蘋(píng)果SLAF圖譜構(gòu)建及果銹基因QTL分析

張朝紅，陳東玫，楊鳳秋，趙同生，李 揚(yáng)，趙國(guó)棟，趙永波

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 昌黎果樹(shù)研究所，河北 昌黎 066600)

果銹(Russeting，RUS)是蘋(píng)果[1]、梨[2]、葡萄[3]、馬鈴薯[4-5]等作物的重要性狀之一。馬鈴薯的銹變品種Russet Burbank因綜合了高產(chǎn)、低糖、吸油少、耐貯藏、適宜加工等特性，在美國(guó)、加拿大、法國(guó)、英國(guó)、新西蘭等多地廣泛種植[4,6]。梨的果銹與果皮色澤密切相關(guān)，并對(duì)生物、非生物脅迫起到一定的保護(hù)作用[2,7]。蘋(píng)果多銹品種金冠、Elstar、桔蘋(píng)因果銹的頻繁發(fā)生使其果實(shí)的商品價(jià)值銳減[8-11]，成為限制該類(lèi)品種持續(xù)發(fā)展的一大障礙。

蘋(píng)果、梨等樹(shù)種幼嫩果實(shí)(或塊莖)受到氣候、病菌、藥劑等因子的作用時(shí)，它的表皮細(xì)胞異常分裂、增殖而開(kāi)裂，其下層細(xì)胞膨大木栓化產(chǎn)生木栓形成層，進(jìn)而形成木栓組織，此時(shí)表皮外層的角質(zhì)層不斷龜裂剝落，在果實(shí)(或塊莖)表面形成了黃褐色、赤褐色周皮組織即果銹[8-9,12-17]。果銹的發(fā)生，在幼果期(金冠蘋(píng)果，花后2周)即開(kāi)始，此后的2～6周是果銹形成的關(guān)鍵時(shí)期[9,17]。從生理學(xué)角度分析，苯丙烷類(lèi)代謝、乙烯代謝及次生代謝等多種途徑都與果銹的形成有關(guān)，并且木質(zhì)素生物合成、多胺及過(guò)氧化氫的信號(hào)傳遞可對(duì)果銹的形成進(jìn)行調(diào)控[18-19]。

果銹基因主要包括表皮物質(zhì)合成基因和脅迫應(yīng)答基因2大類(lèi)，根據(jù)功能的不同表皮物質(zhì)合成基因可進(jìn)一步分為表皮生物合成基因、木栓質(zhì)沉積基因。在梨果銹形成過(guò)程中，表皮生物合成基因隨著脅迫應(yīng)答基因、木栓質(zhì)沉積基因的急劇增加而受到抑制[11,20]。在蘋(píng)果多銹品種中，一些編碼纖維素合成酶6、木聚糖合成酶、果膠甲基酯酶的基因表現(xiàn)出了上調(diào)表達(dá)，與木栓質(zhì)相關(guān)的苯丙烷類(lèi)代謝調(diào)控基因的差異表達(dá)，其中的轉(zhuǎn)錄因子MdMYB93在木栓質(zhì)的累積過(guò)程中發(fā)揮主要作用[11,21]。在碭山酥梨的銹變單株中檢測(cè)到10個(gè)ABC家族的銹變差異表達(dá)基因，這些基因參與了銹變果實(shí)木栓化的形成[22]。

果銹基因的遺傳機(jī)制極為復(fù)雜。在梨上，果銹基因是受2對(duì)基因控制，其中的R1/r1基因的SSR標(biāo)記CH01c06和Hi20b03，遺傳距離分別為 4.8，12.0 cM，推測(cè)該基因可能位于梨的LG8上[7]，也有學(xué)者認(rèn)為，果銹屬于質(zhì)量性狀，而果銹含量則為數(shù)量性狀，兩者分別受不同的遺傳位點(diǎn)控制[20]。在蘋(píng)果上，果銹的遺傳力中等，通常在0.34～0.54[23-24]；近年來(lái)獲得了1個(gè)控制Renetta Grigia di Torriana銹變的主效基因，它位于蘋(píng)果的LG12染色體上[25]，然而，關(guān)于果銹基因的分子遺傳機(jī)制尚不清楚。2015年在宮崎短枝富士(MYS)×坂田津輕(SKT)的雜種分離群體中發(fā)現(xiàn)了全銹的子代單株，通過(guò)3 a觀(guān)察該株子代表現(xiàn)穩(wěn)定。本研究以該群體的子代植株為試材，采用SLAF技術(shù)開(kāi)發(fā)標(biāo)簽并構(gòu)建圖譜，結(jié)合表型數(shù)據(jù)分析，對(duì)蘋(píng)果果銹基因進(jìn)行遺傳定位，以期找到控制蘋(píng)果果銹的遺傳位點(diǎn)，為無(wú)銹蘋(píng)果或免套袋蘋(píng)果品種的選育及利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2003年以宮崎短枝富士為母本，坂田津輕為父本雜交，2004年播種雜交種子，2010年轉(zhuǎn)接于SH6中間砧砧木上，進(jìn)行常規(guī)的果園管理。進(jìn)入結(jié)果期后，在該分離群體中發(fā)現(xiàn)了全銹蘋(píng)果變異株(圖1)。

1.全果銹蘋(píng)果(成熟期)；2.全果銹蘋(píng)果(幼果期)；3.對(duì)照。1. Full russeting apple at ripen stage; 2.Russeting in young fruits;3.Control.

1.2 試驗(yàn)方法

采集宮崎短枝富士×坂田津輕雜種分離群體中的150株子代及雙親的蘋(píng)果葉片，采用CTAB法分別提取基因組DNA后，運(yùn)用SLAF-seq 技術(shù)(Specific-locus amplified fragment sequencing)和HighMap 軟件進(jìn)行高密度分子標(biāo)簽開(kāi)發(fā)，構(gòu)建高密度遺傳圖譜，然后對(duì)果銹基因進(jìn)行QTL定位。

1.2.1 表型調(diào)查 參照Durel等[23]的方法，稍有改進(jìn)，設(shè)4級(jí)：0級(jí)無(wú)或沒(méi)有見(jiàn)到；1級(jí)果面有少量果銹(少于1/3)，2級(jí)果面有大量果銹(介于1/3和1/2之間)；3級(jí)果面銹量1/2以上。2015-2017年連續(xù)3 a對(duì)雜種分離后代果面果銹情況進(jìn)行調(diào)查。

1.2.2 酶切方案設(shè)計(jì)及測(cè)序 根據(jù)蘋(píng)果(MalusdomesticaBorkh.)基因組大小以及 GC 含量等信息進(jìn)行酶切預(yù)測(cè)。選擇RsaⅠ 和HaeⅢ 酶切組合，酶切片段長(zhǎng)度在 364～464 bp 的序列定義為 SLAF標(biāo)簽，預(yù)測(cè)可得到 123 512 個(gè) SLAF 標(biāo)簽。根據(jù)最適酶切方案，對(duì)檢測(cè)合格的各樣品基因組 DNA 分別進(jìn)行酶切。得到的酶切片段(SLAF 標(biāo)簽)進(jìn)行 3′端加 A 處理、連接 Dual-index[26]測(cè)序接頭、PCR 擴(kuò)增、純化、混樣、切膠選取目的片段，文庫(kù)質(zhì)檢合格后用IlluminaHiSeqTM 進(jìn)行 PE125bp 測(cè)序。

1.2.3 SNP開(kāi)發(fā)及編碼 根據(jù) Clean Reads 在參考基因組的定位結(jié)果，使用 Picard 進(jìn)行去重復(fù)、GATK 進(jìn)行局部重比對(duì)、堿基質(zhì)量值校正等預(yù)處理，以保證檢測(cè)得到的單核苷酸多態(tài)性(SNP)準(zhǔn)確性，再使用 GATK 進(jìn)行SNP的檢測(cè)，過(guò)濾，并得到最終的 SNP 位點(diǎn)集。根據(jù)遺傳學(xué)通用的等位編碼規(guī)則對(duì)多態(tài)性標(biāo)簽進(jìn)行基因型編碼。

1.2.4 圖譜構(gòu)建 為保證遺傳圖譜質(zhì)量，將多態(tài)性 SLAF 標(biāo)簽進(jìn)行過(guò)濾：過(guò)濾掉父母本測(cè)序深度 4×以下的標(biāo)簽；對(duì)于單一多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，選擇100 個(gè)子代中至少有 70 個(gè)個(gè)體有確定基因型的標(biāo)記；用偏分離標(biāo)記處理方法過(guò)濾嚴(yán)重偏分離(卡方檢驗(yàn)P<0.001)的多態(tài)性標(biāo)記。

將篩選獲得的標(biāo)記，通過(guò)計(jì)算兩兩標(biāo)簽之間MLOD 值[27]，過(guò)濾掉與其中SLAF標(biāo)簽的MLOD值低于 3 的標(biāo)簽，將標(biāo)簽分到 17 個(gè)群。以連鎖群為單位，采用 HighMap 軟件分析將獲得連鎖群內(nèi) Marker 的線(xiàn)性排列，并估算相鄰 Marker間的遺傳距離。

1.2.5 QTL分析 基于表型數(shù)據(jù)值，采用mapqtl方法對(duì)果銹基因進(jìn)行QTL分析，LOD閾值為3.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評(píng)估

利用Hiseq2500平臺(tái)進(jìn)行SLAF-seq文庫(kù)的測(cè)序分析。結(jié)果表明，測(cè)序獲得了 110 321 714 552 bp數(shù)據(jù)，測(cè)序平均 Q30 為 95.07%，平均 GC 含量為 40.11%，樣本 GC 分布正常。宮崎短枝富士和坂田津輕分別獲得29 944 687 reads (8 972 246 842 bp)、29 251 169 reads(8 763 175 910 bp)數(shù)據(jù)，測(cè)序平均Q30為 93.68%，93.86%，平均GC含量為 38.36%，38.30%；子代群體獲得了3 086 176 reads，617 235 279 bp數(shù)據(jù)，測(cè)序平均Q30為 95.09%，平均GC含量為 40.14%；各樣本GC分布正常(表1)。

表1 樣品測(cè)序數(shù)量Tab.1 Quantity of sequencing sample

2.2 建庫(kù)評(píng)估

將測(cè)序獲得的231 821 reads，通過(guò) SOAP軟件[28]對(duì) Control 的測(cè)序 reads 與參考基因組進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，Control數(shù)據(jù)的建庫(kù)雙端比對(duì)效率在89.17%，酶切效率為88.41%，SLAF建庫(kù)正常。

2.3 標(biāo)記開(kāi)發(fā)

使用 GATK 軟件工具包分別對(duì)親本和子代的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)和SNP開(kāi)發(fā)。結(jié)果顯示，宮崎短枝富士和坂田津輕分別開(kāi)發(fā)了4 669 811，4 951 676個(gè)SNP標(biāo)簽，雜合比率為69.35%和81.65%。子代群體開(kāi)發(fā)了1 116 418個(gè)標(biāo)簽，雜合比率為10.83%(表2)。同時(shí)，還開(kāi)發(fā)了SLAF 20 440個(gè)，平均測(cè)序總深度為2 538 482 cM，平均測(cè)序深度為12.01 cM。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)和SNP統(tǒng)計(jì)Tab.2 Comparison of sequencing data and SNP

開(kāi)發(fā)的SNP標(biāo)記中非 aa×bb 標(biāo)簽的數(shù)目為 3 989 143個(gè)，占總開(kāi)發(fā)的 SNP 數(shù)目的 54.50%(表3)。

2.4 遺傳圖譜構(gòu)建

過(guò)濾篩選后的標(biāo)記根據(jù)MLOD值進(jìn)行連鎖群的劃分，所有標(biāo)簽分別歸為17個(gè)群繪制連鎖群。然后以連鎖群為單位，采用Highmap將群內(nèi)標(biāo)記進(jìn)行線(xiàn)性排列，共獲得上圖標(biāo)記4 075個(gè)，總圖距為2 235.23 cM(圖2)。

表3 SNP的分類(lèi)統(tǒng)計(jì)Tab.3 Statistic of SNP Marker

圖2 宮崎短枝富士×坂田津輕雜種分離群體的遺傳圖譜Fig.2 Genetic map constructed with a population derived from Miyazaki Spur×Sakata Tsugaru

2.5 遺傳圖譜評(píng)估

構(gòu)建的中性遺傳圖譜，將4 075個(gè)標(biāo)記定位在17個(gè)連鎖群上，每個(gè)連鎖群平均包括240個(gè)標(biāo)記，2個(gè)標(biāo)記的平均圖距在0.55 cM(表4)。上圖標(biāo)記中包含了256個(gè)偏分離標(biāo)記，占標(biāo)記總數(shù)的比例為6.28%。

表4 分子標(biāo)記及偏分離標(biāo)記位點(diǎn)在連鎖群上的分布Tab.4 Basic characteristics of Malus linkage groups in the cross of between Miyazaki Spur and Sakata Tsugaru

對(duì)作圖群體每個(gè)個(gè)體上圖標(biāo)記完整性分析發(fā)現(xiàn)，上圖標(biāo)記的完整度平均為 99.92%，圖譜基因分型準(zhǔn)確。將上圖標(biāo)記在基因組上的位置和遺傳圖譜進(jìn)行共線(xiàn)性分析發(fā)現(xiàn)，各個(gè)連鎖群上大部分標(biāo)記的順序與基因組保持一致，說(shuō)明共線(xiàn)性較好，遺傳重組率的計(jì)算準(zhǔn)確度高。

2.6 QTL分析

連續(xù)3 a的田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在調(diào)查的150株中，8株無(wú)明顯果銹，占調(diào)查數(shù)的5.3%，22株果銹量為1級(jí)，占調(diào)查數(shù)的14.7%，44株果銹量為2級(jí)，占調(diào)查數(shù)的29.3%，還有76株的銹含量在年份間差異較大。經(jīng)mapqtl分析，共檢測(cè)到控制蘋(píng)果果銹的9個(gè)QTL，分布在Chr3、Chr9、Chr11和Chr15染色體上(圖3)，標(biāo)記距離為0～4.9 cM，分別將這些QTL命名為Qru-3、Qru-9、Qru-11和Qru-15(圖4)，單個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率為18.0%～85.5%(表5)。其中，Qru-9、Qru-15和Qru-3的貢獻(xiàn)率較高(分別為85.5%，24.3%～47.8%和46.1%)，可能是控制蘋(píng)果果銹的關(guān)鍵作用位點(diǎn)。

圖3 果銹基因的QTL檢測(cè)Fig.3 QTL analysis of apple russeting gene

圖4 利用宮崎短枝富士和坂田津輕雜種分離群體檢測(cè)到果銹基因的QTLFig.4 QTL for apple russeting in a population derived from a cross between Miyazaki Spur and Sakata Tsugaru

染色體Linkage group ID位置/cMLocation標(biāo)記MarkerLOD貢獻(xiàn)率/%PVE Chr11101.79Marker2531723.7222.0Chr11101.79Marker2562423.7421.8Chr11105.53Marker2570593.0318.0Chr1516.01Marker9755194.3524.3Chr1516.01Marker9792184.8147.8Chr1516.01Marker9755204.8147.8Chr1520.91Marker9792194.0647.1Chr3123.42Marker24224813.0446.1Chr9107.61Marker35875255.9085.5

對(duì)標(biāo)記區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步基因注釋?zhuān)⑨尩?27個(gè)基因，該4個(gè)染色體各包括61，64，1，1個(gè)基因。GO注釋結(jié)果可知，它們?cè)诩?xì)胞組分、分子功能及生理代謝方面發(fā)揮作用，其中Qru-11、Qru-15所攜帶信息更多一些，是今后研究的重點(diǎn)(表6)。

表6 標(biāo)記區(qū)域的基因注釋Tab.6 Annotation of the marked regions of apple russeting gene

3 結(jié)論與討論

SLAF-seq技術(shù)是利用二代高通量測(cè)序發(fā)展而來(lái)的一套簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)。根據(jù)參考基因組信息，通過(guò)特定內(nèi)切酶酶切基因組并篩選特定大小的片段建庫(kù)測(cè)序，從而選擇性地得到目標(biāo)基因組的片段序列。目前，基于 SLAF-seq 的分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在黃瓜[29]、葡萄[30]、木薯[31]、石槲蘭[32]、玉米[33-34]等植物中得到應(yīng)用。本研究利用該技術(shù)開(kāi)發(fā)SLAF標(biāo)簽20 440個(gè)，SNP標(biāo)記位點(diǎn)7 309 729個(gè)，這些信息位點(diǎn)為蘋(píng)果相關(guān)基因的定位和分子輔助育種研究奠定了基礎(chǔ)。

以往研究表明，蘋(píng)果果銹受氣候、病菌等因素的影響，蘋(píng)果果銹的遺傳力中等[23-24]，而該基因的大小及所在的位置尚不清楚。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為性狀的遺傳分析提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持[35]。Falginella等[25]將Ru-RGT定位在LG12上400 bp的基因片段上，進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，嘎拉蘋(píng)果上也擁有該基因位點(diǎn)，但是桔蘋(píng)等一些多銹品種沒(méi)有檢測(cè)到。因此，果銹基因的遺傳機(jī)制更為復(fù)雜，為進(jìn)一步發(fā)掘新的果銹基因，本研究在開(kāi)發(fā)標(biāo)記的基礎(chǔ)上，進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建并結(jié)合3 a的表型數(shù)據(jù)，新獲得了9個(gè)果銹相關(guān)QTL，分布于Chr3、Chr9、Chr11和 Chr15上，在這些區(qū)段內(nèi)共注釋到127個(gè)基因，它們?cè)诩?xì)胞組分、分子功能及生理代謝方面發(fā)揮作用。參照RNA混池重測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的206個(gè)參與細(xì)胞構(gòu)建、生物代謝等過(guò)程的差異表達(dá)基因[2]，進(jìn)行對(duì)比分析、驗(yàn)證，有助于果銹基因的分子調(diào)控機(jī)制深入揭示。

一直以來(lái)，蘋(píng)果果銹基因被作為不利性狀來(lái)看待[8-14]，不過(guò)最近在默頓和皇家嘎拉蘋(píng)果的果銹組織上檢測(cè)到樺木酸-3-反式-咖啡酸酯等3種三萜烯-咖啡酸酯，它們都具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)活性[1]，為果銹基因的開(kāi)發(fā)利用提供了新思路。多年來(lái)的觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，果面銹含量多的果肉更脆，本研究群體中發(fā)現(xiàn)的全銹株即是如此，但是果實(shí)肉質(zhì)是與果銹基因連鎖，還是因受果銹相關(guān)代謝活動(dòng)的直接影響所致，具體原因有待進(jìn)一步研究。