高熒光強度金銀合金簇的合成及其對Hg2+的檢測

張詩琪， 許惠鳳， 周鑫悅， 王麗麗， 陳婷婷， 胡 筱， 余麗雙*

(1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建福州 350122;2.福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福建福州 350122;3.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建福州 350122)

汞是污染最為普遍、毒性最強的重金屬，對人體健康造成了極大危害[1]。傳統(tǒng)的Hg2+檢測方法如電感耦合等離子體發(fā)射光譜法、原子熒光法、火焰原子吸收光譜法等[2 - 4]已在實際檢測中得到很好的應用。此外，采用諸如熒光分析[5]、電化學傳感[6]等技術進行Hg2+的快檢方法也得到廣泛報道，這些方法在一定程度上實現(xiàn)了對Hg2+的快速靈敏檢測。即便如此，繼續(xù)尋找高效快速的分析方法仍然是研究者在Hg2+檢測中一直努力的方向。

近年來，金屬納米簇的研究受到人們的廣泛關注。所謂納米簇，通常指由幾個到幾十個原子構成的相對穩(wěn)定的納米結構。這種納米簇的尺寸通常小于2 nm，接近于電子的費米波長，這賦予其非常獨特的理化特性，如離散的能級和強熒光活性等[7 - 9]。金屬納米簇這些特性使其能夠作為理想化的納米材料用于生物醫(yī)藥及環(huán)境科學等領域的研究[9 - 10]。其中，貴金屬簇(Au、Ag、Pd和Pt)具有高的比表面積、豐富的表面原子以及顯著的熒光響應等特點，常常作為一類新型的熒光探針[8 - 9,11]。相比單一金屬簇，雙金屬合金簇能夠通過控制原子在金屬簇中的分布以獲得額外的自由度。同時，合成的合金簇具有更優(yōu)異的光電活性，Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)在Pb簇表面引入Au原子能顯著提高其葡萄糖氧化的活性。另有報道表明，在Au納米簇(AuNCs)中引入Ag能更有效地增強其熒光[12]，并且這些具有強熒光響應的合金簇也能夠用于金屬離子的檢測。Jin課題組合成了硫醇類包覆的AuNCs，實驗發(fā)現(xiàn)Ag+能明顯引起該金簇熒光強度的增強，從而可以實現(xiàn)對Ag+檢測[13]。而采用不同模板合成的Au/AgNCs也能夠對Cr3+、Cr6+、As3+等重金屬離子進行定量檢測[14 - 15]。

截止目前，已有多種生物分子比如蛋白質、多肽和寡核苷酸[16 - 19]等被用作合成金屬納米簇的模板，以增強其光穩(wěn)定性并減小納米簇的聚沉。本研究以牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)為模板合成了具有強熒光響應的金銀納米簇(BSA-Au/AgNCs)，并以此為熒光探針來構建檢測Hg2+的方法。該方法對Hg2+的響應范圍為2～30 nmol/L，檢測限達到0.6 nmol/L。同時，該方法對Hg2+有良好的特異性，可以對實際水樣中汞的含量進行測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FS5型熒光光譜儀(英國，Edinburgh公司)；AVATAR360型傅立葉變換紅外光譜儀(美國，Nicolet公司)；TECNAI G2F20型高分辨率透射電子顯微鏡(美國，F(xiàn)EI公司)；QL-866型振蕩器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；KQ520DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

牛血清白蛋白(BSA)、HAuCl4·3H2O購自美國Sigma-Aldrich公司；NaOH、Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·12H2O、AgNO3、Hg(NO3)2等購自國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純。水為去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 BSA-Au/AgNCs的合成所有用于合成BSA-Au/AgNCs的玻璃器皿事先都先用王水浸泡4 h，然后用乙醇漂洗，最后用水沖洗干凈。合成方法參考文獻方法[18]。將5.0 mL 50 mg/mL BSA溶液和4.0 mL 1.0×10-2mol/L HAuCl4溶液混合，接著加入1.0 mL不同濃度的AgNO3溶液，室溫振蕩10 min，立即加入1.0 mL 1.0×10-3mol/L NaOH溶液，在37 ℃下反應12 h。將反應液先使用30 000 MW的濾膜處理，4 ℃下3 000 r/min離心15 min，去除未反應的BSA。再使用水對其透析48 h(每6 h換一次水)，以除去未反應的HAuCl4和NaOH。最后將得到的BSA-Au/AgNCs溶液4 ℃放置以備用。取1 mL溶液凍干后稱重，計算得到最終BSA-Au/AgNCs母液的濃度為3.4 mg/mL。

1.2.2 Hg2+的熒光檢測取100 μL上述BSA-Au/AgNCs溶液，加900 μL濃度為2.0×10-2mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.0)，得到濃度為0.34 mg/mL的BSA-Au/AgNCs溶液。分別移取1 μL不同濃度的Hg2+溶液加入到1 mL上述BSA-Au/AgNCs溶液中，進行熒光測定。

2 結果與討論

2.1 BSA-Au/AgNCs的合成及表征

圖1A為BSA-Au/AgNCs在激發(fā)波長280 nm處的熒光光譜圖，由圖可見最大發(fā)射波長為625 nm。這些熒光特征與文獻報道的基本一致[19]，表明實驗已經成功合成了BSA-Au/AgNCs。日光下制備的BSA-Au/AgNCs呈棕黃色(如圖1A插圖a)，而在365 nm的紫外燈下顯示出很強的橘紅色熒光，如圖1插圖b所示。

圖1 BSA-Au/AgNCs的熒光光譜(A)和紅外光譜(B)圖Fig.1 Fluorescence spectra(A) and IR spectra(B) of BSA-Au/AgNCsInset a in Fig.A:Image of BSA-Au/AgNCs under the daylight lamp; Inset b:Image of BSA-Au/AgNCs under 365 nm UV light;Inset c:HRTEM image of BSA-Au/AgNCs.

利用高分辨透射電鏡(HRTEM)研究了合成的BSA-Au/AgNCs的尺寸。如圖1插圖c所示，可以觀察到合成的BSA-Au/AgNCs尺寸約4 nm，表明BSA-Au/AgNCs具有高度結晶的結構。利用紅外光譜表征了BSA-Au/AgNCs的結構信息，結果如圖1B所示。其中曲線a為BSA-Au/AgNCs的紅外譜，曲線b為BSA的紅外光譜。與BSA的紅外光譜相比，BSA-Au/AgNCs的紅外光譜在1 654 cm-1的特征吸收峰有較為明顯的減弱，這表明反應后蛋白質的α螺旋結構減少了，蛋白質的二級結構發(fā)生了改變，同時在蛋白質中巰基與Au、Ag形成共價鍵。

2.2 BSA-Au/AgNCs對Hg2+的熒光響應

考察了Hg2+存在時BSA-Au/AgNCs為熒光探針熒光信號變化情況，結果如圖2所示。從圖中可以看出，本實驗合成的BSA-Au/AgNCs在625 nm處顯示出很強的熒光(曲線a)，而隨著Hg2+的加入，BSA-Au/AgNCs的熒光信號強度顯著降低(曲線b)。圖2的插圖是在365 nm紫外燈下，在不同條件下的BSA-Au/AgNCs的熒光圖。在紫外燈下，單純的BSA-Au/AgNCs呈現(xiàn)出明亮的橙紅色(插圖a)，而加入Hg2+后，明亮的橙紅色幾乎完全褪去，而顯示出微弱的藍光(插圖b)。這一結果表明，Hg2+可有效地猝滅BSA-Au/AgNCs的熒光。其原因可能是Hg2+與BSA-Au/AgNCs表面的Au+之間存在著高特異性的Hg2+-Au+噬金屬效應(Metallophilic Interactions)，導致BSA-Au/AgNCs的熒光猝滅。所謂的噬金屬效應[19]是指一些閉殼層金屬(Closed-shell Metal)原子或離子間存在著的高親和性作用力，如Cu+(3d10)與Ag+(4d10)或Hg2+(5d10)與Au+(5d10)。這些閉殼層金屬間強的相互作用力能夠實現(xiàn)某些金屬離子的特異性檢測。

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1 Au和Ag配比的選擇固定BSA的用量，調整HAuCl4和AgNO3的比例，分別合成不同Au、Ag比例的合金簇，并考察不同比例的Au、Ag合金簇的熒光光譜。如圖3所示，當Au∶Ag=3∶1時，得到的合金簇的熒光強度最強(曲線b)。因此，實驗選擇Au、Ag比例為3∶1合成BSA-Au/AgNCs。

圖2 加入Hg2+前(a)、后(b)BSA-Au/AgNCs的熒光光譜和紫外燈下圖片F(xiàn)ig.2 Fluorescence spectra and image under UV light of BSA-Au/AgNCs without (a) and with (b) Hg2+a.in the absence of Hg2+;b.in the presence of 3.0×10-8 mol/L Hg2+.

圖3 不同Au、Ag比例BSA-Au/AgNCs的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of BSA-Au/AgNCs with different molar ratiosa.Au∶Ag=4∶1;b.Au∶Ag=3∶1;c.Au∶Ag=2∶1;d.Au∶Ag=1∶1;e.Au∶Ag=0.5∶1.

圖4 Hg2+和BSA-Au/AgNCs(Au∶Ag=3∶1)反應的動力學曲線Fig.4 The dynamics curve between BSA-Au/AgNCs(Au∶Ag=3∶1) and Hg2+The final concentration of Hg2+ and BSA-Au/AgNCs are 2.0×10-8 mol/L and 0.34 mg/mL in 0.02 mmol/L PBS buffer(pH=7.0),respectively.

2.3.2 反應時間的選擇反應時間對檢測結果有很大影響。實驗考察了Hg2+對BSA-Au/AgNCs熒光響應的情況。從圖4中可以看出，隨著反應時間的延長，熒光強度逐漸降低，當反應10 min后，熒光降低趨于緩慢，因此在后續(xù)實驗中，所有反應時間均設為10 min.

2.4 線性方程及檢測限

按照上述優(yōu)化條件，實驗研究了不同濃度Hg2+對BSA-Au/AgNCs熒光強度的影響。從圖5A中可以看出，隨著Hg2+濃度的增加，熒光強度逐漸降低。同時發(fā)現(xiàn)Hg2+的濃度在一定范圍內時(2～30 nmol/L)，熒光強度與Hg2+濃度有著良好的線性關系，如圖5B所示，回歸方程為：y=-1224.2x(nmol/L)+47319.6，相關系數R2為0.9928，方法的檢測限(S/N=3)為0.6 nmol/L。3次平行實驗得到結果的相對標準偏差(RSD)為3.6%，方法具有穩(wěn)定性。

圖5 (A)不同濃度Hg2+條件下BSA-Au/AgNCs的熒光光譜；(B)熒光強度與Hg2+濃度的線性關系曲線Fig.5 (A) Fluorescence spectra of BSA-Au/AgNCs in the presence of different concentrations of Hg2+;(B) The relationship curve of the fluorescence intensity with Hg2+ concentrationscHg2+ (a-f):0,2,5,12,20,30 nmol/L.

圖6 不同金屬離子的響應信號變化圖Fig.6 Signal changes responding to different metal ionsNote:The concentration of Hg2+ was 1.2×10-8 mol/L and those of other ions were 1.2×10-7 mol/L.

2.5 干擾實驗

選用一些常見的無機離子Cu2+、Mn2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+和Cd2+等作為干擾離子。實驗結果用熒光的改變量ΔF來表示，定義ΔF=F0-F,其中F0為初始熒光值，F(xiàn)為加入相應離子后的熒光值。從圖6中可以看出，同樣條件下，Hg2+對BSA-Au/AgNCs的熒光具有顯著猝滅作用，而其他金屬對其則沒有明顯作用。由此可見，基于BSA-Au/AgNCs的熒光檢測方法對Hg2+具有良好的選擇性識別能力。

2.6 實際水樣中Hg2+的檢測

實驗中所用的水樣均采自閩江，在檢測前靜置過夜，并通過濾膜(0.22 mm)過濾掉不溶物。利用所建立方法在此水樣中進行Hg2+的檢測，結果并沒有檢測到信號變化，其原因可能是河水中Hg2+的含量低于該方法的檢測限。在水樣中加入已知濃度的Hg2+標準溶液進行加標回收實驗，檢測結果如表1所示，其回收率在90.1%～107.2%范圍內。

表1 河水樣品中Hg2+的檢測

3 結論

本文以BSA為模板，以HAuCl4和AgNO3為原料，合成了一種高熒光強度的Au、Ag合金簇BSA-Au/AgNCs。實驗發(fā)現(xiàn)，由于Hg2+與BSA-Au/AgNCs表面的Au+存在的高特異性的噬金屬效應，因而能顯著猝滅合金簇的熒光信號。本研究進一步以該BSA-Au/AgNCs為熒光探針，開發(fā)了一種快速檢測Hg2+的方法。該檢測方法操作簡單，快速，靈敏度較高，不需復雜儀器；同時，合成的合金簇綠色環(huán)保。