大豆類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT73C19的功能研究

狄少康，尹青崗，夏亞迎,，龐永珍

大豆類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因的功能研究

狄少康1，尹青崗2，夏亞迎1,2，龐永珍1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2中國(guó)科學(xué)院植物研究所，北京 100093）

類黃酮是大豆中積累的一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，參與大豆的生長(zhǎng)、發(fā)育和抗逆等諸多生理活動(dòng)。由UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT）催化的糖基化修飾是類黃酮生物合成的關(guān)鍵步驟?！尽客ㄟ^(guò)系統(tǒng)研究大豆9編碼重組酶的體外酶活特性和體內(nèi)特性，完善大豆黃酮類化合物合成和積累的機(jī)制，為大豆品質(zhì)的遺傳改良提供基因資源和理論基礎(chǔ)。通過(guò)高效液相色譜（HPLC）的方法檢測(cè)大豆核心種質(zhì)資源葉片中類黃酮的種類和含量，通過(guò)qRT-PCR的方法檢測(cè)了的表達(dá)水平。以大豆Williams 82葉片cDNA為模板，克隆得到的編碼區(qū)序列。使用MEGA5和DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得UGT73C19的重組蛋白，分析UGT73C19重組蛋白對(duì)各種類黃酮苷元的糖基轉(zhuǎn)移活性，并通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，確定重組蛋白的糖基化位點(diǎn)。利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)在大豆不同組織的表達(dá)水平進(jìn)行分析。構(gòu)建植物過(guò)量表達(dá)載體，通過(guò)花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得表達(dá)量高的純合株系，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系葉片和種子中類黃酮的種類和含量。通過(guò)HPLC分析大豆核心種質(zhì)資源葉片類黃酮成分，發(fā)現(xiàn)不同品種中類黃酮的成分和含量存在明顯差異。根據(jù)類黃酮成分的不同，將大豆核心種質(zhì)分為12種不同的類型。大豆核心種質(zhì)資源葉片中總黃酮的含量與的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系?？寺〉玫降木幋a區(qū)序列，全長(zhǎng)1 482 bp，編碼493個(gè)氨基酸，UGT73C19蛋白在C-端有一個(gè)保守的PSPG結(jié)構(gòu)域。體外酶活分析表明，重組的UGT73C19蛋白對(duì)6種類黃酮苷元（山奈酚、槲皮素、楊梅素、芹黃素、大豆苷元和染料木素）都具有糖基轉(zhuǎn)移活性，其中對(duì)槲皮素的催化效率最高；糖基化位點(diǎn)分別位于類黃酮的5位和7位羥基上，重組UGT73C19蛋白的糖基化底物和位點(diǎn)具有多樣性。過(guò)量表達(dá)的擬南芥葉片和種子中的類黃酮總量明顯升高，其中葉片中總黃酮含量提高49%—70%，種子中總黃酮的含量提高34%—37%；尤其是種子中槲皮素3-鼠李糖的含量顯著增加。UGT73C19蛋白是催化合成大豆中多個(gè)類黃酮糖苷的關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶，過(guò)量表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植物中黃酮醇糖苷和類黃酮的含量。

大豆；糖基轉(zhuǎn)移酶基因；類黃酮；黃酮醇

0 引言

【研究意義】大豆（）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，不僅儲(chǔ)存了大量的蛋白質(zhì)與油脂，而且富含多種次生代謝產(chǎn)物，特別是黃酮、黃酮醇、異黃酮等類黃酮化合物[1-2]。大豆類黃酮廣泛參與共生、防御和抗性等生理過(guò)程[3-5]。此外，大豆類黃酮還具有抗氧化、清除氧自由基和抗癌等對(duì)人類健康有益的功能[6-9]。因此，闡明大豆類黃酮的未知生物合成途徑，將有利于提高大豆類黃酮的含量，改良大豆的品質(zhì)。【前人研究進(jìn)展】盡管類黃酮的基本骨架結(jié)構(gòu)十分保守，然而糖基化、甲基化和?；榷喾N修飾反應(yīng)使類黃酮的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜和多樣化。其中，由UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT）催化的糖基化反應(yīng)是類黃酮生物合成途徑末端的關(guān)鍵步驟，糖基化可以提高類黃酮的穩(wěn)定性、多樣性和生物活性[10-12]。Yonekura-Sakakibara等[13]通過(guò)預(yù)測(cè)植物UGT家族的序列相似性，發(fā)現(xiàn)大豆中存在200多個(gè)，但是絕大多數(shù)大豆的功能還未被闡明。研究表明，在大豆種皮中特異表達(dá)僅對(duì)花青素和黃酮醇具有催化活性[14]。體外表達(dá)的重組蛋白IF7GT可以糖基化異黃酮，生成異黃酮7--葡萄糖苷（isoflavone 7--β-D-glucosides）[15]。另外4個(gè)UGT88家族的重組蛋白（UGT88E14、UGT88E15、UGT88E16和UGT88E18）可以特異催化異黃酮（主要是genistein和daidzein）形成不同類型的異黃酮糖苷。特別是重組UGT73F2蛋白對(duì)3種異黃酮（daidzin、genistin和glycitin）均具有糖基轉(zhuǎn)移活性[16]。近期，YIN等[17]從更新的大豆基因組中對(duì)進(jìn)行了全基因組水平的鑒定和分析，共鑒定212個(gè)候選基因，發(fā)現(xiàn)它們以成簇的方式廣泛分布于20個(gè)染色體，對(duì)其中的188個(gè)表達(dá)譜進(jìn)行了分析。從中克隆并詳細(xì)研究了11個(gè)的特征，發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)重組UGT蛋白（UGT72X4、UGT72Z3、UGT73C20、UGT88A13、UGT88E19和UGT92G4）具有糖基化黃酮醇、黃酮、異黃酮的活性，它們?cè)诖蠖姑珷罡蛿M南芥中的過(guò)量表達(dá)可以顯著提高黃酮醇和/或異黃酮的含量[17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然在大豆中已經(jīng)鑒定了若干個(gè)糖基化類黃酮的[14-17]，但是相對(duì)于大豆中存在的上百種糖基化的類黃酮[1,18]和200多個(gè)大豆而言[17,19]，目前已經(jīng)被功能鑒定的僅僅是很少的一部分。由于大豆及其功能的多樣性、普遍性和復(fù)雜性[13,17]，還需要更深入地研究的特性及其功能，以期系統(tǒng)闡明大豆類黃酮的生物合成機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用大豆基因組和表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選到一個(gè)與大豆葉片類黃酮積累水平相關(guān)的候選（），發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)水平與大豆核心種質(zhì)資源中的類黃酮含量正相關(guān)。通過(guò)克隆該基因并分析其重組蛋白的底物及其酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)；在擬南芥中異源過(guò)量表達(dá)，闡明對(duì)擬南芥葉片和種子黃酮醇的種類和含量的影響。對(duì)于系統(tǒng)研究大豆類黃酮的糖基化機(jī)制、大豆分子輔助育種和改良大豆類黃酮的品質(zhì)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為大豆Williams 82和大豆核心種質(zhì)資源，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所大豆育種和資源課題組提供。轉(zhuǎn)基因擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型（Columbia-0）。大腸桿菌（）DH5α和Novablue、農(nóng)桿菌GV3101、原核表達(dá)載體pMAL-C2X均由龐永珍實(shí)驗(yàn)室保存。植物表達(dá)載體pCXSN由西南大學(xué)羅克明教授提供。

1.2 UGT73C19的克隆與進(jìn)化分析

從2周苗齡的大豆Williams 82葉片中提取總RNA（TRIzol A+，天根生化），使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（promega corporation）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。根據(jù)前期預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)[9]以及phytozome公布的大豆的CDS序列設(shè)計(jì)引物，使用高保真酶Phusion（Thermo Fisher Scientific Inc.）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆的開(kāi)放閱讀框并進(jìn)行測(cè)序鑒定。通過(guò)軟件MEGA5 version 5.2.2（http://www.megasoftware. net/）分析UGT73C19蛋白序列和其他植物來(lái)源UGT的同源性。

1.3 類黃酮的提取和分析

收集大豆葉片、擬南芥葉片和擬南芥種子，在液氮中研磨，冷凍干燥，稱取50 mg凍干樣品，加入1 ml甲醇混勻。超聲30 min，4℃過(guò)夜，12 000 r/min轉(zhuǎn)速，4℃離心10 min，取100 μl上層溶液，置于200 μl內(nèi)襯管中，使用液相色譜ACQUITY UPLC HSS C18 column（1.7 μm，100×2.1 mm i.d.，Waters）進(jìn)行分離。色譜柱柱溫為30℃，流速為0.4 ml·min-1，其中A流動(dòng)相為水（含0.1%甲酸），B流動(dòng)相為乙腈，洗脫梯度為：0—30 min，B相從95%線性梯度降至70%。上樣體積為2 μl。

1.4 體外酶活試驗(yàn)

經(jīng)HⅠ和Ⅰ雙酶切的與含有MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）標(biāo)簽的pMAL-C2X載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（DH5α），鑒定序列正確后，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Novablue，使用0.5 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，參照pMAL融合蛋白和純化系統(tǒng)（New England BioLab Inc.）純化重組蛋白。

分析重組蛋白對(duì)各種類黃酮苷元的糖基轉(zhuǎn)移活性，酶活反應(yīng)體系為50 μl（1 mmol·L-1DTT，100 mmol·L-1Tris-HCl（pH7.5），10 μg重組蛋白，4 mmol·L-1UDP-glucose）；30℃反應(yīng)0.5 h后，加入等體積的甲醇終止反應(yīng)。通過(guò)UPLC對(duì)酶活產(chǎn)物進(jìn)行初步分析，再通過(guò)HPLC-MS對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，確定產(chǎn)物糖基化的位點(diǎn)。通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)分析，確定重組蛋白的最適底物和催化效率。質(zhì)譜分析條件為：電噴霧離子化，全離子掃描，利用Analytical software（MassLynx，version4.1）控制Xevo TQ-MS spectrometer（Waters，Milford，MA，USA）在正負(fù)離子模式（PI和NI）下進(jìn)行質(zhì)譜分析。脫溶劑氣溫度為400℃；脫溶劑氣流速率（N2）為800 L·h-1；氣簾氣流量，50 L·h-1；PI：錐孔電壓，30 V；毛細(xì)管電壓，3 kV；NI則分別是-60 V和2 kV；采集質(zhì)譜范圍：100—1 000 m·z-1。

1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得和分析

將與由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物過(guò)量表達(dá)載體pCXSN連接，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，通過(guò)花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥。使用qRT-PCR確認(rèn)轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平，從中篩選表達(dá)量最高的3個(gè)株系進(jìn)行深入分析。獲得T3純合的擬南芥，分析其21 d幼苗（地上部分）和成熟種子類黃酮的成分與含量。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

根據(jù)全長(zhǎng)序列，利用Primer3.0在線工具（http://primer3.ut.ee/）設(shè)計(jì)1對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（F：5′-CCTGTACCAGATACACACATC-3′；R：5′-CATTAGAGAGTCCTGCAGGTA-3′），以大豆為內(nèi)參基因。對(duì)不同大豆組織中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系和條件參照Yin等[17]方法，每個(gè)材料均具有3次技術(shù)重復(fù)，以2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥材料中的表達(dá)量進(jìn)行分析時(shí)，以擬南芥為內(nèi)參基因，方法同上。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，采用-test法進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 UGT73C19的表達(dá)水平與大豆葉片黃酮醇含量的關(guān)聯(lián)分析

大豆葉片中類黃酮主要以黃酮醇糖苷的形式存在[18]，通過(guò)對(duì)大豆核心種質(zhì)中類黃酮成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同品種中類黃酮的成分和含量存在明顯差異（圖1）。故根據(jù)類黃酮成分的不同，將大豆核心種質(zhì)分為12種不同的類型（圖1）。在這12種類型中，其中第3和12類型分別與已經(jīng)報(bào)道的大豆材料Nezumisaya和Harosoy的類黃酮組成一致[20-21]，第8和11類型分別與Kitakomachi和Koganejir的類黃酮組成一致[22]，這4個(gè)大豆材料中的主要類黃酮成分已經(jīng)被鑒定。大豆中不同類黃酮類型的差異主要是由黃酮醇糖基化的不同位置和數(shù)量造成的，而糖基轉(zhuǎn)移酶UGT正是造成這種差異的主要原因。即使在相同類型的品種中，類黃酮（主要是黃酮醇）含量的差異也非常大，而的表達(dá)水平和活性很有可能是決定不同黃酮醇糖苷含量的關(guān)鍵因素。

圖1 大豆核心種質(zhì)資源葉片中12種不同黃酮醇糖苷類型分析

圖2 大豆類黃酮含量與UGT73C19表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)分析

分別選擇同一類型（第5號(hào)類型含有最豐富的大豆種質(zhì)資源，其中還包括基因組序列已知的大豆材料Williams 82和Clark）中類黃酮總量不同的20個(gè)大豆材料（高含量和低含量的品種各10個(gè)），檢測(cè)類黃酮的含量和不同在大豆葉片中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在類黃酮含量高的材料中，的表達(dá)水平也相對(duì)較高；而在類黃酮含量較低的材料中，的表達(dá)水平很低或者基本不表達(dá)（圖2）。表明在類黃酮類型相同的大豆材料中，類黃酮的含量與的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系。

2.2 UGT73C19的克隆與進(jìn)化分析

從Williams82葉片中克隆得到（Glyma03g187000）序列。編碼區(qū)全長(zhǎng)1 482 bp，編碼493個(gè)氨基酸。與大豆中已知功能的UGT蛋白的多重序列比對(duì)表明，UGT73C19和功能已知的UGT73C20[17]的氨基酸序列相似度最高，達(dá)到82%，而與其他植物UGT蛋白，如Nt7Gt、Db7Gt、Sb7Gt和At7Rt的相似性分別為46%、44%、43%和28%[23-26]。UGT73C19保守的植物糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（PSPG，Putative secondary plant glycosyltransferase）出現(xiàn)在第331—351位氨基酸位點(diǎn)，UGT73C19與其他蛋白在PSPG結(jié)構(gòu)域內(nèi)的相似性較高，在其他區(qū)域的相似性較低（圖3）。

通過(guò)對(duì)含有多個(gè)類黃酮UGT蛋白的進(jìn)化分析，表明UGT73C19與來(lái)源的Db7Gt[23]、來(lái)源的Nt7Gt[24]、來(lái)源的Sb7Gt[25]等7位羥基糖基化的蛋白聚成一簇（圖4），推測(cè)UGT73C19很可能催化類黃酮7-位的糖基化反應(yīng)；同時(shí)，UGT73C19與UGT73C20的進(jìn)化關(guān)系最近，推測(cè)它們可能具有相似的功能。相反，UGT73C19并不與催化大豆葉片中合成黃酮醇多糖苷的蛋白Fg1（GmF3G6Gt）或Fg3（GmF3G6Rt）[20-21]聚成一簇，說(shuō)明UGT73C19可能并沒(méi)有催化合成多糖苷的功能。

2.3 UGT73C19的組織表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR對(duì)在不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果（圖5）表明，在各組織均有表達(dá)，但在葉片和發(fā)育晚期的種子（開(kāi)花后80 d）中的表達(dá)水平相對(duì)較高，說(shuō)明可能主要在葉片和種子發(fā)育晚期中發(fā)揮作用。

黑色背景的氨基酸相似度為100%，深灰色背景的相似度大于75%，淺灰色背景的相似度在50%—75%。虛線方框位置為PSPG結(jié)構(gòu)域

2.4 重組UGT73C19蛋白的體外酶活分析

將與蛋白表達(dá)載體pMAL-C2X連接，通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)并純化重組蛋白，發(fā)現(xiàn)含麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽的重組蛋白大小約為95.6 kD。以UDP-葡萄糖為糖基供體，以代表性的類黃酮苷元（黃酮醇、黃酮和異黃酮共16種）等為糖基供體，對(duì)重組UGT73C19蛋白進(jìn)行體外酶活分析。結(jié)果表明，重組的UGT73C19蛋白對(duì)黃酮醇（山奈酚（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）、楊梅素（Myricetin））、黃酮（芹黃素（Apigenin））和異黃酮（大豆苷元（Daidzein）、染料木素（Genistein））具有活性（圖6）。

HPLC結(jié)果顯示，含有UGT73C19重組蛋白的反應(yīng)產(chǎn)生了新的化合物峰（圖6-a—圖6-f，上圖），而含失活蛋白的對(duì)照反應(yīng)并沒(méi)有產(chǎn)生新的化合物峰（圖6-a—圖6-f，下圖）。通過(guò)分析對(duì)應(yīng)化合物裂解的碎片的質(zhì)核比并與文獻(xiàn)中標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)[17,27]，發(fā)現(xiàn)糖基化的位點(diǎn)分別在山奈酚（Kaempferol）和芹黃素（Apigenin）的5位羥基（圖7-A Ka：285.1、K5G：446.8；圖7-D Ap：269.1、A5G：431.0）、楊梅素（Myricetin）和大豆苷元（Daidzein）的7位羥基（圖7-C My：316.7、M7G：479.1；圖7-E Da：253.0、D7G：415.1）、槲皮素（Quercetin）的4/5/7位羥基（圖7-B Qu：300.8、Q4G：463.4）、染料木素（Genistein）的5/7位羥基（圖7-F G：269.0、G7G：431.1），說(shuō)明UGT73C19的糖基化底物和位點(diǎn)具有多樣性。

進(jìn)一步以具有活性的6種類黃酮為底物、以UDP-葡萄糖為糖基供體進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，重組UGT73C19蛋白對(duì)這6種底物的親和程度不同，其中對(duì)楊梅素（Myricetin）的K最低（為34.69 μmol·L-1）（表1），說(shuō)明楊梅素可能是UGT73C19的最適底物。重組UGT73C19蛋白對(duì)Kaempferol、Quercetin、Myricetin、Apigenin、Daidzein和Genistein的K/K值分別為297.62、302.50、291.258、101.60、70.01和97.92（s-1·M-1）（表1），結(jié)果表明，在這些底物中，UGT73C19蛋白對(duì)Quercetin的催化效率最高。綜上所述，重組UGT73C19蛋白在體外對(duì)3種黃酮醇（Kaempferol、Quercetin和Myricetin）、2種異黃酮（Daidzein和Genistein）和1種黃酮（Apigenin）具有糖基化活性，其中對(duì)3種黃酮醇的催化效率相對(duì)較高，對(duì)黃酮醇中的楊梅素（Myricetin）的親和度最高。

蛋白名稱和Genbank登錄號(hào)如下：At3Rt：NM_102790；At3Gt：NM_121711；Vv3Gt：AF000371；Ph3Gt：AB027454；Pf3Gt：AB002818；Hv3Gt：X15694；Zm3Gt：X13501；At5Gt：NM_117485；Pf5Gt：AB013596；Vh5Gt：BAA36423；Ph5Gt：AB027455；Db7G：CAB56231；Nt7Gt：AAB36653；Sb7Gt：BAA83484；At7Rt：AY093133；CmF7G2Rt：AAL06646；CsF7G6Rt：ABA18631；IpA3G2Gt：AB192315；PhA3G6Rt：X71059；BpA3G2Glt：AB190262；AtF3G2Gt：Q9FN26；GmF3G2Gt：NP_001345948；GmF3G6Gt：NP_001345940；GmF3G6Rt：I1LCI8；UGT73C19：XM003521374.1；UGT73C20：XM003554355.1。G：葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶glucosyltransferase；Rt：鼠李糖苷轉(zhuǎn)移酶rhamnosyltransferase；Glt：葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶 glucuronosyltransferase

圖5 大豆UGT73C19的組織表達(dá)分析

上圖為UGT73C19重組蛋白的酶活產(chǎn)物，下圖為失活蛋白的對(duì)照產(chǎn)物；a：山奈酚；b：槲皮素；c：楊梅素；d：芹黃素；e：大豆苷元；f：染料木素。K：山奈酚；A：芹黃素；M：楊梅素；D：大豆苷元；Q：槲皮素；G：染料木素；K5G：3-O-葡萄糖苷山奈酚；A5G：5-O-葡萄糖苷芹黃素；Q5G：5-O-葡萄糖苷槲皮素；Q4G：4-O-葡萄糖苷槲皮素；Q7G：7-O-葡萄糖苷槲皮素；D7G：7-O-葡萄糖苷大豆苷元；M7G：7-O-葡萄糖苷楊梅素；G7G：7-O-葡萄糖苷染料木素；通過(guò)保留時(shí)間、紫外吸收譜、質(zhì)譜結(jié)構(gòu)和文獻(xiàn)綜合比對(duì)分析

A：UGT73C19+Ka（K5G）；B：UGT73C19+Qu（Q4G）；C：UGT73C19+My（M7G）；D：UGT73C19+Ap（A5G）；E：UGT73C19+Da（D7G）；F：UGT73C19+G（G7G）

表1 重組UGT73C19蛋白的酶動(dòng)力學(xué)分析

2.5 UGT73C19在擬南芥中的過(guò)量表達(dá)

為了驗(yàn)證的體內(nèi)功能，通過(guò)花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，利用qRT-PCR的方法篩選出轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量相對(duì)較高的3個(gè)株系OE-1、OE-2和OE-5（圖8-A）。野生型擬南芥幼苗中主要存在3種黃酮醇的山萘酚糖苷，分別為kaempferol 3--rhamnoside---rhamnoside （KR3R7）、kaempferol 3--glucoside- 7--rhamnoside（KG3R7）和kaempferol-3--[rhamnosyl (1→2glucoside)]-7--rhamnoside（KGR3R7）[28]（圖8-B）。通過(guò)高效液相色譜（HPLC）分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗中這3種山萘酚糖苷都明顯降低，分別降低了59%、56%和66%（圖8-C）。

*：P<0.05；**：P<0.01

野生型擬南芥種子中含有3種主要的黃酮醇糖苷，分別為槲皮素糖苷[28]（圖8-D）：Quercetin 3--glucoside-7--rhamnoside（QG3R7）、Quercetin 3--rhamnoside-7--rhamnoside（QR3R7）和Quercetin 3--rhamnoside（QR3）。定量分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)于野生型而言，種子中槲皮素二糖苷QG3R7、QR3R7分別降低了33%和30%；而單糖苷QR3含量則極顯著地增加了4.15倍，最終使槲皮素糖苷總量顯著升高了22%（圖8-E）。

綜合檢測(cè)轉(zhuǎn)基因幼苗和種子中總黃酮的含量，發(fā)現(xiàn)3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系幼苗中總黃酮的含量分別增加為62%、49%和70%；種子中總黃酮的含量與對(duì)照相比也顯著提高，分別提高了34%、37%和35%（圖8-F）。

3 討論

3.1 UGT73C19的表達(dá)特性

UDP糖基轉(zhuǎn)移酶是在植物體內(nèi)廣泛存在的一類蛋白質(zhì)，在植物次生代謝物的修飾方面具有重要的作用。對(duì)于類黃酮而言，由UGT催化的糖基化反應(yīng)可以增加類黃酮的多樣性，使植物更好適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境[13]。本研究中基因的組織特異性表達(dá)譜分析表明，主要在葉片中表達(dá)，這與葉片中積累大量的黃酮醇是一致的[22]，同時(shí)該重組蛋白具有糖基化黃酮醇苷元的作用，所以可能在葉片中負(fù)責(zé)黃酮醇糖苷的合成。另外，還在種子成熟后期表達(dá)，大豆種子中主要積累異黃酮[28]，表明可能也負(fù)責(zé)大豆種子中異黃酮糖苷的積累。大豆中存在200多個(gè)不同的，存在基因冗余的現(xiàn)象[17]，其中被驗(yàn)證具有糖基化類黃酮功能的編碼基因僅10余個(gè)，這些分別在不同的組織部位表達(dá)，這些蛋白很有可能具有不同的分工，分別負(fù)責(zé)不同類黃酮的一次或者多次糖基化，形成多樣化的類黃酮衍生物，以適應(yīng)不同的環(huán)境變化。

3.2 UGT73C19蛋白的底物特異性

本研究通過(guò)體外表達(dá)重組蛋白的方法，對(duì)重組蛋白UGT73C19的酶活特性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該重組蛋白可以催化黃酮醇、黃酮和異黃酮共3類6種苷元的糖基化反應(yīng)，說(shuō)明該重組蛋白并非對(duì)單一底物具有活性，而是具有底物多樣性。底物多樣性這一特點(diǎn)與UGT73C20、UGT88A13[17]和IF7GT[15]相似，這幾個(gè)UGT都具有相似的底物譜。同時(shí)，底物多樣性這一特征與大豆中鑒定的其他UGTs也具有相似性。其中大豆UGT73F2對(duì)大豆種子主要存在的3種異黃酮（daidzin、genistin和glycitin）具有糖基化活性[15]；重組的UGT72X4、UGT72Z3和UGT92G4蛋白可以特異地催化黃酮醇的糖基化[17]。另外，UGT79B30[20]和UGT79A6[22]還可以催化黃酮醇糖苷的二次糖基化，產(chǎn)生黃酮醇二糖糖苷。相對(duì)而言，UGT73C19催化的底物種類更多，但是其并不具有UGT79B30催化類黃酮糖苷的二次糖基化的功能。

UGT73C19和UGT73C20具有較高的序列相似性，在進(jìn)化樹(shù)上與UGT73C20聚類于7--糖基轉(zhuǎn)移酶簇，體外的酶活分析也證明，UGT73C19也具有在7位羥基產(chǎn)生糖苷的功能，與UGT73C20的底物譜最為接近（對(duì)黃酮和異黃酮具有活性）[17]，說(shuō)明可以通過(guò)序列和進(jìn)化關(guān)系大致預(yù)測(cè)UGT蛋白的催化底物。

3.3 UGT73C19的體內(nèi)外功能

雖然UGT73C19重組蛋白在體外對(duì)3種黃酮醇（Kaempferol、Quercetin和Myricetin）、2種異黃酮（Daidzein和Genistein）和1種黃酮（Apigenin）單體都具有糖基化活性，但是在轉(zhuǎn)基因擬南芥中，由于黃酮醇積累的組織特異性，轉(zhuǎn)基因幼苗中以山奈酚為主的（Kaempferol）并沒(méi)有提高，反而降低，這一結(jié)果很有可能是由于內(nèi)源對(duì)應(yīng)的被抑制造成的。而在種子中，過(guò)表達(dá)可以明顯提高黃酮醇中的槲皮素（Quercetin）單糖苷QR3的含量，這與重組蛋白對(duì)槲皮素的相對(duì)較高的催化活性是一致的，同時(shí)說(shuō)明UGT73C19在體內(nèi)也可以利用鼠李糖作為糖基供體?？傮w而言，UGT73C19蛋白的體內(nèi)外功能并不完全一致，許多植物UGT都存在這一現(xiàn)象，造成這一現(xiàn)象的原因可能是植物體內(nèi)最適底物濃度或者是其它底物的抑制作用造成的[10,17,27-28]。同時(shí)，過(guò)量表達(dá)時(shí)，擬南芥中總黃酮的含量明顯提高，說(shuō)明UGT73C19在體內(nèi)的產(chǎn)物可能會(huì)通過(guò)反饋?zhàn)饔檬勾x流導(dǎo)向類黃酮途徑。

4 結(jié)論

是參與大豆葉片黃酮醇糖基化的關(guān)鍵基因。UGT73C19重組蛋白具有底物多樣性和糖基化位點(diǎn)多樣性的特征，是一個(gè)多功能的糖基轉(zhuǎn)移酶。的異源過(guò)量表達(dá)可以提高植物類黃酮的含量，是進(jìn)行植物類黃酮代謝工程的候選基因。

[1] HO H M, CHEN R Y, LEUNG L K, CHAN F L, HUANG Y, CHEN Z Y. Difference in flavonoid and isoflavone profile between soybean and soy leaf., 2002, 56: 289-295.

[2] DUE?AS M, HERNáNDEZ T, ROBREDO S, LAMPARSKI G, ESTRELLA I, MU?OZ R. Bioactive phenolic compounds of soybean (cv. Merit): modifications by different microbiological fermentations., 2012, 62(4): 241-250.

[3] SUBRAMANIAN S, STACEY G, YU O. Distinct, crucial roles of flavonoids during legume nodulation., 2007, 12(7): 282-285.

[4] 莊炳昌, 岳德榮, 王玉民, 李建平, 謝雪菊, 徐豹. 大豆不同品種次生代謝產(chǎn)物及相關(guān)酶類含量與抗食心蟲(chóng)的關(guān)系. 中國(guó)油料, 1992(3): 20-22.

ZHUANG B C, YUE D R, WANG Y M, LI J P, XIE X J, XU B. The correlation of content of flavonoid, total phenolate and enzyme in soybean with resistance level to, 1992(3): 20-22. (in Chinese)

[5] Liu C W, Murray J D. The role of flavonoids in nodulation host-range specificity: an update.,2016, 5(3): 33.

[6] Dixon R A, Steele C L. Flavonoids and isoflavonoids - a gold mine for metabolic engineering., 1999, 4(10): 394-400.

[7] Maggioni D, Biffi L, Nicolini G, Garavello W. Flavonoids in oral cancer prevention and therapy., 2015, 24(6): 517-528.

[8] HOSTETLER G L, RALSTON R A, SCHWARTZ S J. Flavones: food sources, bioavailability, metabolism, and bioactivity., 2017, 15; 8(3): 423-435.

[9] 楊碩, 徐元慶, 邢媛媛, 史彬林. 植物源黃酮類化合物對(duì)動(dòng)物免疫和抗氧化功能影響的研究進(jìn)展. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2019, 31(7): 2958-2964.

YANG S, XU Y Q, XING Y Y, SHI B L. Research advances on effects of plant-based flavonoids on immune and antioxidative functions in animals.,2019, , 31(7): 2958-2964. (in Chinese)

[10] JONES P, VOGT T. Glycosyltransferases in secondary plant metabolism: tranquilizers and stimulant controllers., 2001, 213: 164-174.

[11] GACHON C M, LANGLOIS-MEURINNE M, SAINDRENAN P. Plant secondary metabolism glycosyltransferases: the emerging functional analysis., 2005, 10: 542-549.

[12] CAPUTI L, MALNOY M, GOREMYKIN V, NIKIFOROVA S, MARTENS S. A genome-wide phylogenetic reconstruction of family 1 UDP-glycosyltransferases revealed the expansion of the family during the adaptation of plants to life on land., 2012, 69: 1030-1042

[13] Yonekura-Sakakibara K, Hanada K. An evolutionary view of functional diversity in family 1 glycosyltransferases., 2011, 66(1): 182-193.

[14] Kovinich N, Saleem A, Arnason J T, Miki B. Functional characterization of a UDP-glucose: flavonoid 3--glucosyltransferase from the seed coat of black soybean ((L.) Merr.).,2010, 71(11/12): 1253-1263.

[15] NOGUCHI A, SAITO A, HOMMA Y, NAKAO M, SASAKI N, NISHINO T, TAKAHASHI S, NAKAYAMA T. A UDP-glucose: isoflavone 7--glucosyltransferase from the roots of soybean () seedlings. Purification, gene cloning, phylogenetics, and an implication for an alternative strategy of enzyme catalysis., 2007, 282(32): 23581-23590.

[16] FUNAKI A, WAKI T, NOGUCHI A, KAWAI Y, YAMASHITA S, TAKAHASHI1 S AND NAKAYAMA T. Identification of a highly specific isoflavone 7--glucosyltransferase in the soybean ((L.) Merr.)., 2015, 56(8): 1512-1520.

[17] Yin Q, Shen G, Di S, Fan C, Chang Z, Pang Y. Genome-wide identification and functional characterization of UDP-glucosyltransferase genes involved in flavonoid biosynthesis in.,2017, 58(9): 1558-1572.

[18] Kim E H, Kim S L, Kim S H, Chung I M. Comparison of isoflavones and anthocyanins in soybean [(L.) Merrill] seeds of different planting dates., 2012, 60(41): 10196-10202.

[19] MAMOON REHMANA H, AMJAD NAWAZA M, BAO L, HUSSAIN SHAHB Z, LEE J M, AHMAD M Q, CHUNG G, YANG S H. Genome-wide analysis of Family-1 UDP-glycosyltransferases in soybean confirms their abundance and varied expression during seed development., 2016, 206: 87-97.

[20] Rodas F R, Di S, Murai Y, Iwashina T, Sugawara S, Mori T, Nakabayashi R, Yonekura-Sakakibara K, Saito K, Takahashi R. Cloning and characterization of soybean geneencoding flavonol 3--glucoside/galactoside (1→6) glucosyltransferase., 2016, 92(4/5): 445-456.

[21] Di S, Yan F, Rodas F R, Rodriguez T O, Murai Y, Iwashina T, Sugawara S, Mori T, Nakabayashi R, Yonekura-Sakakibara K, Saito K, Takahashi R. Linkage mapping, molecular cloning and functional analysis of soybean geneencoding flavonol 3--glucoside/galactoside (1→2) glucosyltransferase., 2015, 15: 126.

[22] Rodas F R, Rodriguez T O, Murai Y, Iwashina T, Sugawara S, Suzuki M, Nakabayashi R, Yonekura- Sakakibara K, Saito K, Kitajima J, Toda K, Takahashi R. Linkage mapping, molecular cloning and functional analysis of soybean geneencoding flavonol 3--glucoside (1→6) rhamnosyl transferase., 2014, 84(3): 287-00.

[23] VOGT T, GRIMM R, STRACK D. Cloning and expression of a cDNA encoding betanidin 5--glucosyltransferase, a betanidin- and flavonoid-specific enzyme with high homology to inducible glucosyltransferases from the Solanaceae., 1999, 19(5): 509-519.

[24] Horvath D M, Chua N H. Identification of an immediate- early salicylic acid-inducible tobacco gene and characterization of induction by other compounds., 1996, 31(5): 1061-1072.

[25] HIROTANI M, KURODA R, SUZUKI H, YOSHIKAWA T. Cloning and expression of UDP-glucose: flavonoid 7--glucosyltransferase from hairy root cultures of., 2000, 210(6): 1006-1013.

[26] YONEKURA-SAKAKIBARA K, TOHGE T, NIIDA R, SAITO K. Identification of a flavonol 7--rhamnosyltransferase gene determining flavonoid pattern inby transcriptome co-expression analysis and reverse genetics., 2007, 282(20): 14932-14941.

[27] Su X, Shen G, Di S, Dixon R A, Pang Y. Characterization of UGT716A1 as a multi-substrate UDP: flavonoid glucosyltransferase gene in., 2018, 8: e2085.

[28] YIN Q, SHEN G, CHANG Z, TANG Y, GAO H, PANG Y. Involvement of three putative glucosyltransferases from the UGT72 family in flavonol glucoside/rhamnoside biosynthesis inseeds., 2017, 68(3): 597-612.

Functional Characterization of a UDP: Flavonoid Glycosyltransferase Gene

DI Shaokang1, YIN Qinggang2, XIA Yaying1,2, PANG Yongzhen1

(1Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093)

【】 Flavonoids are a group of important plant secondary metabolites accumulate in soybean, which are involved in many physiological activities, including soybean growth, development and stress resistance. Glycosylation catalyzed by UDP-glycosyltransferase is a key step in flavonoid biosynthesis. 【】The objective of the present study is to investigate theenzymatic activity andfunction of a soybean glycosyltransferase protein encoded by thegene, the achievement of which will deep our understanding on the mechanism of the flavonoid biosynthesis in soybean. This study will provide gene resource and theoretical basis for the genetic modification in soybean. 【】 Flavonoids in the leaves of soybean core germplasm resources were detected by HPLC, and the expression level ofgenes were detected by qRT-PCR. The coding region of thegene was cloned from cDNA of soybean leaf (Williams 82). The amino acid sequences of UGT73C19 were searched in the NCBI database, and the software MEGA5 and DNAMAN were used for multiple sequence alignment and the construction of a phylogenetic tree. The recombinant UGT73C19 protein was expressed inand its enzymatic activity was determined towards various flavonoid aglycones. All the enzymatic products were identified by HPLC-MS. The expression profile of thegene in soybean was analyzed by qRT-PCR.was over-expressed inby floral dipping method. Flavonoid content and composition were determined in seedlings and seeds in homozygous lines that showed the relatively highexpression level. 【】 Flavonoids in the leaves of soybean core germplasm showed significant differences in flavonoid composition and content in different varieties. Soybean core germplasm can be divided into 12 different types according to flavonoid composition. There was a positive correlation between the content of flavonoids and the expression level ofgene in the leaves of soybean core germplasm resources. The coding sequence ofgene was cloned，and the coding region was found to be 1482 bp, encoding a protein of 493 amino acids. The deduced UGT73C19 protein was found to have a conserved PSPG domain at the C-terminal.enzymatic activity analysis revealed that the recombinant UGT73C19 protein exhibited glycosyltransferase activity toward six flavonoid aglycones (kaempferol, quercetin, myricetin, apigenin, daidzein and genistein), and it showed the highest catalytic efficiency toward quercetin. The glycosylation sites were at the 5 and 7 hydroxy groups of flavonoid substrates, and the glycosylation substrates and sites of the recombinant UGT73C19 protein showed high diversity. It was found that the total flavonoid contents in the seedlings and seeds of the transgenicincreased significantly, by 49% to 70% in leaves and 34% to 37% in seeds, in particular quercetin 3-rhamnose in the seeds. 【】 The recombinant UGT73C19 protein can catalyze the glycosylation of a group of flavonoid compounds and over-expression ofgene can increase the content of flavonols in plants like.

soybean; UDP-glucosyltransferase; flavonoids; flavonols

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.20.002

2019-04-25；

2019-06-12

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2016YFD0101005）

狄少康，E-mail：dishaokang@caas.cn。

龐永珍，E-mail：pangyongzhen@caas.cn

（責(zé)任編輯 李莉）