pretreatment

由表3可知，就蛹蟲草中的蛋白質(zhì)成分而言，原始光譜建立的PLS定量分析模型的擬合度效果優(yōu)于經(jīng)過預(yù)處理后建立PLS定量分析模型（RV原= 0.9771＞RV最= 0.9083），預(yù)測能力也比經(jīng)過預(yù)處理后建立的PLS定量分析模型強(qiáng)（RMSEP原= 0.5670＜RMSEP最= 0.6018），所以在蛋白質(zhì)成分上，原始光譜建立的定量分析模型優(yōu)于采用預(yù)處理方法后建立的模型；原始光譜對腺苷成分的PLS定量分析模型擬合度效果比預(yù)處理后PLS定量分析模型的擬合效果差（RV原=0.9014＜RV最= 0.9743），預(yù)測能力也不如預(yù)處理過后的PLS定量分析模型（RMSEP原= O.0203＞RMSEP最= 0.0189），因此腺苷在預(yù)處理后建立的PLS定量分析模型優(yōu)于原始光譜的；蟲草酸在原始光譜建立的PLS定量分析模型中擬合度效果（RV原= 0.8807＞RV最= 0.8754）比預(yù)處理后的略好，而且預(yù)測能力（RMSEP原= 0.0082＜RMSEP最= 0.0083）也比預(yù)處理后的模型好，在蟲草酸成分的定量分析中，由原始光譜建立的模型更好些；多糖在原始光譜的PLS定量分析模型中擬合度效果（RV原= 0.8871＞RV最= 0.8819）略好于預(yù)處理后建立的PLS定量分析模型，但考慮到預(yù)測能力（RMSEP原=0.0091＞RMSEP最= 0.0085）不及預(yù)處理后建立的模型，所以預(yù)處理后的模型在多糖的定量分析上優(yōu)于原始光譜建立的模型。

從上面的分析中，很難辨別蛹蟲草的成分定量分析是使用原始光譜分析建立模型好，還是需要經(jīng)過預(yù)處理才能得到更好的定量分析模型。王迪等人關(guān)于近紅外光譜技術(shù)在蛹蟲草菌絲體分析中的研究認(rèn)為，應(yīng)用預(yù)處理方法消除了光譜中的隨機(jī)噪音、基線和其他背景干擾后，建立的PLS定量分析校正模型的穩(wěn)定性、擬合效果和預(yù)測能力會(huì)有顯著提高。但是在兩者的分析效果差異不顯著的情況下，不對光譜進(jìn)行預(yù)處理，直接使用原始光譜對蛹蟲草成分定量分析，會(huì)減少很多時(shí)間，提高效率和速度。

2.3 原始光譜建立模型的內(nèi)部交互驗(yàn)證

為了評價(jià)以原始光譜建立的模型的穩(wěn)定性和擬合效果，對原始光譜建立的PLS定量分析模型進(jìn)行內(nèi)部交互驗(yàn)證，結(jié)果見圖1所示。

圖1 原始光譜建立的模型的內(nèi)部交互驗(yàn)證Fig.1 Internal interaction verification of the model established by the original spectrum

從圖1中可知，多糖的內(nèi)部交互驗(yàn)證RMSECV為0.0091，預(yù)測值與真實(shí)值間的相交系數(shù)（RV）為0.8871，圖上的點(diǎn)大致均勻的分布在直線周圍并無限趨近直線。蛋白質(zhì)、蟲草酸以及腺苷的數(shù)值和分布狀況也很良好，這說明預(yù)測值與真實(shí)值很接近，以原始光譜建立的PLS定量分析模型的穩(wěn)定性和擬合效果非常好。

2.4 預(yù)測集原始光譜建立模型的外部驗(yàn)證

外部驗(yàn)證一般采用與參與定標(biāo)的樣品品質(zhì)相似，但是還沒有使用過的樣品，這里使用了預(yù)測集樣品，通過比較預(yù)測集樣品的預(yù)測值與試驗(yàn)測定值的差異來判斷模型的預(yù)測準(zhǔn)確性，結(jié)果見圖2。

圖2 預(yù)測集樣品原始光譜建立模型的外部驗(yàn)證Fig.2 External verification of the original set model of the prediction set sample

由圖2可知，對預(yù)測集中的蛹蟲草成分不做任何預(yù)處理，利用近紅外光譜分析儀直接對它進(jìn)行定量分析、建模，對建立的模型進(jìn)行外部驗(yàn)證， 蛋白質(zhì)、蟲草酸、腺苷和多糖成分的外部預(yù)測均方根誤差（RMSEP）分別為0.0196、0.0087、0.5780、0.0079。試驗(yàn)結(jié)果表明，由原始光譜建立的蛹蟲草成分定量分析模型有很好的預(yù)測能力。該結(jié)果與王迪等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[4]。

3 結(jié)論

近紅外技術(shù)可以多組分、快速、同時(shí)、準(zhǔn)確地對蛹蟲草成分進(jìn)行定量分析?？梢詼p少用高效液相法、凱氏定氮法、比色法和蒽酮-硫酸法等分別對蛹蟲草主要有效成分進(jìn)行定量分析帶來的對材料損耗大、時(shí)間長、效率低等問題，也不需要對光譜進(jìn)行程序復(fù)雜的預(yù)處理。使用近紅外光譜技術(shù)定量分析蛹蟲草有效成分，能夠損耗小、更快速、更準(zhǔn)確使蛹蟲草有效成分得到更大價(jià)值的利用，造福更多的人。