牛類(lèi)芽孢桿菌BD3526產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的條件優(yōu)化

韓瑨，吳正鈞，劉振民，趙勇

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海,201306)2(上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海,200436)

Ⅱ型糖尿病，又稱非胰島素依賴型糖尿病(non-insulin-dependent diabetes mellitus，簡(jiǎn)稱NIDDM)，由胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷造成，患者體內(nèi)的胰島素水平表現(xiàn)為正?；蚋哂谡Ｈ怂剑捎贜IDDM無(wú)癥狀或癥狀少，因此往往會(huì)被忽視而在病人體內(nèi)進(jìn)一步呈隱匿性發(fā)展，正因?yàn)槿绱?，NIDDM的發(fā)病率顯著高于其他糖尿病(Ⅰ型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊類(lèi)型糖尿病)[1]，占糖尿病總數(shù)的85%以上。在臨床上，可通過(guò)胰島素增敏劑、促胰島素分泌劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑等藥物手段緩解或治療NIDDM[2]。

在目前的NIDDM治療藥物品類(lèi)中，α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-glucosidase inhibitor，簡(jiǎn)稱AGI)因其療效佳、副作用小而被病患視為首選的口服降糖藥物。盡管自然界中AGI來(lái)源廣泛，植物(如大豆[3]、中草藥[4]等)、動(dòng)物(如海洋無(wú)脊椎動(dòng)物[5]等)和微生物[6]中均有過(guò)報(bào)道。與前兩者相比，增殖生長(zhǎng)更迅速的微生物有AGI積累快、得率高的特點(diǎn)，因而微生物來(lái)源的AGI成為目前市售主要糖尿病藥物，如阿卡波糖(Acarbose)、伏格列波糖(Voglibose)以及米格列醇(Miglitol)，都是真菌類(lèi)微生物的代謝產(chǎn)物或次級(jí)代謝產(chǎn)物[7]。但到目前為止，受到可參考分離手段相對(duì)有限等不利因素的影響，安全性更有優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌類(lèi)微生物(如乳酸菌等)AGI依然未得到有效的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。

前期研究發(fā)現(xiàn)，脫脂乳經(jīng)BD3526發(fā)酵(培養(yǎng)時(shí)間36 h，培養(yǎng)溫度30℃，脫脂乳濃度為10%、三角瓶裝量為50 mL/250 mL)后對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性較強(qiáng)(半數(shù)抑制濃度IC50為22.4 mg/mL)，為了進(jìn)一步提高目標(biāo)抑制物的產(chǎn)量,以利于后續(xù)的分離提取工作順利開(kāi)展，本文以半數(shù)抑制濃度為響應(yīng)值IC50，先后采用單因素法和響應(yīng)面法確定培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、脫脂乳濃度和三角瓶裝量的優(yōu)選值，接著驗(yàn)證響應(yīng)面預(yù)測(cè)模型的可靠性，并與優(yōu)化前IC50進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 菌種與實(shí)驗(yàn)材料

PaenibacillusbovisBD3526，由光明乳業(yè)股份有限公司提供。

M17瓊脂培養(yǎng)基、M17液體培養(yǎng)基、乳糖,英國(guó)OXOID LTD.;脫脂乳粉，光明乳業(yè)股份有限公司；NaOH、Na2CO3、乳酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)、pNPG(4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷)，美國(guó)Sigma公司，MRS培養(yǎng)基，德國(guó)merck公司；TPY培養(yǎng)基，海博生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基的制備

脫脂乳培養(yǎng)基的制備：將質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%～10.0%脫脂乳粉與蒸餾水混勻，充分溶解后，120 ℃滅菌20 min，即得所需濃度的無(wú)菌脫脂乳培養(yǎng)基。

1.3 儀器與設(shè)備

HVE-50型高壓滅菌鍋,日本HIRAYAMA公司；SG-402TX型超凈工作臺(tái),美國(guó)THE BAKER COMPANY公司；AVANTI J30I型高速冷凍離心機(jī),美國(guó)BECKMAN COULTER公司；HZQ-F160型搖床,蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-25型pH計(jì),美國(guó)奧立龍公司；XW-80A型漩渦混合儀,上海青浦滬西儀器廠；Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Molecular Devices公司；FreeZone 12型真空冷凍干燥機(jī),美國(guó)LABCONCO公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)酵種子的制備

將牛類(lèi)芽孢桿菌BD3526的凍干粉以少量無(wú)菌蒸餾水溶解，用接種環(huán)挑取一環(huán)劃線于M17蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(以50 g/L蔗糖取代M17培養(yǎng)基中5 g/L的乳糖，在120 ℃下滅菌20 min)上，28 ℃好氧培養(yǎng)24 h后取出，用接種環(huán)挑取單菌落接入1 mL M17蔗糖液體培養(yǎng)基中，采用渦旋混合儀將細(xì)胞均勻分散后，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h取出，再以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種于50 mL上述M17蔗糖液體培養(yǎng)基中，再次于28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)物以15 000 r/min離心10 min，棄去上清，沉淀部分以無(wú)菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養(yǎng)體積的無(wú)菌蒸餾水懸浮，得到發(fā)酵用的種子。

1.4.2 待測(cè)樣品的制備

將發(fā)酵乳置于沸水浴中滅活10 min，取出冷卻至室溫，以10 000 r/min離心2 min后取上清，以1 mol/L NaOH回調(diào)pH至6.80，再次10 000 r/min離心2 min后取上清，將冷凍干燥后所得粉末溶解于PBS(0.1 mol/L，pH 6.80)的緩沖液中，即得不同質(zhì)量濃度(80、40、20、10和5 mg/mL)的待測(cè)樣品。

1.4.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性及IC50的測(cè)定

在體外測(cè)定模型PNPG法[8]的基礎(chǔ)上加以改良：向1.5 mL EP管內(nèi)分別加入100 μL待測(cè)樣品與50 μL α-葡萄糖苷酶(100 mU/mL)，混合均勻后于37 ℃水浴15 min，再加入80 μL PNPG(2 mmol/L)，混勻后再次37 ℃水浴15 min，最后加入80 μL Na2CO3(0.2 mol/L)終止反應(yīng)。將上述反應(yīng)體系于4 ℃、10 000 r/min離心2 min后，取200 μL上清液于96孔微孔板中，利用酶標(biāo)儀在405 nm下測(cè)定吸光度。取3次平行實(shí)驗(yàn)OD405的平均值，代入公式(1)計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制活性：

式中：陰性對(duì)照組為PBS替代待測(cè)樣品組中的待測(cè)樣品；陰性空白組為PBS替代陰性對(duì)照組中的α-葡萄糖苷酶；樣品空白組為PBS替代待測(cè)樣品組中的α-葡萄糖苷酶。

IC50的測(cè)定：以樣品濃度為橫坐標(biāo)，糖苷酶抑制率為縱坐標(biāo)作圖，通過(guò)回歸方程擬合并計(jì)算可得該樣品抑制α-葡萄糖苷酶半數(shù)活性所需的濃度，即IC50。

1.4.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.4.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)BD3526產(chǎn)AGI的影響

將BD3526種子液按體積分?jǐn)?shù)2%接種量接入裝有50 mL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂乳培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，并于不同的培養(yǎng)時(shí)間(12、24、36、48、60 h)取出發(fā)酵乳(n=3)，按1.4.2所述方法制備成待測(cè)樣品，再按1.4.3所述方法測(cè)得各樣品的IC50。

1.4.4.2 培養(yǎng)溫度對(duì)BD3526產(chǎn)AGI的影響

將BD3526種子液按2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入裝有50 mL、10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂乳培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，分別置于20、25、30、35和40 ℃條件下，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，取出發(fā)酵乳(n=3)，按1.4.2所述方法制備成待測(cè)樣品，再按1.4.3所述方法測(cè)得各樣品的IC50。

1.4.4.3 脫脂乳濃度對(duì)BD3526產(chǎn)AGI的影響

將BD3526種子液按2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入裝有50 mL，濃度分別為2%、4%、6%、8%和10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂乳培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，取出發(fā)酵乳(n=3)，按1.4.2所述方法制備成待測(cè)樣品，再按1.4.3所述方法測(cè)得各樣品的IC50。

1.4.4.4 三角瓶裝量對(duì)BD3526產(chǎn)AGI的影響

將BD3526種子液按2%(體積分?jǐn)?shù))接種量分別接入裝有25、50、75、100和125 mL，10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂乳培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，取出發(fā)酵乳(n=3)，按1.4.2所述方法制備成待測(cè)樣品，再按1.4.3所述方法測(cè)得各樣品的IC50。

1.4.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

為了確定BD3526產(chǎn)AGI的最佳條件，在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以培養(yǎng)時(shí)間(A)、培養(yǎng)溫度(B)、脫脂乳濃度(C)、三角瓶裝量(D)4個(gè)因素為自變量，IC50為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面法(response surface methodology，RSM)設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平表Table 1 Factors and levels of RSM

1.4.6 驗(yàn)證與比較實(shí)驗(yàn)

根據(jù)RSM法獲得的優(yōu)選條件以及優(yōu)化前的方法制備發(fā)酵乳并測(cè)定IC50，對(duì)響應(yīng)面預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)比較條件優(yōu)化前后的BD3526產(chǎn)AGI的效果差異。

1.4.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及回歸模型建立，運(yùn)用Origin Pro 2016、Excel 2013 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)BD3526產(chǎn)AGI的影響

將BD3526種子液按2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入裝有50 mL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂乳培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)不同時(shí)間(12、24、36、48、60 h)后獲得的發(fā)酵乳IC50如圖1所示。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)BD3526產(chǎn)AGI的影響Fig.1 Effect of fermentation time on AGI-production of Paenibacillus bovis BD3526

在BD3525接種后的12～60 h內(nèi)，發(fā)酵乳IC50呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，在發(fā)酵前期(12～48 h)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，IC50緩慢下降，各時(shí)間點(diǎn)的IC50分別為：35(12 h)、26.8(24 h)、22.4(36 h)、20.3 mg/mL(48 h)，表明BD3526代謝產(chǎn)生的AGI正隨著發(fā)酵程度的加深而逐步積累，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至60 h時(shí)，IC50并未進(jìn)一步降低，反而顯著升高(42.4 mg/mL)，說(shuō)明前期積累的AGI被迅速消耗，可能的原因是：(1)發(fā)酵后期(48～60 h)的體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已趨于貧乏，前期積累的代謝產(chǎn)物被視為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源而被菌株加以利用；(2)菌株為了維持必要的生境而分解過(guò)度積累的代謝產(chǎn)物。類(lèi)似的AGI合成特點(diǎn)在其他同類(lèi)研究中也常被提及，例如范文婭等[9]發(fā)現(xiàn)，接種LC2W培養(yǎng)96 h后獲得的發(fā)酵乳對(duì)糖苷酶抑制效果最佳，但隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，其體外降糖效果會(huì)逐步降低，因此，推測(cè)發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致發(fā)酵前期代謝產(chǎn)生的抑制劑被利用或被菌體裂解產(chǎn)生的胞內(nèi)酶破壞。鑒于48 h發(fā)酵乳的IC50最低，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用48 h作為最適培養(yǎng)時(shí)間。

2.1.2 培養(yǎng)溫度對(duì)BD3526產(chǎn)AGI的影響

將BD3526種子液以2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入50 mL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂乳培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，分別置于20、25、30、35和40 ℃條件下，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后獲得的發(fā)酵乳IC50如圖2所示。

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)BD3526產(chǎn)AGI的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on AGI-production of Paenibacillus bovis BD3526

培養(yǎng)溫度對(duì)BD3526產(chǎn)AGI能力的影響較大，不同樣品組的IC50差異較大。其中，40 ℃發(fā)酵乳的糖苷酶的IC50最高(47.2 mg/mL)，20 ℃發(fā)酵乳的IC50次之(36.1 mg/mL)，說(shuō)明過(guò)低(20 ℃)或過(guò)高(40 ℃)的培養(yǎng)溫度均不利于AGI大量合成或積累，而在30 ℃條件下制備的BD3526發(fā)酵乳的IC50最低(20.3 mg/mL)，表明30 ℃為BD3526代謝脫脂乳產(chǎn)AGI的優(yōu)選培養(yǎng)溫度；此外，該條件與類(lèi)芽孢桿菌家族其他菌株(如多粘類(lèi)芽孢桿菌[10]等)的最適生長(zhǎng)條件基本吻合[11]，所以，由糖苷酶抑制活性與菌體生長(zhǎng)的正相關(guān)性推測(cè)可得，AGI極有可能是該菌株生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物之一。

2.1.3 脫脂乳濃度對(duì)BD3526產(chǎn)AGI的影響

將BD3526種子液按2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入裝有50 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%和10%脫脂乳培養(yǎng)基中， 30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后獲得的發(fā)酵乳IC50如圖3所示。

圖3 脫脂乳濃度對(duì)BD3526產(chǎn)AGI的影響Fig.3 Effect of skimmed milk concentration on AGI-production of Paenibacillus bovis BD3526

當(dāng)脫脂乳濃度較低(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%)時(shí)，BD3526發(fā)酵乳的IC50較高(20.2 mg/mL)，說(shuō)明合成的AGI較少，這可能是發(fā)酵體系中的營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)不足造成的。將脫脂乳質(zhì)量濃度增加至40 g/L時(shí)發(fā)酵乳IC50達(dá)到最低(16.8 mg/mL)，表明此時(shí)BD3526合成與積累AGI的效果最佳。然而，繼續(xù)增加脫脂乳濃度并未對(duì)AGI的產(chǎn)量有進(jìn)一步促進(jìn)作用，6%、8%以及10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的脫脂乳培養(yǎng)基制備而得的發(fā)酵乳所對(duì)應(yīng)的糖苷酶IC50分別為：17.9、19.4和20.3 mg/mL，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因：(1)增加的營(yíng)養(yǎng)成分(脫脂乳)促進(jìn)了菌體的大量增殖，迅速富集的有害代謝產(chǎn)物影響了AGI的生物合成；(2)脫脂乳濃度的增加提高了發(fā)酵體系的滲透壓，高滲環(huán)境對(duì)菌體的正常代謝有一定影響。考慮到脫脂乳濃度4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的發(fā)酵乳IC50最低，故選用4%為最適脫脂乳濃度。

2.1.4 三角瓶裝量對(duì)BD3526產(chǎn)AGI的影響

將BD3526種子液按2%(體積分?jǐn)?shù))接種量分別接入分別裝有25、50、75、100和125 mL，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂乳培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后獲得的發(fā)酵乳IC50如圖4所示。

圖4 三角瓶裝量對(duì)BD3526產(chǎn)AGI的影響Fig.4 Effect of amount of medium per flask on AGI-production of Paenibacillus bovis BD3526

BD3526是最近發(fā)現(xiàn)的一株類(lèi)芽孢桿菌新種[12]，為典型的好氧菌，因此，發(fā)酵體系的通氣狀況直接影響B(tài)D3526的生長(zhǎng)狀態(tài)與目標(biāo)代謝物的產(chǎn)量。若三角瓶裝量過(guò)多，則發(fā)酵體系通氣不足，AGI的產(chǎn)量會(huì)因菌株生長(zhǎng)不充分而降低，相反地，若裝量過(guò)少，又會(huì)因菌體過(guò)度生長(zhǎng)使原本用于合成AGI的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被快速消耗殆盡。由圖4分析可知，裝量為25、75、100和125 mL/250 mL時(shí)制備的發(fā)酵乳IC50相對(duì)較高，分別為18.7、19.1、21.5和23.4 mg/mL，前者屬于裝量過(guò)少的情況，后三者是裝量過(guò)多所致，裝量50 mL/250 mL時(shí)所制備發(fā)酵乳的IC50最低(17 mg/mL)，因此為本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選裝量。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)及回歸分析

利用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)多變量發(fā)酵體系中的研究因素(培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、脫脂乳濃度、三角瓶裝量)和評(píng)價(jià)因素(IC50)的相關(guān)性和及其相互影響進(jìn)行分析，通過(guò)軟件(Design Expert 8.0.6)推算建立二次回歸數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而獲得優(yōu)選的發(fā)酵因素組合。

根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)的原理，設(shè)計(jì)N=29的4因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其中析因點(diǎn)24個(gè)，區(qū)域中心零點(diǎn)的重復(fù)實(shí)驗(yàn)5個(gè)。具體實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of RSM

續(xù)表2

實(shí)驗(yàn)號(hào)自變量響應(yīng)值A(chǔ)BCDIC50/(mg·mL-1)19-10102020101038210-10-121.822010-128230-10121.62401012825000016.826000016.927000016.82800001729000016.9

進(jìn)一步利用Design Expert 8.0.6對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到多元二次響應(yīng)面回歸模型：IC50(mg/mL)=16.88+8.98A+3.08B-1.50C-0.075D+0.075AB-0.30AC+0.40AD-0.025BC+0.05BD-0.18CD+11.04A2+ 6.11B2+ 2.56C2+ 2.14D2。該模型的R2=0.998 4，調(diào)整R2=0.996 8，說(shuō)明回歸方程與數(shù)據(jù)的擬合度較高，可解釋99.68%實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果。二次響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of the quadratic response surface regression model

注：*表示顯著，P<0.05；**表示極顯著，P<0.01

該模型顯著(模型P值<0.0001)，且無(wú)失擬因素存在(失擬項(xiàng)P值為0.178 6>0.05)。各因素的交互作用對(duì)IC50的影響順序?yàn)椋篈D(0.116 5)>AC(0.230 1)>CD(0.476 2)>AB(0.758 4)>BD(0.837 3)>BC(0.918 2)，其中，部分因素的交互作用(A和B、C和D)對(duì)IC50的影響如圖5所示。

A-培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的交互作用；B-脫脂乳濃度和三角瓶裝量的交互作用圖5 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間、脫脂乳濃度和三角瓶裝量的交互作用對(duì)IC50的影響Fig.5 The effect of the interactions of cultivation temperature and cultivation time, skimmed milk concentration and amount of medium per flask on IC50

由圖5可知，各因素在所選范圍均存在響應(yīng)最高點(diǎn)，這與表3中模型的顯著性結(jié)果一致。根據(jù)二次回歸模型的預(yù)測(cè)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為43.04 h、培養(yǎng)溫度為29.39 ℃、脫脂乳濃度為4.85%、三角瓶裝量為52.43 mL/250 mL時(shí)，菌株BD3526發(fā)酵乳的最低IC50可達(dá)14.6 mg/mL。綜合考慮了后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可操作性，對(duì)上述優(yōu)化條件進(jìn)行修正：培養(yǎng)時(shí)間為43 h，培養(yǎng)溫度為29 ℃，脫脂乳濃度為5%、三角瓶裝量為50 mL/250 mL。

2.2.2 驗(yàn)證與比較

為驗(yàn)證優(yōu)化實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，在上述優(yōu)選條件下制備BD3526發(fā)酵乳(n=3)，并測(cè)定糖苷酶的IC50，同時(shí)與優(yōu)化前的條件(培養(yǎng)時(shí)間為36 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，脫脂乳濃度為10%、三角瓶裝量為50 mL/250mL)所制備的發(fā)酵乳進(jìn)行比較，結(jié)果如圖6所示。

圖6 驗(yàn)證與比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of the validation and comparison experiments

驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)：(1)優(yōu)化條件下實(shí)測(cè)的BD3526發(fā)酵乳IC50均值為15.1 mg/mL，基本與模型預(yù)測(cè)值(14.6 mg/mL)保持同一水平；(2)優(yōu)化后的實(shí)測(cè)IC50值比優(yōu)化前(22.4 mg/mL)降低了33%，上述結(jié)果表明響應(yīng)面法對(duì)BD3526發(fā)酵乳制備工藝的條件優(yōu)化是有效的。

3 結(jié)論與討論

BD3526是1株從西藏生牦牛乳中分離得到的類(lèi)芽孢桿菌，經(jīng)生理生化、16S rDNA等分類(lèi)數(shù)據(jù)的比較后發(fā)現(xiàn)，該菌株為1株類(lèi)芽孢桿菌新種，命名為Paenibacillusbovis(牛類(lèi)芽孢桿菌)，為該種的模式菌株[12]。隨后，圍繞BD3526的各類(lèi)研究相繼展開(kāi)。杭鋒等發(fā)現(xiàn)，BD3526可代謝小麥麩皮產(chǎn)生一種高活性的凝乳酶[13-14]，并進(jìn)一步研究了該金屬蛋白酶的分離純化過(guò)程[15]、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[16]及其對(duì)乳蛋白的水解位點(diǎn)的影響[17]。BD3526能利用多種培養(yǎng)基(麩皮[18]、無(wú)氮培養(yǎng)基[19]、半合成培養(yǎng)基[20])合成具有特定生物活性(增強(qiáng)免疫)的胞外多糖(Levan等)，兼具抑菌[21-22]、促生長(zhǎng)[23]等積極的益生功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，脫脂乳經(jīng)BD3526發(fā)酵(培養(yǎng)時(shí)間為36 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，脫脂乳濃度為10%、三角瓶裝量為50 mL/250 mL)后對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度IC50為22.4 mg/mL，為進(jìn)一步提高目標(biāo)抑制物的產(chǎn)量以利于后續(xù)的分離提取工作順利開(kāi)展，本文對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

本文首先采用單因素實(shí)驗(yàn)確定了培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、脫脂乳濃度和三角瓶裝量的優(yōu)選值，分別為48 h、30 ℃、4%和50 mL/250 mL，在此基礎(chǔ)上，再利用響應(yīng)面法考察了各因素的相互作用對(duì)α-葡萄糖苷酶IC50的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為43 h，培養(yǎng)溫度為29 ℃，脫脂乳濃度為5%、三角瓶裝量為50 mL/250 mL時(shí)，BD3526發(fā)酵乳的IC50為15.1 mg/mL，進(jìn)一步地驗(yàn)證與比較實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)際值與理論值(14.6 mg/mL)基本一致，比優(yōu)化前(22.4 mg/mL)降低了33%。