培養(yǎng)料鋅含量對靈芝子實(shí)體品質(zhì)的影響*

唐 振，周 潔，譚 偉**，李小林，張 波，葉 雷，張小平

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，四川 雅安 625014）

鋅是人體正常發(fā)育必需的微量元素，參與機(jī)體內(nèi)多種重要生理代謝，缺鋅或鋅濃度較低會導(dǎo)致心血管病、肝硬化、糖尿病、視力減弱、記憶力下降、腫瘤等多種疾病發(fā)生[1]。FAO/WHO推薦每人每日鋅攝入量為15 mg ～ 60 mg，日常食物中鋅的含量大多較低，僅靠食物中的鋅無法滿足人體正常需求，全球約有1/3左右的人口處于缺鋅狀況[2]；而直接用無機(jī)鋅作為鋅的補(bǔ)充來源容易導(dǎo)致鋅攝入過量，引起鋅中毒及貧血等癥狀[3]。因此，可采取生物強(qiáng)化（在生物生長及其代謝過程中進(jìn)行營養(yǎng)元素的富集以提高其營養(yǎng)價(jià)值）途徑，將外源添加的無機(jī)鋅轉(zhuǎn)化為生物鋅，獲得富鋅食品，通過飲食來增加人體所需鋅元素?cái)z入量，該方法具有安全可靠、易于吸收和穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[2-3]。

靈芝（Ganoderma lucidum）是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有“補(bǔ)氣安神、止咳平喘”的功能，主治“心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘， 虛勞短氣， 不思飲食”的病癥[4]。 本研究中，采取在固體培養(yǎng)基質(zhì)中添加醋酸鋅（ZnAC）栽培靈芝子實(shí)體的方法，探討不同鋅含量的培養(yǎng)基質(zhì)對靈芝產(chǎn)量及活性物質(zhì)成分的影響，試圖開發(fā)富鋅靈芝產(chǎn)品，讓人們在食用靈芝產(chǎn)品時(shí)，既能吸收靈芝原本具有的藥效成分，又能補(bǔ)充適量的生物鋅并加強(qiáng)對鋅元素的有效吸收，免受直接補(bǔ)充無機(jī)鋅導(dǎo)致的副作用；同時(shí)，還為靈芝高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)尋求科學(xué)依據(jù)，具有重要的科學(xué)價(jià)值和生產(chǎn)指導(dǎo)意義。

樊德金等[3]栽培韓芝時(shí)，添加ZnSO4·7H2O至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行富鋅試驗(yàn)，結(jié)果表明，培養(yǎng)基初始pH 5.5，每250毫升裝液量為125 mL，培養(yǎng)13 d，韓芝富鋅率最高，達(dá)到40.1%。劉坤等[5]采用液體培養(yǎng)方法比較了靈芝、灰樹花和姬松茸的富鋅能力，結(jié)果表明靈芝的富鋅能力最強(qiáng)，培養(yǎng)液的鋅濃度為240 mg·L-1時(shí)菌絲Zn含量達(dá)到6.42 mg·g-1，富鋅率達(dá)30.39%，因此認(rèn)為靈芝較適合作為富鋅的載體。畢靜瑩等[6]在鋅含量為500.0 mg（以鋅元素計(jì)）的基礎(chǔ)發(fā)酵液基礎(chǔ)上開展了氮源和碳源篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)玉米粉、豆粕和KH2PO4是影響日本靈芝（Ganoderma japonicum）富鋅能力的主要因素，在組分為玉米粉35.0 g · L-1、豆粕7.0 g·L-1和KH2PO41.0 g ·L-1的條件下，日本靈芝富鋅率最高可達(dá)25.1%。魏賽金等[7]研究表明，PDA培養(yǎng)基中ZnSO4·7H2O濃度為500 μ g·L-1時(shí)靈芝菌絲體生長狀況最佳，第6天時(shí)菌落直徑達(dá)到8.0 cm；ZnSO4·7H2O濃度為1000 μg ·L-1時(shí)菌絲體生長明顯受到抑制；ZnSO4·7H2O濃度為300 μg·L-1時(shí)菌絲體的富鋅能力最強(qiáng)，含鋅量高達(dá)25.09 mg·g-1，胞外多糖含量最高為57%。楊澤濤等[8]以添加一定量ZnSO4的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)衛(wèi)星靈芝2號菌株（satelliteGanoderma lucidum），結(jié)果表明在鋅濃度為150 μg·L-1的PDA培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，菌落直徑最大，為8.00 cm，菌絲體長勢較對照組潔白、粗壯、密集；在ZnSO4濃度為60 μg·L-1的液體培養(yǎng)基中菌絲體的鋅含量和富鋅轉(zhuǎn)化率最高，分別為1142.91 mg·L-1和1.76%。綜上，目前相關(guān)研究多采取液體發(fā)酵培養(yǎng)開展試驗(yàn)，且主要涉及2個(gè)方面，一是初步探討了靈芝在不同鋅濃度的PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長情況或菌絲對鋅濃度的耐性；二是采取液體發(fā)酵培養(yǎng)靈芝，研究了菌絲體富集鋅的能力或效果。

本研究中，采取在固體栽培基質(zhì)中添加外源鋅開展試驗(yàn)，探討不同鋅含量的固體栽培基質(zhì)對靈芝的菌絲生長、子實(shí)體產(chǎn)量及其活性物質(zhì)成分和子實(shí)體富鋅影響的研究，目前此類研究鮮見報(bào)道。設(shè)計(jì)不同Zn含量處理培養(yǎng)基質(zhì)栽培靈芝，觀測各個(gè)處理的菌絲生長速度及子實(shí)體產(chǎn)量，測定子實(shí)體中多糖、三萜和Zn含量，篩選出促進(jìn)靈芝生長發(fā)育和提高活性成分的栽培基質(zhì)中鋅的適宜添加濃度，以豐富靈芝高效栽培應(yīng)用技術(shù)和優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)指標(biāo)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

靈芝品種“川圓芝1號”，由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所微生物研究室提供。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

基質(zhì)配方：90%棉籽殼、5%麥麩、4%玉米粉、1%石膏，含水量68%， pH自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

預(yù)先將醋酸鋅（ZnAC）溶解于水，再將ZnAC水溶液添加于基礎(chǔ)培養(yǎng)中，使ZnAC在培養(yǎng)基質(zhì)中的最終含量分別為0 （CK）、50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、150 mg·kg-1、200 mg·kg-1、250 mg·kg-1、300 mg·kg-1、350 mg·kg-1，即設(shè)置 CK、Zn-50、Zn-100、Zn-150、Zn-200、Zn-250、Zn-300、Zn-350共計(jì)8個(gè)試驗(yàn)處理。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)組，每個(gè)重復(fù)組10個(gè)菌袋，合計(jì)30袋。

1.2.2 栽培方法

采用靈芝熟料袋栽蔭棚出芝方法開展本試驗(yàn)，按照靈芝代料栽培技術(shù)的工藝流程進(jìn)行培養(yǎng)料配制、裝袋、滅菌、接種、發(fā)菌和出芝管理等[9]。其中，栽培料袋使用聚丙烯塑料袋，料袋規(guī)格（長度×折徑×厚度）為 33.000 cm×17.000 cm×0.005 cm；裝干料0.55 kg/袋，常壓滅菌18 h；接種后在（25±2）℃條件下發(fā)菌，待菌絲滿袋后搬入出芝棚；當(dāng)子實(shí)體邊沿黃白色生長圈消失，開始彈射孢子時(shí)采收子實(shí)體。

1.3 測定方法

1.3.1 菌絲生長速度

以菌絲體在單位時(shí)間內(nèi)于培養(yǎng)基質(zhì)中伸長的長度作為菌絲生長速度，即在菌絲體生長到菌袋約1/4時(shí)，在菌袋上菌絲體邊緣處用記號筆畫出生長起始線，培養(yǎng)15 d后在菌袋上畫出生長截止線，測量起始線與截止線之間的直線長度，即可計(jì)算出菌絲平均生長速度（mm·d-1）。

1.3.2 多糖含量

參照《中華人民共和國藥典》中靈芝“多糖測定法”測定樣品中的多糖含量[4]：稱取已打磨成細(xì)粉的靈芝樣品1 g，加入30 mL的水于90℃的水浴鍋中提取3 h，然后在離心機(jī)中以4000 r·min-1的速度離心10 min，得濾液1；將濾渣再次水提，加入20 mL的水于90℃的水浴鍋中提取2 h，然后在離心機(jī)中以4000 r·min-1離心10 min，得濾液2；將濾液1和2合并，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至約10 mL，得濃濾液；加入濃濾液3倍體積的95%乙醇，過夜沉淀，4000 r·min-1離心10 min，取沉淀物（粗多糖），再加水溶解定容至10 mL；按照紫外-可見分光光度法（通則0401），在490 nm波長處測定吸光度，設(shè)置空白，制作標(biāo)曲， 測定供試品溶液中無水葡糖糖的含量，計(jì)算后即得樣品中多糖含量。

1.3.3 三萜含量

參照《中華人民共和國藥典》中靈芝“三萜測定法”測定樣品中的三萜含量[4]：稱取已打磨成細(xì)粉的靈芝樣品2.0 g，置于具塞錐形瓶中，加無水乙醇50 mL，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）45 min；過濾，濾液置 100 mL量瓶中；用適量乙醇分次洗滌濾器和濾渣，洗液并入同一量瓶中；加乙醇至刻度，搖勻，即得取供試品溶液；精確量取供試品溶液2 mL，置15 mL具塞試管中，放冷，精確加入新配制的香草醛冰醋酸溶液 2 mL（精確稱取香草醛 0.5 g，加冰醋酸溶解，定容為10 mL）、高氯酸8 mL，搖勻；在70℃水浴中加熱15 min，立即置于冰浴中冷卻5 min；取出，精確加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，避光反應(yīng)20 min；按照紫外-可見分光光度法（通則0401），在546 nm波長處測定吸光度，設(shè)置空白，制作標(biāo)曲，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中齊墩果酸的含量，計(jì)算，即得樣品中三萜含量。

1.3.4 鋅含量

參照GB 5009.14-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鋅的測定 第一法 火焰原子吸收光譜法》測定鋅含量。樣品去除雜物后，粉碎，儲于塑料瓶中。準(zhǔn)確稱取靈芝子實(shí)體試樣2.000 g（精確至 0.001 g）于坩堝中，小火加熱，炭化無煙，轉(zhuǎn)移至馬弗爐中，于550℃灰化3 h～4 h 。冷卻，取出，對于灰化不徹底的試樣，加數(shù)滴硝酸小火加熱，小心蒸干，再轉(zhuǎn)入550℃馬弗爐中，繼續(xù)灰化1 h～2 h，至試樣呈白灰狀，冷卻，取出，用適量硝酸溶液1 ：1溶解并用水定容至25 mL。設(shè)置空白，在與測定標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的試驗(yàn)條件下，將空白溶液和試樣溶液分別導(dǎo)入火焰原子化器，原子化后在213.9 nm波長處測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，即得樣品中鋅含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20數(shù)據(jù)處理軟件，對各個(gè)處理間的菌絲生長速度、子實(shí)體產(chǎn)量、多糖含量和三萜含量等數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝在不同鋅含量基質(zhì)上的菌絲生長速度

川圓芝1號在8個(gè)處理的培養(yǎng)基質(zhì) 上，菌絲平均生長速度和子實(shí)體（干重）單產(chǎn)見表1。

表1 川圓芝1號在不同鋅含量培養(yǎng)基質(zhì)上菌絲生長速度和子實(shí)體產(chǎn)量Tab.1 Mycelial growth rates and yields of Chuanyuanzhi No.1 on formula materials with different zinc contents

由表1可知，各處理中菌絲的生長速度范圍為 5.70 mm·d-1～ 6.53 mm·d-1，生長速度由慢至快順序 為 CK（5.70 mm·d-1）＜Zn-100(5.80 mm·d-1)＜Zn-300（5.90 mm·d-1）＜Zn-200（5.97 mm·d-1）＜Zn-350（6.07 mm·d-1）＜Zn-50 （6.13 mm·d-1）＜Zn-250（6.48 mm·d-1）＜Zn-150（6.53 mm·d-1）。結(jié)果表明，靈芝在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加鋅元素后各處理的菌絲生長速度均高于CK，其中Zn-150（6.53 mm·d-1）處理的菌絲平均生長速度最快，與Zn-200、Zn-350處理呈顯著性差異，與CK、Zn-100、Zn-300的差異達(dá)極顯著水平?？梢?，基質(zhì)中添加外源鋅（醋酸鋅）可促進(jìn)菌絲生長速度，在Zn-150時(shí)生長速度最快，較CK菌絲生長速度提高了約14.6%。

各處理子實(shí)體平均單產(chǎn)為24.38 g/袋～35.57 g /袋，由低到高的順序?yàn)閆n-300（24.38 g/袋）＜CK（27.33 g/袋）＜Zn-50（28.35 g/袋）＜Zn-200（29.06 g/袋）＜Zn-250（29.50 g/袋）＜Zn-350（33.29 g/袋）＜Zn-150（34.07 g/袋）＜Zn-100（34.57 g/袋）。其中，除 Zn-300（24.38 g/袋）處理的單產(chǎn)低于CK外，其余處理的單產(chǎn)均高于CK；其中，Zn-100（34.57 g/袋）處理的單產(chǎn)最高，但較CK差異不顯著。由此可見，基質(zhì)中添加外源鋅（醋酸鋅）對靈芝子實(shí)體產(chǎn)量影響不顯著。

2.2 靈芝在不同鋅含量基質(zhì)上的子實(shí)體多糖、三萜含量及子實(shí)體富集鋅含量

川圓芝1號在供試8個(gè)處理的培養(yǎng)基質(zhì)上子實(shí)體多糖含量、三萜含量及子實(shí)體鋅含量見表2。

表2 川圓芝1號在不同鋅含培養(yǎng)基質(zhì)中所產(chǎn)子實(shí)體多糖、三萜含量及鋅含量Tab.2 The contents of polysaccharides, triterpenoids and zinc contents of Chuanyuanzhi No.1 on formula materials with different zinc contents

由表2可知，各處理中子實(shí)體的多糖含量范圍為1.24%～2.25%，由低至高順序?yàn)閆n-50（1.23%）＝Zn-150（1.23%）＜ Zn-100（1.47%）＜ Zn-250（1.62%）＜Zn-200（1.75%）＜Zn-350（1.79%）＜CK（2.14%）＜ Zn-300（2.25%）。其中， 除 Zn-300（2.25%）處理外，其余添加鋅基質(zhì)處理子實(shí)體中多糖含量均低于CK；Zn-300處理與CK、Zn-350、Zn-200、Zn-250相比差異不顯著，但與Zn-50、 Zn-100、 Zn-150處理相比差異顯著。因此，在基質(zhì)中添加外源鋅（醋酸鋅）對靈芝子實(shí)體中多糖的形成和含量積累的影響不明顯。

各處理中子實(shí)體的三萜含量為2.10%～3.68%，由低至高順序?yàn)閆n-200（2.02%）＜Zn-250（2.10%）＜CK（2.46%）＜Zn-300（2.63%）＜Zn-150（2.82%）＜Zn-100（2.88%）＜Zn-350（3.50%）＜Zn-50（3.68%）。其中，Zn-50（3.68%）處理子實(shí)體中的三萜含量最高，且較CK、Zn-250處理的差異達(dá)顯著水平，較Zn-200的差異達(dá)極顯著水平。結(jié)果表明，在基質(zhì)中添加外源鋅（醋酸鋅）會誘導(dǎo)和促進(jìn)子實(shí)體中三萜的形成，且添加鋅含量為50 mg·kg-1時(shí)會顯著提高子實(shí)體中的三萜含量，較CK子實(shí)體中的三萜含量提高了約52.1%。

各處理中子實(shí)體的鋅含量范圍為25.30 mg·kg-1～48.53 mg·kg-1，由低至高順序?yàn)?CK（25.30 mg·kg-1）＜ Zn-150（30.60 mg·kg-1）＜Zn-50（31.77 mg·kg-1）＜ Zn-100（33.93 mg·kg-1）＜Zn-200（mg·kg-1）＜ Zn-250（35.47 mg·kg-1）＜Zn-300（40.37 mg·kg-1）＜Zn-350（48.53 mg·kg-1）。結(jié)果顯示，靈芝在基質(zhì)中添加醋酸鋅的各處理的子實(shí)體鋅含量均高于CK，其中Zn-350（48.52 mg·kg-1）處理子實(shí)體含鋅量最高，較其他處理間差異極顯著，且較CK的鋅含量提高了91.81%。綜上所述，在栽培基質(zhì)中添加外源鋅（醋酸鋅）能夠促進(jìn)靈芝子實(shí)體鋅含量的富集，可見，靈芝子實(shí)體對醋酸鋅中的鋅離子具有很強(qiáng)的富集能力。

3 討論

3.1 在固體栽培基質(zhì)中添加外源鋅（醋酸鋅）可促進(jìn)靈芝菌絲生長

在以棉籽殼為主料的固體栽培基質(zhì)中添加50 mg·kg-1～350 mg·kg-1的醋酸鋅，均具有良好的促進(jìn)靈芝菌絲生長的效果。這與魏賽金等[7]和楊澤濤等[8]在PDA固體培養(yǎng)基中添加一定量硫酸鋅后提高靈芝菌絲生長速度的試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果，為縮短靈芝發(fā)菌周期提供了一項(xiàng)添加外源鋅的栽培技術(shù)措施和對應(yīng)技術(shù)指標(biāo)參數(shù)，建議靈芝代料栽培者可在栽培基質(zhì)中添加150 mg·kg-1的醋酸鋅，以達(dá)到提高菌絲生長速度、縮短發(fā)菌周期的目的。本試驗(yàn)結(jié)果還表明，培養(yǎng)基質(zhì)添加醋酸鋅后，各個(gè)處理的靈芝子實(shí)體（干重）單產(chǎn)較CK差異不顯著，即對靈芝單產(chǎn)沒有顯著影響。

3.2 在固體栽培基質(zhì)中添加外源鋅（醋酸鋅）可提高靈芝子實(shí)體中三萜成分含量

在以棉籽殼為主料的固體栽培基質(zhì)中添加醋酸鋅，盡管對靈芝子實(shí)體中多糖的形成和含量積累的影響不大，但對子實(shí)體中三萜活性物質(zhì)的誘導(dǎo)形成和含量積累產(chǎn)生了重要影響，且當(dāng)添加鋅濃度為50 mg·kg-1時(shí)大幅度地提高了子實(shí)體中的三萜含量。黃艷娟等[10]綜述了靈芝三萜具有抗腫瘤、抗病原菌、降血脂、抗炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)智力和延緩衰老等藥理學(xué)作用。邢康康等[11]綜述了靈芝酸具有擬癌、抗病毒、擬致病菌、防治心血管疾病、保護(hù)肝臟和防治癲癇等藥理作用。生產(chǎn)含有靈芝活性物質(zhì)產(chǎn)品的廠家希望以三萜物質(zhì)含量較高的子實(shí)體作為提取原料，以獲取更多的三萜物質(zhì)。本試驗(yàn)研究結(jié)果，為栽培高三萜含量靈芝提供了一項(xiàng)添加外源鋅的栽培技術(shù)和對應(yīng)技術(shù)指標(biāo)參數(shù)，建議靈芝代料生產(chǎn)者若以獲取高三萜活性物質(zhì)含量子實(shí)體為栽培目的，可在栽培基質(zhì)中添加50 mg·kg-1醋酸鋅。

3.3 在固體栽培基質(zhì)中添加外源鋅（醋酸鋅）極利于靈芝子實(shí)體對鋅的富集

在以棉籽殼為主料的的固體栽培基質(zhì)中添加醋酸鋅，能夠大幅度促進(jìn)靈芝在子實(shí)體中鋅的富集，說明靈芝子實(shí)體具有很強(qiáng)的鋅富集能力，可通過生物強(qiáng)化途徑研發(fā)出富鋅靈芝子實(shí)體產(chǎn)品。這與劉坤等[5]研究結(jié)果靈芝菌絲體富集鋅率高，并認(rèn)為靈芝較適合作為富鋅生物體的結(jié)果類似。生物有機(jī)鋅產(chǎn)品市場前景好，靈芝產(chǎn)品生產(chǎn)廠家需要具有高多糖和高三萜含量又兼具高鋅含量的靈芝子實(shí)體，作為加工原料。因此，本試驗(yàn)研究結(jié)果，既為富鋅靈芝栽培提供了一項(xiàng)添加外源鋅的栽培技術(shù)和對應(yīng)技術(shù)指標(biāo)參數(shù)，又為通過栽培方法調(diào)整來獲得富鋅靈芝子實(shí)體以研發(fā)新產(chǎn)品奠定了理論基礎(chǔ)。綜上所述，建議靈芝代料生產(chǎn)者若以獲取富鋅子實(shí)體產(chǎn)品為栽培目的，可在栽培基質(zhì)中添加醋酸鋅350 mg·kg-1。