基于陽(yáng)離子表面活性劑/核酸適配體的超分子組裝體熒光檢測(cè)Hg(Ⅱ)的研究

高 菲， 賈 蘭， 陳 松

(太原理工大學(xué)材料學(xué)院，山西太原 030024)

汞是在生態(tài)系統(tǒng)中唯一能完善循環(huán)的重金屬。汞具有高遷移、不可降解及生物富集性等特性，因此微量的汞也會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的危害[1]。汞與其化合物可通過人體的皮膚、消化道或者呼吸道進(jìn)入人體，對(duì)口、粘膜和牙齒都有不良影響，嚴(yán)重破壞人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，長(zhǎng)時(shí)間暴露在高汞環(huán)境中甚至可以導(dǎo)致腦損傷及死亡[2]。汞以多種形式存在于環(huán)境中，水環(huán)境中的Hg(Ⅱ)是最常見的形式，而汞中毒一般也由Hg(Ⅱ)引起，Hg(Ⅱ)會(huì)與人體中的巰基絡(luò)合形成金屬蛋白，抑制酶的活性，損害人體的肝功能，從而導(dǎo)致腎衰竭。因此，檢測(cè)生物體及水環(huán)境中微量Hg(Ⅱ)成為近年來的重要研究領(lǐng)域[3 - 4]。核酸適配體是一段脫氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)序列，它是利用體外篩選技術(shù)(SELEX)[5]從核酸分子文庫(kù)中得到的寡核苷酸片段。核酸適配體可以與目標(biāo)物高選擇性、高特異性結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，Hg(Ⅱ)能夠與堿基胸腺嘧啶T特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的“T-Hg(Ⅱ)-T”發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，基于這種結(jié)構(gòu)的檢測(cè)體系已有報(bào)道[6 - 9]。表面活性劑中加入帶相反電荷的聚電解質(zhì)，在低于表面活性劑的臨界膠束濃度(CMC)條件下，可通過靜電作用和疏水作用形成類膠束組裝體[10]。

熒光光譜法具有簡(jiǎn)便快捷、高靈敏度和高選擇性、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)以及成本低等優(yōu)點(diǎn)[11]。本研究利用帶正電的陽(yáng)離子表面活性劑十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)與帶負(fù)電的Hg(Ⅱ)核酸適配體，通過靜電和疏水作用結(jié)合為組裝體。當(dāng)加入Hg(Ⅱ)后，Hg(Ⅱ)能夠與堿基胸腺嘧啶T特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的“T-Hg(Ⅱ)-T”發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，將會(huì)誘導(dǎo)其解組裝。利用尼羅紅在水環(huán)境與疏水腔中不同熒光強(qiáng)度的性質(zhì)構(gòu)造“熒光關(guān)”的Hg(Ⅱ) 的檢測(cè)體系。圖1為其檢測(cè)Hg(Ⅱ)的原理示意圖。

圖1 DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅組裝與加入Hg(Ⅱ)后解組裝示意圖Fig.1 Scheme of the DTAB/Hg(Ⅱ) Aptamer/NR assembly and Hg(Ⅱ) induced disassembly

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器及試劑

FLUOROMAX-4熒光光譜儀(美國(guó)，HORIBA);JFM-1011透射電鏡(TEM)(日本，JEOL)；JK99B全自動(dòng)張力儀(上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司)；SB-100D超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；H/T16MM臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)。

十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)(99%，阿拉丁試劑(上海)有限公司)；Hg(Ⅱ)核酸適配體(5′-TTCTTTCTTCCCTTGTTTGTT-3′)(HAP純化，生工生物工程(上海)股份有限公司)；高氯酸汞(99%+，Strem Chemicals,Inc.美國(guó))；尼羅紅(NR)(≥95%，阿拉丁試劑(上海)有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水由XYA2-50-H純水機(jī)制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DTAB臨界膠束濃度的確定配制濃度為1.0×10-4mol·L-1尼羅紅的丙酮溶液，同時(shí)配制濃度1.0×10-5～1.0 mol·L-1的系列DTAB溶液，各取2 mL于離心管中，分別加入20 μL的1.0×10-4mol·L-1尼羅紅的丙酮溶液(尼羅紅終濃度為1.0×10-6mol·L-1)。渦旋振蕩混勻后，將含有尼羅紅的DTAB溶液敞口超聲處理30 min，靜置1 h，測(cè)量熒光發(fā)射光譜。

1.2.2 Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度的確定配制濃度為1.0×10-3～10 μmol·L-1的系列Hg(Ⅱ)核酸適配體溶液，分別加入一定量的DTAB溶液(DTAB終濃度為5.0×10-4mol·L-1)，各取2 mL置于離心管中，分別加入20 μL的1.0×10-4mol·L-1尼羅紅的丙酮溶液，混勻，敞口超聲處理后，進(jìn)行熒光光譜測(cè)量。

1.2.3 超分子組裝體的表征熒光光譜在FLUOROMAX-4(HORIBA，美國(guó))熒光光譜儀上測(cè)試。測(cè)試條件：電壓750 V，固定激發(fā)波長(zhǎng)為545 nm，測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)范圍為565～800 nm，狹縫寬度為10/10 nm。

透射電鏡(TEM)測(cè)試在JEM-1011(JEOL，JAPAN)透射電子顯微鏡上進(jìn)行，電流加速電壓為80 kV。制樣時(shí)，對(duì)樣品進(jìn)行負(fù)染色，用微量注射器將溶液懸滴到銅網(wǎng)上靜置數(shù)分鐘，然后用磷鎢酸鈉染色液浸泡數(shù)分鐘，再用濾紙吸去多余的液體，待干后用于電鏡觀察。

表面張力是在JK99B(鉑金板法)全自動(dòng)張力儀(上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司)上進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 DTAB的臨界膠束濃度

本實(shí)驗(yàn)采用熒光譜法[12]測(cè)定DTAB的CMC值。圖2為發(fā)射波長(zhǎng)為638 nm時(shí)，DTAB/尼羅紅溶液體系中DTAB濃度對(duì)數(shù)的熒光光譜圖，可以看出當(dāng)DTAB的濃度低于某一值時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度基本無(wú)變化，隨著DTAB的濃度增加，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并產(chǎn)生一個(gè)拐點(diǎn)，在拐點(diǎn)處做兩條切線，切線位置對(duì)應(yīng)濃度即為DTAB的CMC值，用熒光法測(cè)得的CMC值為9.2 mmol·L-1。

2.2 Hg(Ⅱ)核酸適配體的最佳濃度

Hg(Ⅱ)核酸適配體是通過SELEX從核酸分子文庫(kù)中得到的寡核苷酸片段。圖3是發(fā)射波長(zhǎng)在638 nm處，在DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液體系中Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度的熒光強(qiáng)度?？梢钥闯霎?dāng)Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度很小時(shí)，體系熒光強(qiáng)度基本保持不變，這是因?yàn)镠g(Ⅱ)核酸適配體的濃度過小，不足以與DTAB形成組裝體；當(dāng)Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度超過0.1 μmol·L-1時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度開始增強(qiáng)，此時(shí)體系中帶正電的表面活性劑DTAB與帶負(fù)電的Hg(Ⅱ)核酸適配體通過靜電與疏水作用結(jié)合，形成超分子組裝體，熒光探針尼羅紅進(jìn)入組裝體的疏水腔中，從而產(chǎn)生熒光強(qiáng)度的變化；而當(dāng)Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度大于5 μmol·L-1時(shí)，體系熒光強(qiáng)度增長(zhǎng)趨于平緩，此時(shí)DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅超分子組裝體基本完全形成。為了保障后續(xù)實(shí)驗(yàn)中形成DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅超分子組裝體，實(shí)驗(yàn)選用的Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度為5.0 μmol·L-1。組裝體中DTAB濃度為5.0×10-4mol·L-1，尼羅紅的濃度為1.0×10-6mol·L-1。

圖2 DTAB/尼羅紅溶液中DTAB濃度對(duì)數(shù)的熒光強(qiáng)度Fig.2 Fluorescence intensity of the logarithm concentration of DTAB in DTAB/NR solutions

圖3 DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液體系中Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度的熒光強(qiáng)度Fig.3 Fluorescence intensity of Hg(Ⅱ) aptamer concentration in the DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions

2.3 超分子組裝體的表征

為了觀察DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液形成的組裝體，以及加入Hg(Ⅱ) 后組裝體解離，分別對(duì)其用透射電鏡(TEM)進(jìn)行表征。圖4(a)為DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液的TEM；圖4(b)為加入1.0×10-4mol·L-1Hg(Ⅱ)的DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液的TEM?？梢钥闯?，圖4(a)中存在較為規(guī)則且分布均勻的圓形膠束，在加入Hg(Ⅱ)后(圖4(b))基本不存在膠束。說明DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅組裝體已經(jīng)完全解體。

圖4 (a)DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液的透射電鏡(TEM)圖；(b)DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液中加入1.0×10-4 mol·L-1Hg(Ⅱ)的TEM圖Fig.4 (a)TEM image of DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions;(b)TEM image of DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions with 1.0×10-4 mol·L-1 Hg(Ⅱ)

圖5 (a)不同濃度Hg(Ⅱ)在DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液中的熒光光譜圖；(b)熒光猝滅效率與加入Hg(Ⅱ) 濃度的關(guān)系(插圖對(duì)應(yīng)的是線性檢測(cè)圖)Fig.5 (a)Fluorescence spectra of different concentration of Hg(Ⅱ) in the DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions;(b)Quenching efficiency of assemblies in the DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions(The inset corresponds to the linear plots of the detection)

2.4 Hg(Ⅱ)的檢出限

圖5(a)為在DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液體系中，加入不同濃度Hg(Ⅱ)的熒光光譜圖。隨著Hg(Ⅱ)濃度的增加，體系的熒光強(qiáng)度逐漸變小，其熒光猝滅率((I0-I)/I0)與Hg(Ⅱ)濃度呈良好線性關(guān)系(圖5(b))。這是因?yàn)镠g(Ⅱ)能夠與核酸適配體中堿基胸腺嘧啶T特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的“T-Hg(Ⅱ)-T”發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，會(huì)將Hg(Ⅱ)從組裝體中解離出來，從而使組裝體解組裝，熒光探針尼羅紅會(huì)被釋放出來，從而使體系的熒光強(qiáng)度降低。方法的線性檢測(cè)范圍為1.0×10-11～1.0×10-10mol·L-1，計(jì)算可以得到Hg(Ⅱ)檢出限為5.1×10-12mol·L-1。

2.5 Hg(Ⅱ)的選擇性分析

圖6 DTAB/Hg2+核酸適配體/尼羅紅溶液中不同離子的熒光猝滅效率圖Fig.6 Quenching efficiency of DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions with different ions

為了驗(yàn)證組裝體系對(duì)Hg(Ⅱ)的選擇性，選取了K+、Na+、Ag+、Ni2+、Ca2+、Fe3+、Mn2+、Ba2+、Fe2+、Pb2+、Mg2+、Cu2+、Cd2+作為對(duì)照離子。圖6中為加入不同離子時(shí)，對(duì)DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液在638 nm處熒光強(qiáng)度的猝滅效率，其中每種離子的濃度均為1.0×10-4mol·L-1。在DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅組裝體系中加入Hg(Ⅱ)時(shí)，熒光猝滅率可達(dá)60%。而加入其他離子時(shí)熒光強(qiáng)度僅下降或上升約2%～12%左右，與加入Hg(Ⅱ) 相比，其他離子對(duì)于檢測(cè)體系的影響可忽略不計(jì)。說明該DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅檢測(cè)體系對(duì)Hg(Ⅱ)具有良好的選擇性。

2.6 Hg(Ⅱ)在實(shí)際水樣中的檢測(cè)

為驗(yàn)證所構(gòu)建體系實(shí)際檢測(cè)能力，采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)[3,7,9]。用自來水作為實(shí)際水樣，配制DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅的檢測(cè)溶液。滴加Hg(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為5.0×10-11mol·L-1和1.0×10-10mol·L-1，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定各溶液的熒光強(qiáng)度，根據(jù)線性方程計(jì)算出Hg(Ⅱ)的含量，計(jì)算得回收率為92%～107%，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在5%以內(nèi)。

表1 實(shí)際水樣中Hg(Ⅱ)的檢測(cè)(n=3)

3 結(jié)論

利用帶正電的表面活性劑DTAB與帶負(fù)電的Hg(Ⅱ)核酸適配體通過靜電與疏水作用組裝，包埋熒光探針尼羅紅，構(gòu)建DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅的“熒光關(guān)”檢測(cè)Hg(Ⅱ)的檢測(cè)體系。向該檢測(cè)體系添加Hg(Ⅱ)的濃度為1.0×10-4mol·L-1時(shí)，熒光猝滅率達(dá)60%。檢出限為5.1×10-12mol·L-1，線性檢測(cè)范圍為1.0×10-11～1.0×10-10mol·L-1。檢測(cè)體系對(duì)Hg(Ⅱ)具有良好的選擇性，且該方法可用于自來水中Hg(Ⅱ)的檢測(cè)，回收率為92%～107%。