線粒體定位雙光子熒光探針用于小鼠大腦炎癥過程中H2O2的檢測(cè)

翟保評(píng)， 郝瑞林， 何 軍， 胡 偉， 劉志洪*

(1.忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州 034000；2.武漢大學(xué)生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,湖北武漢 430072)

神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元和(或)其髓鞘的喪失所致1 - 3]，并隨著時(shí)間的推移而惡化，出現(xiàn)功能性障礙[4 - 5]。隨著對(duì)神經(jīng)退行性疾病研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的因素與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[6]。然而，神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的炎癥假說直到最近才提出[7 - 8]。眾所周知，線粒體在神經(jīng)免疫過程中產(chǎn)生的活性氧(ROS)，可以與人體免疫系統(tǒng)協(xié)同作用共同抵抗病原微生物入侵，而過量的ROS是線粒體損傷并造成神經(jīng)退行性疾病的主要原因[9 - 13]，為此，我們希望通過原位監(jiān)控神經(jīng)細(xì)胞線粒體中H2O2濃度的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)退行性疾病的早期診斷。

熒光分析法已經(jīng)成為生化分析領(lǐng)域的一種重要手段[14 - 16]。而雙光子熒光(TPF)是分子同時(shí)吸收兩個(gè)能量較低、波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光子使其基態(tài)電子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，相比于紫外線和可見光激發(fā)，雙光子激發(fā)能達(dá)到更深的穿透深度，對(duì)生物樣本造成更少光損傷和光漂白，避免了來自細(xì)胞和組織自體熒光的干擾[17 - 21]。近年來大量雙光子H2O2熒光探針被相繼報(bào)道[22 - 23]，然而對(duì)線粒體中H2O2和神經(jīng)免疫之間相互作用的研究還未見報(bào)道。為此，本文設(shè)計(jì)了一種基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)機(jī)理的H2O2熒光探針Mito -H2O2，如圖1所示，利用萘酰亞胺衍生物作為雙光子熒光團(tuán)(黑色部分)，引入三苯基磷結(jié)構(gòu)(紅色部分)，增加水溶性的同時(shí)，使探針可以更好定位于線粒體內(nèi)膜上。黃色硼酸酯部分為H2O2反應(yīng)位點(diǎn)，硼酸酯能夠與H2O2特異性反應(yīng)產(chǎn)生羥基，得到Mito -green(neutral form)，在生理環(huán)境下分子去質(zhì)子化形成Mito -green(anion form)產(chǎn)生綠色熒光。水溶液實(shí)驗(yàn)顯示，在與H2O2反應(yīng)后，Mito -H2O2最大發(fā)射峰(540 nm)的相對(duì)發(fā)射強(qiáng)度在60 min內(nèi)增加了12倍(540 nm)，檢出限低至412 nmol/L。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示該探針具有很好的生物相容性，并且能夠準(zhǔn)確定位于細(xì)胞線粒體中，脂多糖(LPS)誘導(dǎo)探針處理過的bv-2細(xì)胞及小鼠大腦也發(fā)現(xiàn)很明顯的熒光增強(qiáng)，并且對(duì)LPS具有濃度依賴關(guān)系。本研究成功構(gòu)建了能夠定位于線粒體中的雙光子H2O2探針，并以其為平臺(tái)探究了LPS誘導(dǎo)小鼠大腦神經(jīng)免疫反應(yīng)。

圖1 探針Mito -H2O2的結(jié)構(gòu)及其對(duì)H2O2的響應(yīng)機(jī)理Fig.1 Chemical structure of Mito -H2O2 probe and the fluorescent response towards H2O2

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，島津公司)；RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)(日本，島津公司)；雙光子共聚焦熒光成像(CLSM,C1-Si,Nikon,日本)。

噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自阿拉丁試劑公司，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基及無(wú)菌的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.0)購(gòu)自Gibco。硅膠(青島海洋化工廠，200～300目和GF-254)。未經(jīng)特殊說明，所有溶劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)；所有試劑均為分析純，購(gòu)自安耐吉化學(xué)試劑公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 探針Mito -H2O2的合成

探針Mito -H2O2的合成路線如圖2所示:

圖2 探針Mito -H2O2的合成路線Fig.2 Synthesis route of probe Mito -H2O2Reagents and conditions:(a) glacial acetic acid,reflux,4 h;(b) 1,4-dibromobutane,K2CO3,DMF,80 ℃,12 h;(c) Bis(pinacolato)diboron,Pd(dppf)Cl2,CH3COOK,dry dioxane,reflux,10 h,Ar atmosphere;(d) PPh3,CH3CN,KI,reflux,24 h.

1.2.1 化合物1的合成稱取3.24 g 4-溴-1,8-萘二酸酐(18 mmol)和2.4 g 4-氨基苯酚(21.6 mmol)于100 mL燒瓶中，用適量冰HAc溶解原料，劇烈攪拌，回流反應(yīng)4 h，薄層色譜(TLC)檢測(cè)。待反應(yīng)結(jié)束后，冷卻，飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH到中性，抽濾，濾餅用乙醇洗滌3次，得到5.6 g灰白固體(產(chǎn)率84.9%)，即化合物1。

1H NMR(400 MHz,DMSO):δ:9.70(s,1H),8.55(d,J=7.9 Hz,1H),8.26(dd,J=36.0,7.9 Hz,1H),8.00(t,J=7.9 Hz,1H),7.15(d,J=8.7 Hz,1H),6.88(d,J=8.7 Hz,1H)。

1.2.2 化合物2的合成將2.0 g化合物1(5.4 mmol)溶于10 mL無(wú)水DMF中，加入2.3 g K2CO3(16.3 mmol)以及2.3 g 1,4-二溴丁烷(10.8 mmol)，于80 ℃反應(yīng)12 h，TLC檢測(cè)。待反應(yīng)結(jié)束后，冷卻，將反應(yīng)液倒入水中，二氯甲烷萃取，飽和NaCl溶液洗滌3次，無(wú)水Na2SO4干燥，減壓旋蒸后，柱層析分離，得白色固體2.2 g(產(chǎn)率81.5%)，即化合物2。

1H NMR(400 MHz,DMSO):δ:8.63～8.55(m,1H),8.29(dd,J=34.9,7.9 Hz,1H),8.03(dd,J=8.4,7.4 Hz,1H),7.34～7.24(m,1H),7.12～7.02(m,1H),4.08(t,J=6.2 Hz,1H),3.65(t,J=6.6 Hz,1H),2.06～1.97(m,1H),1.92(t,J=4.6 Hz,1H)。

1.2.3 化合物3的合成稱取609.6 mg聯(lián)硼酸頻那醇酯(2.4 mmol)，1 g化合物2(2.0 mmol)，10 mg二氯二三苯基膦鈀，294 mg KAc(3 mmol)于茄形反應(yīng)瓶中，加入磁子，用NaCl溶液塞密封瓶口。經(jīng)過三抽三放使瓶中達(dá)到無(wú)水無(wú)氧狀態(tài)。量取20 mL 1,4-二氧六環(huán)加入瓶中，在80 ℃反應(yīng)24 h。TLC檢測(cè)。待反應(yīng)結(jié)束后，冷卻，二氯甲烷萃取，飽和NaCl溶液洗滌3次，無(wú)水Na2SO4干燥，減壓旋蒸后，柱層析分離，得白色固體532.1 mg(產(chǎn)率48.5%)，即化合物3。

1H NMR(400 MHz,DMSO):δ:9.06(d,J=8.5 Hz,1H),8.49(dd,J=6.8,4.8 Hz,1H),8.26(d,J=7.3 Hz,1H),8.01-7.90(m,1H),7.29(d,J=8.8 Hz,1H),7.06(d,J=8.8 Hz,1H),4.09(t,J=6.2 Hz,1H),3.65(t,J=6.6 Hz,1H),2.06-1.97(m,1H),1.94-1.84(m,1H),1.43(s,6H)。

1.2.4 Mito -H2O2的合成稱取200 mg化合物3(0.36 mmol)和112 mg三苯基膦(0.43 mmol)于50 mL燒瓶中，加入催化當(dāng)量的KI，20 mL乙腈作溶劑，80 ℃下回流反應(yīng)6 h。TLC檢測(cè)。待反應(yīng)結(jié)束后，冷卻，減壓旋干溶劑，二氯甲烷萃取，飽和NaCl溶液水洗滌3次，無(wú)水Na2SO4干燥，減壓旋蒸后，柱層析分離，得白色固體123.2 mg(產(chǎn)率42.1%)，即Mito -H2O2。

1H NMR(400 MHz,DMSO):δ:8.49(dd,J=4.9,2.3 Hz,1H),7.95-7.90(m,3H),7.82-7.78(m,6H),7.30(d,J=8.8 Hz,1H),7.02(d,J=8.8 Hz,1H),4.14(t,J=5.8 Hz,1H),3.73(t,J=6.4 Hz,1H),2.00-1.96(m,1H),1.80-1.75(m,1H),1.43(s,6H)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

bv-2細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)箱(5%CO2，95%空氣)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有1%的青霉素、鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。成像前將細(xì)胞傳代至35 mm玻底培養(yǎng)皿中，待其增殖到理想的密度。在與藥物或刺激物孵育前，細(xì)胞先使用37 ℃預(yù)熱過的PBS洗一次，移去液體后再與含有藥物或刺激物的新鮮培養(yǎng)基孵育。除特殊說明外，細(xì)胞的探針標(biāo)記操作均為使用含5 μmol/L探針Mito -H2O2的培養(yǎng)基(DMSO體積比為0.2%)孵育60 min，成像前使用PBS洗兩次，成像。雙光子激發(fā)波長(zhǎng)810 nm，熒光收集范圍：500～600 nm。

1.4 探針的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法測(cè)定探針細(xì)胞毒性。將bv-2細(xì)胞接種于96孔板中，分別孵育0、5、10、20、30 μmol/L的探針24 h。將Mito -H2O2標(biāo)記bv-2細(xì)胞后孵育24 h，之后在每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)以相同的條件培養(yǎng)4 h，隨后去除100 μL上清液，并且加入150 μL DMSO溶液振搖10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度。細(xì)胞存活率通過公式：E%=A/A0×100計(jì)算(A和A0分別代表Mito -H2O2標(biāo)記組和對(duì)照組的吸光度)。

1.5 組織成像

體重大約35 g小鼠被麻醉后，在后腿部通過皮下注射200 μL的LPS。14 h后，200 μL 200 μmol/L的探針Mito -H2O2注射到LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥的部位。孵育1 h，小鼠被麻醉后獲取大腦組織，并迅速冰凍切片，切片經(jīng)過PBS漂洗后立即用雙光子顯微鏡成像。在z-掃描成像中，取小鼠的大腦組織，冷凍，用切片機(jī)切成厚度為300 μm的切片，用雙光子顯微鏡成像觀察。

圖3 探針Mito -H2O2與H2O2反應(yīng)前(a)和后(b)的紫外-可見(UV-Vis)光譜Fig.3 UV-Vis spectra of Mito -H2O2 before(a) and after(b) reacting with H2O2

2 結(jié)果與討論

2.1 Mito -H2O2及其與H2O2反應(yīng)體系的紫外-可見光譜

圖3為探針Mito -H2O2(10 μmol/L)與500 μmol/L的H2O2反應(yīng)前后的紫外-可見吸收光譜曲線。由圖可知，當(dāng)Mito -H2O2與H2O2反應(yīng)后，紫外吸收峰和摩爾吸光系數(shù)沒有明顯變化。

2.2 Mito -H2O2及其與H2O2反應(yīng)體系的熒光光譜及理論計(jì)算

圖4為單光子激發(fā)(A)和雙光子激發(fā)(B)模式下，10 μmol/L Mito -H2O2與500 μmol/L H2O2反應(yīng)前后的熒光發(fā)射光譜曲線。探針Mito -H2O2在單光子(激發(fā)光波長(zhǎng)為430 nm)和雙光子模式(激發(fā)光波長(zhǎng)810 nm)下，均未觀察到明顯的熒光發(fā)射，而當(dāng)探針Mito -H2O2與H2O2反應(yīng)之后，其產(chǎn)物在530 nm處有熒光發(fā)射峰。Mito -H2O2由于ICT機(jī)理，識(shí)別域上的硼酸酯將熒光猝滅，探針分子熒光變得非常弱，背景很低。而H2O2可以將探針中硼酸酯結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為羥基，得到熒光團(tuán)Mito -green，如圖1。

圖4 單光子(A)和雙光子(B)模式下探針Mito -H2O2(10 μmol/L)與500 μmol/L H2O2反應(yīng)前(a)和后(b)的熒光發(fā)射光譜Fig.4 Fluorescence emission spectra of one -photon(A) and two -photon(B) for Mito -H2O2(10 μmol/L) before(a) and after(b) reacting with 500 μmol/L H2O2

理論計(jì)算表明，探針分子HOMO軌道與LUMO軌道電子云分布不同，說明該過程電子禁阻躍遷，分子不發(fā)生熒光；當(dāng)硼酸酯脫去之后，HOMO軌道與LUMO軌道電子云分布相同，能夠發(fā)生熒光，兩分子間的能級(jí)差達(dá)到3.76 eV。由于反應(yīng)體系呈弱堿性，熒光團(tuán)會(huì)發(fā)生去質(zhì)子化使電子供體部分供電子效應(yīng)會(huì)更加明顯，去質(zhì)子化之后的熒光團(tuán)能級(jí)差降低為3.3 eV，電子轉(zhuǎn)移所釋放的能量降低，發(fā)射光的波長(zhǎng)增加，即發(fā)生紅移現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)觀測(cè)中也證明了這一點(diǎn)。生理環(huán)境下分子發(fā)出的熒光為綠色，如圖5所示。

圖5 Mito -H2O2、Mito -green(neutral form)和Mito -green(anion form)的幾何構(gòu)象及電子軌道分布Fig.5 The geometries and distribution of frontier orbitals in Mito -H2O2,Mito -green(neutral form) and Mito -green(anion form) at B3LYP/def2-SVP level

2.3 熒光量子產(chǎn)率及雙光子活性吸收截面

為評(píng)估探針Mito -H2O2檢測(cè)H2O2的靈敏度，以及能否用于雙光子共聚焦成像，考察了Mito -H2O2及其與H2O2反應(yīng)產(chǎn)物的量子產(chǎn)率及雙光子活性截面。以0.1 mol/L H2SO4中的硫酸奎寧溶液為參比(η=0.55)，可得探針Mito -H2O2及其與H2O2反應(yīng)后的熒光團(tuán)的量子產(chǎn)率分別為0.03和0.44；再以雙光子誘導(dǎo)熒光法測(cè)出Mito -H2O2及其與H2O2反應(yīng)后的熒光團(tuán)在780～880 nm范圍內(nèi)的雙光子吸收截面，以1 μmol/L羅丹明B的甲醇溶液作為參比，雙光子活性吸收截面即為兩者的乘積。如圖6所示，Mito -H2O2及其與H2O2反應(yīng)后的熒光團(tuán)均在810 nm激發(fā)光下具有最大雙光子活性截面，Mito -H2O2與H2O2反應(yīng)后熒光團(tuán)的雙光子最大活性吸收截面為20 GM(1 GM=1.0×10-50cm4·s/photon)，而Mito -H2O2探針在此處的雙光子活性吸收截面小于4 GM。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)Mito -H2O2與H2O2反應(yīng)體系的影響

以10 μmol/L Mito -H2O2與0 μmol/L H2O2(對(duì)照樣)和500 μmol/L H2O2反應(yīng)，考察不同反應(yīng)時(shí)間體系的熒光強(qiáng)度變化，從而獲取反應(yīng)動(dòng)力學(xué)信息。其結(jié)果表明，37 ℃下，當(dāng)H2O2濃度為500 μmol/L時(shí)，反應(yīng)完全所需時(shí)間為60 min。更重要的是，在不含H2O2，而其它條件相同的反應(yīng)體系中，隨反應(yīng)進(jìn)行未觀察到熒光光譜變化，表明Mito -H2O2在該反應(yīng)體系中具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 H2O2的測(cè)定

圖7為Mito -H2O2與不同濃度H2O2反應(yīng)后的熒光發(fā)射光譜，在Mito -H2O2的初始濃度為10 μmol/L條件下，隨著H2O2濃度的不斷增加，540 nm附近的發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸上升，表明Mito -H2O2對(duì)H2O2具有較好的熒光響應(yīng)。考察了熒光強(qiáng)度與H2O2濃度間的關(guān)系(圖略)，由540 nm處熒光強(qiáng)度的點(diǎn)狀圖可知，當(dāng)H2O2濃度在0～50 μmol/L范圍時(shí)，熒光強(qiáng)度與H2O2濃度之間有很好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2為0.97，k=11.74，計(jì)算出該方法的檢出限(3σ/k)為0.41 μmol/L。

圖6 探針Mito -H2O2與H2O2反應(yīng)前(a)和后(b)的雙光子活性吸收截面Fig.6 Two -photon active cross section of Mito -H2O2 before(a) and after(b) reacting with H2O2

圖7 探針Mito -H2O2與不同濃度H2O2反應(yīng)后的熒光發(fā)射光譜Fig.7 Fluorescence emission spectra of Mito -H2O2(10 μmol/L) after reacting with H2O2 at different concentrations [H2O2]:0，1，5，10，20，50，80，100，300，500 μmol/L.

圖8 pH對(duì)Mito -H2O2與500 μmol/L H2O2反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度(λex/λem=430/540 nm)的影響Fig.8 Effects of pH on the fluorescence intensity(λex/em=430/540 nm) of Mito -H2O2(10 μmol/L) before and after reacting with 500 μmol/L H2O2

2.6 pH值對(duì)探針Mito -H2O2熒光響應(yīng)的影響

考察了Mito -H2O2(10 μmol/L)與H2O2(500 μmol/L)反應(yīng)前、后的熒光強(qiáng)度隨溶液pH值的變化情況。如圖8所示，在pH=5.0～8.2范圍內(nèi)，Mito -H2O2幾乎無(wú)熒光響應(yīng)，且其熒光特性不受pH值影響，隨溶液pH值逐漸增大，探針Mito -H2O2和H2O2反應(yīng)體系在540 nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸增加。這是由于pH對(duì)該反應(yīng)影響較大，但在近生理pH值7.4附近，可獲得較強(qiáng)熒光響應(yīng)信號(hào)。

2.7 探針Mito -H2O2的選擇性

2.8 探針的細(xì)胞毒性

為了考察了探針Mito-H2O2是否適合用于細(xì)胞成像，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了其細(xì)胞毒性。如圖10所示，使用MTT法測(cè)試探針對(duì)bv-2細(xì)胞的毒性，20 μmol/L探針經(jīng)過24 h孵育后，細(xì)胞仍保80%以上的存活率。由此看出，探針在濃度小于20 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞毒性很小，適用于生物樣品的成像。

圖9 探針Mito -H2O2對(duì)不同物質(zhì)的熒光響應(yīng)Fig.9 Fluorescence responses of Mito -H2O2(10 μmol/L) towards different interference compounds：(1) control;(2) KF;(3)H2S;(4) H2Sn;(5) Cys;(6) GSH;(7) Hcy;(8) HNO2;(9) BSA;(10) Gly;(11) vitamin C;(12) Lys;(13) Gly;(14) Glu;(15) HClO;(16) NO;(18) 1O2;(19) OH-;(20) ONOO-;(21) H2O2.

圖10 MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)Fig.10 Cell survival rate of control groups (without Mito -H2O2) and experimental groups

2.9 探針在bv-2細(xì)胞中成像

考察了探針Mito -H2O2對(duì)LPS處理過的bv-2細(xì)胞中H2O2的檢測(cè)。首先我們考察了探針分子亞細(xì)胞器定位情況，如圖11所示：將5 μmol/L Mito -H2O2探針,100 μmol/L的H2O2溶液，以及Mitotracker Red FM(MTR,100 nmol/L)加入bv-2細(xì)胞培養(yǎng)基，孵育60 min，PBS洗去多余的探針后，在波長(zhǎng)430 nm以及640 nm激發(fā)光源下，分別對(duì)探針和線粒體商業(yè)染料進(jìn)行單光子共聚焦熒光成像。收集綠光波段(500～600 nm)以及紅光波段(650～700 nm)的熒光信號(hào)。軟件Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行處理。如圖11所示，發(fā)現(xiàn)探針有很好的線粒體定位能力，共定位系數(shù)達(dá)到0.93。

圖11 線粒體共定位實(shí)驗(yàn)Fig.11 Mitochondrial specificity of Mito -H2O2.Fluorescent images of bv-2 cells contained with(A) Mitotracker Red FM(MTR,100 nmol/L) and(B) Mito -H2O2(5 μmol/L) with H2O2(100 μmol/L) in culture medium for 40 min.(C) Merged image of (A) and(B).Excitation wavelength 430 nm for Mito -H2O2 and 640 nm for MTR.(D)The correlation of Mitotracker Red and Mito-H2O2 intensities scale bar:20 μm.

對(duì)外源性H2O2進(jìn)行了共聚焦成像。將5 μmol/L Mito -H2O2,100 μmol/L H2O2和10 mmol/L NAC加入bv-2細(xì)胞培養(yǎng)基，孵育60 min，PBS洗去多余的探針后，在810 nm激發(fā)光源下進(jìn)行雙光子共聚焦熒光成像。收集綠光波段(500～600 nm)的熒光信號(hào)。軟件Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行處理。如圖12 所示，發(fā)現(xiàn)探針能夠?qū)ν庠葱訦2O2進(jìn)行成像，熒光強(qiáng)度隨H2O2濃度的增加而增加，加入H2O2的清除劑NAC發(fā)現(xiàn)熒光有很明顯的減弱。

圖12 (A)外源性過氧化氫雙光子bv-2細(xì)胞成像圖：5 μmol/L Mito -H2O2分別與0,10,50,100 μmol/L H2O2 (a-d)以及與100 μmol/L H2O2和10 mmol/L NAC(e)反應(yīng),激發(fā)(810 nm)收集500～600 nm通道;(B)熒光柱狀圖(n=3)Fig.12 (A)TPM images of bv-2 cells labeled with 5 μmol/L Mito -H2O2 and 0,10,50,100 μmol/L H2O2 (a-d) and labeled with 5 μmol/L Mito -H2O2,100 μmol/L H2O2 and 10 mmol/L NAC (e) for 40 min at 37 ℃.Images were obtained with 810 nm excitation,and the emissions were collected in the range of 500 - 600 nm(green channel);(B) The fluorescence intensity and the intensity bar was processed by Image-Pro Plus 6.0.cells shown are replicate images from replicate experiments(n=3) Scale bar:50 μm.

實(shí)驗(yàn)對(duì)LPS誘導(dǎo)bv-2細(xì)胞產(chǎn)生H2O2進(jìn)行了共聚焦成像。將5 μmol/L Mito -H2O2與2 μg/mL LPS，以及5 μmol/L Mito -H2O2、2 μg/mL LPS和2 μg/mL NS -398加入bv-2細(xì)胞培養(yǎng)基，孵育60 min，PBS洗去多余的探針后，在810 nm激發(fā)光源下進(jìn)行雙光子共聚焦熒光成像。收集綠光波段(500～600 nm)的熒光信號(hào)。軟件Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行處理。如圖13所示，發(fā)現(xiàn)探針能夠?qū)PS誘導(dǎo)細(xì)胞H2O2進(jìn)行成像，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)加入LPS后，熒光強(qiáng)度有很明顯增強(qiáng)，加入COX-2抑制劑NS -398發(fā)現(xiàn)熒光有很明顯的減弱。

圖13 (A)LPS誘導(dǎo)bv-2過氧化氫雙光子成像圖:5 μmol/L Mito -H2O2孵育細(xì)胞(a)，5 μmol/L Mito -H2O2和2 μg/mL LPS孵育細(xì)胞(b)，5 μmol/L Mito -H2O2,2 μg/mL LPS以及2 μg/mL NS -398孵育細(xì)胞(c)，激發(fā)(810 nm)收集500～600 nm通道；(B)熒光柱狀圖(n=3)Fig.13 (A)TPM images of bv-2 cells labeled with 5 μmol/L Mito -H2O2 (a)，5 μmol/L Mito -H2O2 and 2 μg/mL LPS (b),and 5 μmol/L Mito -H2O2,2 μg/mL LPS and 2 μg/mL NS -398 (c) for 40 min at 37 ℃.Images were obtained with 810 nm excitation,and the emissions were collected in the range of 500 - 600 nm(green channel);(B)The fluorescence intensity and the intensity bar was processed by Image-Pro Plus 6.0.cells shown are replicate images from replicate experiments(n=3) scale bar:50 μm.

2.10 探針在小鼠大腦中成像

實(shí)驗(yàn)最后對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠大腦組織產(chǎn)生H2O2進(jìn)行了共聚焦成像。將200 μL 200 μmol/L Mito -H2O2與1、2、4 mg/mL LPS，以及200 μL 200 μmol/L Mito -H2O2與4 mg/mL LPS和4 mg/mL NS -398通過后腿部皮下注射入小鼠體內(nèi)，14 h之后取小鼠大腦組織，冷凍，用切片機(jī)切成厚度為300 μm的切片，隨后在810 nm激發(fā)光源下進(jìn)行雙光子共聚焦熒光成像。收集綠光波段(500～600 nm)的熒光信號(hào)。軟件Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行處理。如圖14所示，發(fā)現(xiàn)探針能夠?qū)PS誘導(dǎo)小鼠大腦組織H2O2進(jìn)行成像，且熒光強(qiáng)度隨著LPS濃度的增加有很明顯增強(qiáng)，加入COX-2的抑制劑NS -398發(fā)現(xiàn)熒光有很明顯的減弱。

圖14 (A)LPS誘導(dǎo)小鼠大腦組織過氧化氫雙光子成像圖:200 μL 200 μmol/L Mito -H2O2分別與0,1,2,4 mg/mL LPS(a-d)以及4 mg/mL LPS and 4 mg/mL NS -398(e)反應(yīng)14 h，激發(fā)(810 nm)收集500～600 nm通道；(B)熒光柱狀圖(n=3)Fig.14 (A)TPM images of brain tissue labeled with 200 μL 200 μmol/L Mito -H2O2 and 0,1,2,4 mg/mL LPS (a-d) and labeled with 200 μL 200 μmol/L Mito -H2O2,4 mg/mL LPS and 4 mg/mL NS -398(e) for 14 h.TP imaging depth for(a-e) was 100 mm.Images were obtained with 810 nm excitation,and the emissions were collected in the range of 500 - 600 nm(green channel)；(B) The fluorescence intensity and the intensity bar was processed by Image-Pro Plus 6.0.tissue shown are replicate images from replicate experiments(n=3) scale bar:100 μm.

3 結(jié)論

本工作成功合成了線粒體定位雙光子熒光探針Mito -H2O2，該探針與H2O2的響應(yīng)理想，H2O2濃度在0～50 μmol/L范圍呈現(xiàn)良好的線性，且探針與H2O2反應(yīng)后得到的Mito -green具有很好的光物理性質(zhì)，量子產(chǎn)率達(dá)到0.44，雙光子活性截面也達(dá)到了20 GM(810 nm)。此外，探針具有很好的選擇性以及相對(duì)較低的細(xì)胞毒性。共聚焦成像顯示該探針能夠很好地定位于細(xì)胞線粒體中，并且能夠檢測(cè)細(xì)胞外源性H2O2，LPS誘導(dǎo)細(xì)胞H2O2，以及LPS誘導(dǎo)小鼠大腦H2O2，發(fā)現(xiàn)NS -398能夠通過抑制COX-2從而減弱炎癥程度。我們通過在bv-2細(xì)胞以及小鼠大腦中加入NS -398均發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度有不同程度的降低，進(jìn)一步論證了NS -398的抗炎作用。