異亮氨酸生產(chǎn)菌的全局代謝網(wǎng)絡(luò)改造策略

【摘要】L-異亮氨酸是一種支鏈氨基酸，也是人體必需氨基酸，可作為食品營養(yǎng)補充劑、藥物和飼料添加劑。本文主要綜述了谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌合成L-異亮氨酸的調(diào)控機制和全局代謝網(wǎng)絡(luò)改造策略現(xiàn)狀，重點闡述基因工程技術(shù)在 L-異亮氨酸產(chǎn)生菌改造中的應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】L-異亮氨酸 基因工程 改造策略

【中圖分類號】R459.7???? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A?????? 【文章編號】1004-7484（2019）10-0035-02

【Abstract】 L-isoleucine is a branched-chain amino acid and an essential amino acid for humans. It can be used as a food nutrition supplement， medicine and feed additive. This article mainly reviews the control mechanism of L-isoleucine synthesis by Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli and the status of global metabolic network transformation strategies， and focuses on the application of genetic engineering technology in the transformation of L-isoleucine producing bacteria.

【Keywords】 L-isoleucine? genetic engineering? modification strategy

異亮氨酸是一種支鏈氨基酸，也是人體必需氨基酸，在食品領(lǐng)域主要用于食品添加劑，在醫(yī)藥領(lǐng)域主要用于氨基酸輸液成分之一，而且它的需求量在逐年增加[1]。傳統(tǒng)意義上的L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株大多數(shù)是由野生菌株經(jīng)過物理或化學(xué)的方法經(jīng)過多輪誘變篩選獲得。研究發(fā)現(xiàn)，基因突變往往充滿著很多不確定性，而且在高通量篩選菌種時工作量較大，此外反復(fù)使用同一種誘變因子可能會出現(xiàn)鈍化現(xiàn)象并且引起微生物的回復(fù)突變，使誘變育種變得不易控制[2]?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展為L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株的篩選提供了全新選擇，該技術(shù)主要基于目前研究人員對L-異亮氨酸合成途徑和調(diào)控機制的深入了解，定向改造有利于L-異亮氨酸合成的某些基因或其代謝途徑，使碳源最大化流向L-異亮氨酸同時解除L-異亮氨酸的自身反饋抑制，因此利用這種方法獲得的L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株產(chǎn)量高且遺傳性狀穩(wěn)定。

1L-異亮氨酸的合成途徑與調(diào)控機制

谷氨酸棒桿菌是L-異亮氨酸生產(chǎn)菌的常用菌株，其產(chǎn)L-異亮氨酸的生物合成途徑、調(diào)控機制及其運輸系統(tǒng)如圖1所示。L-天冬氨酸首先經(jīng)過L-天冬氨酸激酶（AK）、天冬氨酸半醛脫氫酶（ASD）、高絲氨酸脫氫酶（HDH）、高絲氨酸激酶（HSK）和蘇氨酸合酶（TS）催化的五步酶學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成L-蘇氨酸[3]。AK 由lysC基因編碼合成，其活性受到 L-蘇氨酸和L-賴氨酸協(xié)同反饋抑制，是L-異亮氨酸合成途徑上的第一個關(guān)鍵酶;HDH由hom基因編碼，是L-異亮氨酸合成途徑上的第二個關(guān)鍵酶，調(diào)控HDH催化的酶反應(yīng)是控制碳流流向支路的關(guān)鍵之處，其表達(dá)受到L-甲硫氨酸的輕微反饋阻遏;HSK是由thrB基因編碼，可將高絲氨酸磷酸化形成磷酸高絲氨酸，可控制流向蘇氨酸合成的碳流，其酶活性受到L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制，是L-異亮氨酸合成途徑上的第三個關(guān)鍵酶;蘇氨酸脫水酶（TD）對蘇氨酸的脫氨基，可控制L-蘇氨酸到L-異亮氨酸的碳流，是L-異亮氨酸合成途徑上的第四個關(guān)鍵酶;乙酰羥基氨酸合酶（AHAS）催化丙酮酸和2-酮基丁酸生成乙酰羥丁酸，由于該酶還可以催化合成L-纈氨酸和L-亮氨酸，所以其決定了不同產(chǎn)物的碳流，是L-異亮氨酸合成途徑的第五個關(guān)鍵酶[4-5]。

大腸桿菌是另一個常用的L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株，它的L-異亮氨酸生物合成途徑及調(diào)控機制如圖2所示，與谷氨酸棒桿菌略有區(qū)別[6]。L-天冬氨酸先經(jīng)五步反應(yīng)合成L-蘇氨酸，L-蘇氨酸再經(jīng)五步反應(yīng)后生成L-異亮氨酸，與谷氨酸棒桿菌不同的是AK有三個同工酶為AKⅠ、Ⅱ和Ⅲ，分別由thrA、metL和tysc編碼。AKⅠ、Ⅱ和Ⅲ具有不同的調(diào)控機制，在基因水平上，thrA和tysc的表達(dá)分別由L-蘇氨酸和 L-賴氨酸誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄衰減調(diào)控，而metL 的表達(dá)則由 L-甲硫氨酸誘導(dǎo)的阻遏蛋白MetJ調(diào)控在蛋白質(zhì)水平上，AKI和AKⅡ是雙功能蛋白，同時具有天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶的活力，分別受 L-蘇氨酸和L-賴氨酸的反饋抑制調(diào)控。大腸桿菌中有三個乙酰羥基酸合成酶（AHAS）的同工酶，分別為AHASⅠ、Ⅱ和Ⅲ并分別由由ilvBN、ilvGM和ilvlH編碼與AK類似，這三種同工酶具有不同的調(diào)控機制。ilvGM的表達(dá)由L-異亮氨酸誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄衰減調(diào)控。這三種AHAS同工酶競爭同一個底物丙酮酸，丙酮酸是支鏈氨基酸合成的重要前體，相比之下ilvBN編碼的AHASI對丙酮酸的親和力遠(yuǎn)高于對2-酮基丁酸的親和力。因此，AHASI主要參與 L-亮氨酸和L-纈氨酸的生物合成，而AHASⅡ和Ⅲ主要參與L-異亮氨酸的合成[7]。

2 L-異亮氨酸的代謝工程改造

2.1運輸載體改造對L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響研究發(fā)現(xiàn)，L-異亮氨酸的產(chǎn)率與跨膜轉(zhuǎn)運機制有密切的關(guān)系。Morbach S等對谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸的研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)L-異亮氨酸濃度始終大于胞外L-異亮氨酸濃度[8]，Kelle R等人發(fā)現(xiàn)高濃度的L-異亮氨酸對細(xì)胞有毒害作用[9]。BrnFE是谷氨酸棒桿菌中負(fù)責(zé)支鏈氨基酸L-異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸轉(zhuǎn)運運輸?shù)碾p組份轉(zhuǎn)運載體，由brnFE 基因編碼，當(dāng)谷氨酸棒桿菌胞內(nèi)的支鏈氨基酸量積累到一定程度時，便會激活 brnFE 操縱子表達(dá)使得L-異亮氨酸等氨基酸外排到胞外。通過過表達(dá) brnFE 基因，可以減少 L-異亮氨酸在谷氨酸棒桿菌胞內(nèi)的積累，削弱L-異亮氨酸在胞內(nèi)對合成途徑中關(guān)鍵酶的反饋抑制作用，從而增加其產(chǎn)量。李忠財?shù)热嗽诠劝彼岚魲U菌LD320 中分別過表達(dá)突變型和野生型的雙組份轉(zhuǎn)運系統(tǒng)BrnFE操縱子，構(gòu)建了重組菌LD320pXMJ19-brnFE1通過添加適量的表面活性劑，通過7L發(fā)酵罐放大實驗，發(fā)現(xiàn)該菌株L-異亮氨酸的產(chǎn)量由18.53 g/L提高到25.45 g/L[10]。大腸桿菌中，支鏈氨基酸（BCAAs）的輸出蛋白brnFE高效表達(dá)也可提高L-異亮氨酸產(chǎn)量。

2.2 輔酶改造對L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響L-異亮氨酸所需的關(guān)鍵輔酶是NADPH，它也是ASD、HD、乙酰羥酸合酶（AHAIR）的輔酶，此外NADPH還是細(xì)胞內(nèi)最重要的還原力在還原性生物合成中起到氫供體的作用。細(xì)胞內(nèi)NADPH的主要供應(yīng)渠道是HMP途徑和NAD激酶，其中HMP途徑利用氧化態(tài)輔酶Ⅱ（NADP+）作為電子受體生成還原態(tài)輔酶Ⅱ（NADPH），NAD激酶則催化輔酶Ⅰ發(fā)生磷酸化生成輔酶Ⅱ。研究表明，高效供應(yīng)NADPH有利于發(fā)揮菌株的合成潛力，可促進(jìn)L-異亮氨酸的進(jìn)一步積累。還曉靜等人通過在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)NAD激酶（ppnk編碼）成功構(gòu)建由ppnK組成表達(dá)菌JHI3-156/pDXW-9-ppnK，L-異亮氨酸的產(chǎn)量提高了41.7%[11];Shifeng等人利用輔酶工程在谷氨酸棒桿菌中增加NADPH的供應(yīng)，敲除內(nèi)源性NAD+激酶基因ppnK同時將葡萄糖-6磷酸脫氫酶基因zwf與L-異亮氨酸雙加氧酶（ido）共表達(dá)提高L-異亮氨酸的前體物質(zhì)4-羥基異亮氨酸（4-HIL）的產(chǎn)量，L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到84.14±6.38mM[12]。

2.3 代謝通路改造對L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響

2.3.1增強主合成途徑

2.3.1.1通過表達(dá)關(guān)鍵酶以解除自身反饋根據(jù)L-異亮氨酸的生物合成途徑及代謝調(diào)節(jié)機制，使菌體最大化生成L-異亮氨酸的方法主要是增加其前體物質(zhì)的合成、解除自身反饋抑制以及切斷代謝支路。通過基因工程手段能很好地改造L-異亮氨酸產(chǎn)生菌的代謝通路，例如過表達(dá)某些關(guān)鍵酶基因可以有效解除自身反饋抑制、敲除支鏈代謝的相關(guān)基因可以使碳流最大化流向目標(biāo)產(chǎn)物?；蚬こ淌侄尉珳?zhǔn)且有效地改變L-異亮氨酸產(chǎn)生菌的代謝通路，已成為很多研究者青睞的方法。尹良鴻等人在谷氨酸棒桿菌JHI3-156中共表達(dá)反饋抗性蘇氨酸脫水酶和乙酰羥基酸合酶，經(jīng)72小時分批補料發(fā)酵可生產(chǎn)L-異亮氨酸30.7 g/L[13];徐慶陽等人通過在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)hom基因成功構(gòu)建谷氨酸棒桿菌 YILW（pXMJ19-hom），由于解除了高絲氨酸脫水酶的反饋抑制，使得L-異亮氨酸的產(chǎn)量增加了10.3%，達(dá)到32g/L[14];此外他通過異源表達(dá)鈍化發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌JHI3-156的蘇氨酸脫水酶（TD1）和乙酰羥基胺酸合酶（AHAS1）均具有抗反饋抑制能力，在谷氨酸棒桿菌JHI3-156中過量表達(dá)TD1或AHAS1均能提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量，組合表達(dá)時搖瓶發(fā)酵提高131.7%的L-異亮氨酸，發(fā)酵罐發(fā)酵提高26.3%的L-異亮氨酸;李燕軍等人以L-蘇氨酸生產(chǎn)菌Escherichia coli THRD為出發(fā)菌株，利用基因重組技術(shù)替換 ilvLXGMEDA啟動子并過表達(dá)解除L-異亮氨酸反饋抑制的ilvA和ilvIH，獲得了L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株ILE04，該菌株在5L發(fā)酵罐中L-異亮氨酸的產(chǎn)量為5.23g/L[15];溫冰、徐國棟等人采用基因重組手段將L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸把那個桿菌YILW的 ilvBNC操縱子中的啟動子替換為強啟動子Ptac獲得谷氨酸棒桿菌YILWPtacpXMJ19cimA，其L-異亮氨酸酸產(chǎn)量和核糖轉(zhuǎn)化率分別較出發(fā)菌株提高14.8%和18.6%，在此基礎(chǔ)上過表達(dá)cimA基因，L-異亮氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率較出發(fā)菌株提高了14.5%和42.4%[16]。

2.3.1.2增加前體物質(zhì)的合成異亮氨酸的前體物質(zhì)主要有天冬氨酸，蘇氨酸等，增加相關(guān)的前體物質(zhì)能積累大量的目標(biāo)產(chǎn)物。Feng Shi等人在重組谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)基因ppc（編碼PEPC-磷酸烯醇丙酮酸羧化酶）和lysC（編碼AK）再將ppc和lysC與ido共表達(dá)以增加4-HIL的直接前體L-異亮氨酸的供應(yīng)[17];乙酰羥基酸合成酶（acetohydroxyacid synthase， AHAS）是L-異亮氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶（L-由 ilvBN 編碼），α-酮基丁酸是 L-異亮氨酸合成的重要前體，因此強化 ilvBN 的表達(dá)以及增加α-酮基丁酸的供應(yīng)理論上可提高L-異亮氨酸的合成。趙建勛在谷氨酸棒桿菌IWJ001中表達(dá)RRF和EF-G，后續(xù)共表達(dá)合成途徑關(guān)鍵酶基因ilvBNA和輔酶基因ppnk，L-異亮氨酸產(chǎn)量提高了76.5%[18]。

2.3.1.3增強回補途徑以增加L-異亮氨酸的產(chǎn)量增強回補途徑是增加L-異亮氨酸產(chǎn)量的重要方法，研究表明回補途徑的增強確實可以提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量。ZHU Fuzhou等人以谷氨酸棒桿菌Y1為出發(fā)菌株，采用基因組整合和質(zhì)粒過表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因ppc及丙酮酸羧化酶編碼基因pyc，獲得pyc基因組整合和質(zhì)粒過表達(dá)菌株ILE01，搖瓶條件下L-異亮氨酸產(chǎn)量提高了17.3%，發(fā)酵罐條件下提高11.7%;獲得ppc基因組整合和質(zhì)粒過表達(dá)菌株ILE03，搖瓶條件下L-異亮氨酸產(chǎn)量提高了30.8%，發(fā)酵罐條件下提高15.8%[19]。

2.3.2減少副產(chǎn)品的積累在L-異亮氨酸的合成途徑上，其他氨基酸等競爭代謝產(chǎn)物的存在極大減少了L-異亮氨酸的合成，支鏈代謝產(chǎn)物會分走很大部分碳流，理論上減弱這些旁路氨基酸的合成，可以大大加強L-異亮氨酸合成途徑的碳流從而積累更多的L-異亮氨酸。Yuanxiao DONG等人通過敲除ddh和lysE基因，從野生型谷氨酸棒桿菌ATCC13869中構(gòu)建不產(chǎn)生賴氨酸的基礎(chǔ)菌株，通過過表達(dá)相關(guān)基因L-異亮氨酸的產(chǎn)量有明顯提高[20]。

3 總結(jié)及展望

傳統(tǒng)上主要結(jié)合隨機突變、定向篩選高產(chǎn)L-異亮氨酸高產(chǎn)菌，但是由于突變的不確定性且篩選工作量大等原因，目前菌種改造多采用基因工程手段?；蚬こ淌侄我跃甏x背景清楚為前提，對一個點或多個點進(jìn)行基因水平上的改造，對代謝途徑中多個關(guān)鍵酶高效表達(dá)以解除一些反饋抑制，此外構(gòu)建新的代謝途徑逐漸走入人們視野。本文主要概述了L-異亮氨酸生產(chǎn)菌的全局代謝網(wǎng)絡(luò)改造策略以及基因工程在L-異亮氨酸生產(chǎn)菌全局代謝網(wǎng)絡(luò)改造中的應(yīng)用現(xiàn)狀，旨在為相關(guān)研究者提供一些參考。當(dāng)前，我國的相關(guān)研究也處在剛剛起步的階段，隨著系統(tǒng)生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的不斷發(fā)展，將相關(guān)學(xué)科的新技術(shù)相互結(jié)合用于選育更高產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株成為新的挑戰(zhàn)和發(fā)展方向，并且提出更精準(zhǔn)、更全面、更合理的改造策略，使得L-異亮氨酸成本降低且產(chǎn)量有明顯的提升以滿足日益增長的生產(chǎn)生活需要。

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作者簡介：李曉芳（1994.9-）女，內(nèi)蒙古自治區(qū)興安盟突泉縣，漢，研究生，寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，研究方向：微生物育種。