• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同氧濃度下C2C12細(xì)胞的Nrf2抗氧化系統(tǒng)對(duì)H2O2刺激的反應(yīng)*

    2019-11-05 12:19:40姬衛(wèi)秀
    關(guān)鍵詞:骨骼肌低氧抗氧化

    姬衛(wèi)秀, 張 纓

    (1.北京體育大學(xué), 北京 100084; 2.天津體育學(xué)院, 天津 301617)

    眾所周知,模擬低氧訓(xùn)練或高原訓(xùn)練可以提高運(yùn)動(dòng)員骨骼肌的耐力水平。有研究顯示,人和大鼠在低氧耐力訓(xùn)練后,骨骼肌中氧化物的產(chǎn)生減少,抗氧化酶表達(dá)增加,其效果比常氧訓(xùn)練更佳[1]。這些結(jié)果暗示,運(yùn)動(dòng)耐力的提高至少部分與低氧引起的骨骼肌抗氧化能力增強(qiáng)有關(guān)。然而,不同氧濃度的低氧環(huán)境刺激可能對(duì)骨骼肌氧化還原狀態(tài)影響不同。已有研究發(fā)現(xiàn),不適宜的低氧刺激,可誘發(fā)機(jī)體骨骼肌的氧化損傷,引起骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的改變,而適宜氧濃度的低氧刺激提高其抗氧化能力,降低脂質(zhì)過氧化水平[2]。不同氧濃度的低氧環(huán)境下如何影響骨骼肌的抗氧化作用機(jī)制,目前并不十分清楚。

    轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在正常生理狀態(tài)下,Nrf2與Keapl耦聯(lián),被錨定于胞漿中,使Nrf2處于抑制失活狀態(tài)。缺氧時(shí),細(xì)胞線粒體代謝異常, “電子漏”增加,使活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成大量增加,使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。當(dāng)受到外界氧化應(yīng)激刺激后,Keap1蛋白的構(gòu)象會(huì)發(fā)生一些變化,使得與Nrf2的偶聯(lián)作用發(fā)生解離,Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,與核內(nèi)的小分子Maf蛋白形成雜化二聚體,然后與DNA序列上的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合, 啟動(dòng)下游抗氧化酶基因如超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、醌氧化物還原酶(NADPH: quinine oxidoreductase-1,NQO-1)、血紅素氧化酶(heme oxygenase-1,HO-1)、谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase-1,GPX-1)等的轉(zhuǎn)錄,成為許多抗氧化基因的開關(guān)[3]。

    Nrf2-ARE介導(dǎo)的抗氧化信號(hào)通路,目前被認(rèn)為是細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的核心部分[4]。對(duì)低氧敏感的盲鼴鼠的基因檢測發(fā)現(xiàn),Nrf2與低氧適應(yīng)密切相關(guān)[5]。在不同氧濃度下的C2C12細(xì)胞中Nrf2介導(dǎo)的抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮怎樣的作用,目前并未見相關(guān)報(bào)道。因此,本研究采用小鼠骨骼肌C2C12細(xì)胞系,在常氧和不同氧濃度低氧環(huán)境中培養(yǎng),探討不同氧濃度下C2C12細(xì)胞中Nrf2介導(dǎo)的抗氧化系統(tǒng)對(duì)H2O2刺激反應(yīng)的變化,為低氧在生活中的應(yīng)用和低氧訓(xùn)練提高運(yùn)動(dòng)員成績提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與設(shè)備

    小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞系(C2C12細(xì)胞),國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞共享平臺(tái)北京總部; CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(G3580)試劑盒, Promega公司;抗熒光淬滅封片劑,中杉金橋,ZLI-9557; BCA Protein Assay Reagent,美國Thermo Scientific公司;Bolt 4%~12% Bis-Tris Plus凝膠,美國life technologies公司;NuPAGE MOPS SDS(20×)電泳緩沖液,美國life technologies公司;TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit,Cat#9767; SYBR Green Realtime PCR Master Mix,Toyobo公司; GENMED的ROS試劑盒,GMS10016.1。

    常氧恒溫培養(yǎng)箱,日本 SANYO 公司;熒光共聚焦顯微鏡,德國LeicaSP8;iBlot 2轉(zhuǎn)膜儀,美國Invitrogen公司;BIO-RAD凝膠顯影儀;熒光定量PCR儀,美國ABI7500。

    1.2 C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)

    小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞系(C2C12細(xì)胞)購于國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞共享平臺(tái)北京總部。細(xì)胞復(fù)蘇后,加入在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(青霉素106U/ml,鏈霉素100 U/ml),置于37°C、5%CO2的常氧恒溫培養(yǎng)箱。兩天換液一次,待細(xì)胞生長至融合度為80%~90%時(shí), 用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化1 min后,用含血清的培養(yǎng)基終止消化,輕輕吹打,置于顯微鏡下觀察均為單個(gè)細(xì)胞后,進(jìn)行傳代至3代后,進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)在北京體育大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室完成。

    1.3 H2O2濃度及作用時(shí)間的選擇

    取對(duì)數(shù)期的C2C12細(xì)胞,消化后吹打制備成單細(xì)胞懸液,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,接種密度約為2.5×105cells/ml,置于37°C、5%CO2的常氧恒溫培養(yǎng)箱24 h后,棄舊培養(yǎng)基,PBS清洗每孔,將細(xì)胞分為7組,每組復(fù)孔8個(gè),其中對(duì)照組不做任何處理,繼續(xù)用10%的完全培養(yǎng)基培養(yǎng),其余6組分別加入含不同濃度H2O2的(0.1 mmol/L、0.25 mmol/L、 0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L)完全培養(yǎng)基,100 μl/孔,置于37°C、5%CO2常氧恒溫培養(yǎng)箱中孵育。經(jīng)1和2 h后分別取一塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板測細(xì)胞活力。

    使用Promega公司CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(G3580)試劑盒測細(xì)胞活力。具體操作如下:細(xì)胞經(jīng)過一定時(shí)間的處理后,將其細(xì)胞培養(yǎng)基吸出,用PBS清洗兩次,加入含MTS的完全培養(yǎng)基,置于37°C、5%CO2常氧恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h,用酶標(biāo)儀在490 nm下測每孔的OD值。

    1.4 不同氧濃度條件下C2C12細(xì)胞對(duì)H2O2刺激的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下,將細(xì)胞分為不同氧濃度組,即21%、12%、8%和5%O2組。將處于對(duì)數(shù)期生長的C2C12細(xì)胞,按2.5×105cells/ml的密度接種于培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)板上,每組復(fù)孔8個(gè),待細(xì)胞融合度達(dá)到約80%時(shí),轉(zhuǎn)移入氧濃度分別為21%、12%、8%和5%的37°C、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。待8組細(xì)胞各自培養(yǎng)12 h后,棄掉舊培養(yǎng)基,PBS清洗2次,加入含有0.5 mmol/L的H2O2完全培養(yǎng)基作用1 h后,收集細(xì)胞或繼續(xù)進(jìn)行其他測試。

    1.5 測試指標(biāo)及方法

    1.5.1 培養(yǎng)C2C12細(xì)胞免疫熒光 取出已爬好細(xì)胞的玻璃底培養(yǎng)皿,常溫PBS洗3次,用4%的多聚甲醛固定30 min,PBS洗3次,0.5% Triton X-100(PBS配制)室溫通透5 min,在小皿中間加入BSA(2.5%,PBS稀釋)封閉液,室溫封閉30 min后,加入一抗(Nrf2,sc-365949,Santa Cruz),放入濕盒,4℃過夜。第2日,去除一抗,加入熒光二抗(兔抗鼠bc-0296R-AF488,博奧森),避光室溫孵育30 min,PBS避光洗3次后,吸干液體,加入含DAPI的抗熒光淬滅封片劑,蓋上蓋玻片,在熒光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

    為了確?;鶎愚r(nóng)村河道清淤施工的質(zhì)量,在確定清淤施工所用施工技術(shù)的基礎(chǔ)上,需要做好必要的施工準(zhǔn)備工作,為后續(xù)的施工奠定良好條件。具體準(zhǔn)備工作要點(diǎn)如下,一是做好施工布置。要本著因地制宜、經(jīng)濟(jì)合理和可靠安全等原則,立足于基層農(nóng)村河道清淤的實(shí)際情況,嚴(yán)格依據(jù)施工招標(biāo)文件等來做好施工布置工作。二是組織設(shè)計(jì)單位、建設(shè)單位及監(jiān)理單位等做好水準(zhǔn)點(diǎn)和控制點(diǎn)等的施工測量與放樣工作,確保相關(guān)淤泥清除表面標(biāo)高等控制的準(zhǔn)確性。三是要做好河道清淤施工中所用設(shè)備的良好運(yùn)行和維護(hù)管理,確保設(shè)備運(yùn)行狀態(tài)良好,為后續(xù)的河道清淤奠定良好的施工基礎(chǔ)。

    1.5.2 Nrf2蛋白表達(dá)的Western blot檢測 對(duì)提取的蛋白進(jìn)行BCA蛋白濃度測定,根據(jù)濃度計(jì)算配樣,上樣量為10 μg。采用Bolt 4%~12% Bis-Tris Plus凝膠和NuPAGE MOPS SDS(20×)電泳緩沖液進(jìn)行電泳。用iBlot 2將蛋白從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜。目的條帶標(biāo)記后用5%的脫脂牛奶或BSA封閉1 h后,進(jìn)行一抗孵育:Nrf2(sc-722,1∶200)、總蛋白內(nèi)參β-actin(sc-47778,1∶1 000),于4°C搖床孵育過夜。次日洗脫一抗后進(jìn)行二抗孵育1 h:Nrf2(羊抗兔,中杉金橋,ZB-2301,1∶2 000)。最后洗脫二抗后加發(fā)光液用BIO-RAD凝膠顯影儀器進(jìn)行顯影,用其配套軟件進(jìn)行條帶檢測與分析。讀取灰度值,計(jì)算結(jié)果,公式如下:

    1.5.3 培養(yǎng)C2C12細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的RT-PCR檢測 采用TaKaRa公司的試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit,Cat#9767)提取細(xì)胞RNA。按照反應(yīng)體系為65℃,5 min; 37℃,15 min; 98℃,5 min的反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后取2 μl cDNA加入熒光染料反應(yīng)體系(Toyobo公司,SYBR Green Realtime PCR Master Mix)及一定量的引物,采用熒光定量PCR儀,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,其中引物分別為Nrf2(QT00095270)、SOD1(QT00165039)、SOD2(QT00161707)、CAT(QT01058106)、NQO-1(QT00094357)、HO-1(QT00159915)、GPX-1(QT01195936)、18S rRNA (QT010036875)反應(yīng)完成后使用PCR儀自帶的軟件對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量CT值進(jìn)行讀取,用比較 CT 法對(duì)目的基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量。具體計(jì)算公式如下:

    目的基因=2-△△CT

    1.5.4 培養(yǎng)C2C12細(xì)胞產(chǎn)生ROS測定 采用GENMED的試劑盒(GMS10016.1)產(chǎn)地公司測定細(xì)胞產(chǎn)生的ROS,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵循試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 H2O2濃度及作用時(shí)間的選擇

    采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較與對(duì)照組之間細(xì)胞活力的差異,得知:H2O2作用于C2C12細(xì)胞1 h,濃度為0.5 mmol/L,0.75 mmol/L,1 mmol/L,2 mmol/L中的C2C12細(xì)胞活力均出現(xiàn)顯著性降低(P<0.05,表1);將H2O2作用時(shí)間延長到2 h,與對(duì)照組相比,H2O2濃度為0.5 mmol/L時(shí),C2C12細(xì)胞活力即出現(xiàn)非常顯著降低(P<0.01),且隨H2O2濃度的升高C2C12細(xì)胞活力出現(xiàn)急劇降低。綜合比較,選擇H2O2作用時(shí)間相對(duì)較短的1 h組中,濃度0.5 mmol/L,作為本實(shí)驗(yàn)的H2O2刺激。

    Group1H2HControl0.869±0.1020.997±0.1170.1 mmol/L0.864±0.0960.812±0.148??0.25 mmol/L0.783±0.1670.735±0.126??0.5 mmol/L0.663±0.111??0.679±0.229??0.75 mmol/L0.652±0.050??0.403±0.075??1 mmol/L0.746±0.108?0.358±0.061??2 mmol/L0.649±0.078??0.304±0.033??

    1H: cell cutured in H2O2for 1 hour; 2H: Cell cutured in H2O2for 2 hours; 0.1 mmol/L: H2O2concentration was 0.1 mmol/L; 0.25 mmol/L: H2O2concentration was 0.25 mmol/L; 0.5 mmol/L:H2O2concentration was 0.5 mmol/L; 0.75 mmol/L: H2O2concentration was 0.75 mmol/L; 1 mmol/L: H2O2concentration was 1 mmol/L; 2 mmol/L: H2O2concentration was 2 mmol/L

    *P<0.05,**P<0.01vscontrol group

    2.2 不同氧濃度下C2C12細(xì)胞對(duì)H2O2刺激的Nrf2蛋白免疫熒光的影響

    由圖1可知,21%O2組C2C12細(xì)胞Nrf2蛋白(綠色)主要位于細(xì)胞核(藍(lán)色)外的胞漿。與21%O2組相比,12%O2組C2C12細(xì)胞Nrf2蛋白熒光強(qiáng)度高,8%O2組細(xì)胞Nrf2蛋白熒光無變化,5%O2低氧組的細(xì)胞Nrf2蛋白熒光弱。說明,氧濃度不同細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)量不同(圖1見彩圖頁Ⅱ)。

    2.3 不同氧濃度下C2C12細(xì)胞對(duì)H2O2刺激的Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

    GroupNrf2 mRNA/18S rRNANrf2 protein/β-actin21%O21.000±0.2071.005±0.15212%O21.394±0.486?1.321±0.407?8%O21.178±0.4191.031±0.2155%O20.740±0.210?0.729±0.274?

    21%O2; Concentration of O2was 21%; 12%O2; Concentration of O2was 12%; 8%O2; Concentration of O2was 8%;5%O2; Concentration of O2was 5%; Nrf2: NF-E2-related factor

    *P<0.05vs21% O2group

    12%氧濃度低氧可促進(jìn)Nrf2表達(dá),5%氧濃度低氧則會(huì)抑制Nrf2表達(dá)。

    2.4 不同氧濃度下C2C12細(xì)胞對(duì)H2O2刺激的抗氧化酶mRNA表達(dá)的影響

    由表3可知,與21%O2組相比,12%O2組C2C12細(xì)胞抗氧化酶SOD1(P<0.05)、SOD2(P<0.01)、CAT(P<0.05)、NQO-1(P<0.05)、HO-1(P<0.05)、GPX-1(P<0.01)的mRNA顯著增加;8%O2組細(xì)胞抗氧化酶SOD1、SOD2、CAT、NQO-1、HO-1 mRNA略有增加但均無顯著性變化,只有GPX-1(P<0.05)mRNA顯著增加;而5%O2組細(xì)胞抗氧化酶SOD1(P<0.05)、SOD2(P<0.01)、NQO-1(P<0.01)、GPX-1(P<0.01)的mRNA則顯著降低,CAT和HO-1 mRNA無顯著變化。說明,12%氧濃度低氧可促進(jìn)Nrf2介導(dǎo)的下游抗氧化酶mRNA表達(dá),5%氧濃度低氧則對(duì)抗氧化酶mRNA表達(dá)具有抑制作用。

    Tab. 3 Changes of the mRNA relative expressions of antioxidant enzyme in cells of each group n=8)

    21%O2: Concentration of O2was 21%; 12%O2: Concentration of O2was 12%; 8%O2;Concentration of O2was 8%; 5%O2: Concentration of O2was 5%; SOD1: Superoxide dismutase 1; SOD2: Superoxide dismutase 2; CAT: Catalase; NQO-1: NAD(P)H: quinine oxidoreductase-1; HO-1: Heme oxygenase-1; GPX-1: Glutathione peroxidase-1

    *P<0.05,**P<0.01vs21%O2group

    2.5 不同氧濃度下C2C12細(xì)胞對(duì)H2O2刺激的ROS水平的影響

    由表4可知,與21%O2組相比,12%O2組C2C12細(xì)胞ROS水平非常顯著性降低(P<0.01),8%O2組細(xì)胞ROS水平無顯著性變化,5%O2組的細(xì)胞ROS水平則非常顯著升高(P<0.01)。

    GroupROS (fluorescence intensity)21%O2103468.9±3635.512%O265987.8±15168.0??8%O2125976.7±26214.25%O2116144.5±5085.0??

    21%O2: Concentration of O2was 21%; 12%O2: Concentration of O2was 12%; 8%O2: Concentration of O2was 8%; 5%O2: Concentration of O2was 5%; ROS: Reactive oxygen species

    **P<0.01vs21%O2group

    3 討論

    低氧引起自由基的產(chǎn)生增多,激活抗氧化酶活性,低氧預(yù)適應(yīng)可上調(diào)抗氧化酶等基因的表達(dá),從而預(yù)防因缺氧而導(dǎo)致的損傷。對(duì)人類細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞在10%氧濃度低氧條件下24 h,Nrf2 mRNA表達(dá)顯著升高[6];癌細(xì)胞在極限低氧環(huán)境(氧濃度小于0.05%)出現(xiàn)Nrf2蛋白表達(dá)增加,Keap1表達(dá)降低[7]。SD大鼠在氧濃度為6%的低氧環(huán)境中暴露1 h和低氧暴露后又復(fù)氧均可增加其腦部微血管Nrf2的易位[8]。研究發(fā)現(xiàn),低氧刺激可使人血液中SOD、GSH-PX、CAT等抗氧化酶基因的表達(dá)量增加,且世居高原者血液中抗氧化酶SOD水平較世居平原者高[9]。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5在化學(xué)性低氧后,抗氧化酶SOD和CAT mRNA表達(dá)增加[10]。在本研究中,12%氧濃度低氧處理C2C12細(xì)胞12 h后,細(xì)胞Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高,下游抗氧化酶SOD1、SOD2、CAT、NQO-1、HO-1和GPX-1的mRNA表達(dá)量也均顯著增加,C2C12細(xì)胞ROS水平則出現(xiàn)非常顯著降低。表明12%氧濃度低氧可以刺激C2C12細(xì)胞Nrf2表達(dá)增加。Nrf2的表達(dá)增加,可能使Nrf2轉(zhuǎn)位入核增加,與ARE結(jié)合作用增強(qiáng),進(jìn)而使下游抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄水平提高,mRNA表達(dá)水平上調(diào),抗氧化作用增強(qiáng),對(duì)細(xì)胞內(nèi)自由基的清除能力增強(qiáng),最終使得C2C12細(xì)胞ROS水平降低。說明C2C12細(xì)胞可能為了對(duì)氧濃度為12%的低氧環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng),發(fā)生了一系列代償性反應(yīng),對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一種保護(hù)作用。

    有人發(fā)現(xiàn),10%氧濃度低氧處理大鼠心肌H2C9細(xì)胞4 h,細(xì)胞死亡率基本無變化[11]。SD大鼠在模擬海拔高度5 000 m低壓氧艙中持續(xù)暴露4周,心肌中抗氧化酶SOD活力也未發(fā)生顯著性變化[12]。而在本研究中氧濃度為8%的低氧刺激,對(duì)C2C12細(xì)胞Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)變化影響不大,對(duì)其下游抗氧酶的表達(dá)也基本無影響,只有GPX-1的mRNA表達(dá)增強(qiáng),且細(xì)胞ROS水平也未發(fā)生顯著變化。說明在本實(shí)驗(yàn)中的8%O2對(duì)C2C12細(xì)胞的Nrf2抗氧化系統(tǒng)影響不大,可能由于C2C12細(xì)胞對(duì)氧濃度為8%的低氧刺激不敏感,或者可能已發(fā)生了耐受作用,產(chǎn)生了適應(yīng),故Nrf2抗氧化系統(tǒng)未發(fā)生顯著變化。

    陳然發(fā)現(xiàn),SD大鼠在氧濃度為5%的低氧艙中,間歇低氧作用3周后,主動(dòng)脈和腎組織胞漿、胞核中Nrf2蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào)[13]。人類絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞在3%氧濃度低氧條件下24 h,Nrf2 mRNA表達(dá)顯著降低[6]。HT22細(xì)胞在氧濃度2.5%低氧處理24 h后復(fù)氧,其細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)降低[14]。有報(bào)道指出,在1%氧濃度低氧下,骨骼肌細(xì)胞系橫紋肌肉瘤細(xì)胞中抗氧化酶GSH、SOD、CAT、GST、GPx的蛋白表達(dá)非常顯著性降低[15]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)轉(zhuǎn)化細(xì)胞RGC-5在5%氧濃度低氧中培養(yǎng),抗氧化酶GSH含量明顯降低,MDA顯著升高[16]。成人心肌細(xì)胞經(jīng)1%氧濃度低氧處理后,ROS水平也顯著升高[17]。本研究中,C2C12細(xì)胞在氧濃度為5%的低氧環(huán)境中Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)均降低,抗氧化酶SOD1、SOD2、NQO-1和GPX-1的mRNA表達(dá)量也出現(xiàn)顯著下降,細(xì)胞ROS水平則呈現(xiàn)顯著增加。氧濃度5%的低氧抑制了C2C12細(xì)胞Nrf2的表達(dá),而抗氧化酶的表達(dá)隨Nrf2表達(dá)的變化而發(fā)生變化,氧濃度為5%的低氧環(huán)境可能由于氧濃度太低抑制了Nrf2的表達(dá),進(jìn)而對(duì)下游抗氧化酶的表達(dá)也產(chǎn)生了抑制作用,使細(xì)胞抗氧化能力降低,自由基清除能力降低,細(xì)胞ROS水平升高,說明氧濃度為5%低氧可能引起了細(xì)胞氧化損傷,這可能與細(xì)胞的代謝失?;蚬δ芪蓙y有關(guān)[15]。

    生理?xiàng)l件下,機(jī)體本身也會(huì)產(chǎn)生自由基,但在自由基產(chǎn)生的同時(shí),體內(nèi)也存在著清除自由基的抗氧化酶等防御系統(tǒng),兩者共同發(fā)揮作用,就會(huì)使機(jī)體內(nèi)自由基的生成和消除處于一種動(dòng)態(tài)平衡;但是,當(dāng)機(jī)體處于低氧環(huán)境中時(shí),這種氧化和抗氧化系統(tǒng)間的動(dòng)態(tài)平衡就有可能被打破。在本研究中,C2C12細(xì)胞處于12%氧濃度低氧時(shí),低氧強(qiáng)度適宜,產(chǎn)生新的平衡,機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng),則抗氧化能力提高;而C2C12細(xì)胞處于5%氧濃度低氧時(shí),低氧強(qiáng)度過大,會(huì)使氧化和抗氧化一直處于失衡狀態(tài),最終使得機(jī)體的抗氧化能力下降。之前有研究也曾發(fā)現(xiàn),Nrf2/ARE通路的激活與細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)[18]。人類絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞在10%氧濃度低氧條件下24 h,Nrf2 mRNA表達(dá)顯著升高;在3%氧濃度低氧條件下,Nrf2 mRNA表達(dá)則顯著降低[6]。PC12細(xì)胞在適度低氧(10% O2)24 h后,細(xì)胞數(shù)目升高,總抗氧化能力有上升趨勢;而嚴(yán)重低氧(0.3% O2)24 h后,細(xì)胞數(shù)目顯著降低,總抗氧化能力明顯降低[19]。此外,實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),不同細(xì)胞對(duì)不同氧濃度低氧的反應(yīng)不同,其調(diào)控的機(jī)制可能也不盡相同,有待進(jìn)一步研究。

    綜上所述,不同氧濃度下C2C12細(xì)胞中Nrf2介導(dǎo)的抗氧化系統(tǒng)對(duì)H2O2刺激反應(yīng)不同,12 h的12% O2濃度可促進(jìn)C2C12細(xì)胞Nrf2的抗氧化作用,而5% O2濃度的嚴(yán)重低氧則作用相反。

    猜你喜歡
    骨骼肌低氧抗氧化
    6000倍抗氧化能力,“完爆”維C!昶科將天然蝦青素研發(fā)到極致
    間歇性低氧干預(yù)對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響
    Wnt/β-catenin信號(hào)通路在低氧促進(jìn)hBMSCs體外增殖中的作用
    8-羥鳥嘌呤可促進(jìn)小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞的增殖和分化
    骨骼肌細(xì)胞自噬介導(dǎo)的耐力運(yùn)動(dòng)應(yīng)激與適應(yīng)
    骨骼肌缺血再灌注損傷的機(jī)制及防治進(jìn)展
    豬皮膠原蛋白抗氧化肽的分離純化及體外抗氧化活性研究
    乳清低聚肽的制備及其抗氧化活性
    綠茶抗氧化肽的分離純化與抗氧化活性研究
    裸鼴鼠不同組織中低氧相關(guān)基因的表達(dá)
    中文字幕最新亚洲高清| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲熟妇熟女久久| 免费在线观看完整版高清| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 成人国产一区最新在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 不卡一级毛片| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久精品国产综合久久久| 91老司机精品| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲avbb在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 两人在一起打扑克的视频| 两人在一起打扑克的视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 桃色一区二区三区在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 99久久精品国产亚洲精品| 国内精品久久久久久久电影| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美日韩福利视频一区二区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 后天国语完整版免费观看| 久久香蕉激情| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲全国av大片| ponron亚洲| 亚洲美女黄片视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲成国产人片在线观看| 色av中文字幕| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| √禁漫天堂资源中文www| 91大片在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 91在线观看av| 国产精品98久久久久久宅男小说| 不卡一级毛片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 亚洲成人久久爱视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 首页视频小说图片口味搜索| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产视频内射| aaaaa片日本免费| 精品午夜福利视频在线观看一区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 午夜成年电影在线免费观看| 国产av一区在线观看免费| www.精华液| 亚洲人成网站高清观看| 看片在线看免费视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 成人永久免费在线观看视频| 曰老女人黄片| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 一级作爱视频免费观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产国语露脸激情在线看| 热99re8久久精品国产| 午夜激情福利司机影院| 精品欧美一区二区三区在线| 成人18禁在线播放| 制服人妻中文乱码| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 91av网站免费观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 看免费av毛片| 搡老熟女国产l中国老女人| 中文字幕精品免费在线观看视频| 岛国在线观看网站| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日本免费一区二区三区高清不卡| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久狼人影院| 在线免费观看的www视频| www.999成人在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日韩欧美免费精品| 两性夫妻黄色片| 老司机福利观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 黑人操中国人逼视频| 婷婷精品国产亚洲av| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美又色又爽又黄视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产精品久久久久久人妻精品电影| 制服诱惑二区| 欧美一级毛片孕妇| 中文在线观看免费www的网站 | 波多野结衣巨乳人妻| 国产精品99久久99久久久不卡| www.自偷自拍.com| 一a级毛片在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 精品免费久久久久久久清纯| 国产成人影院久久av| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品久久久久久久久久久久久 | 少妇粗大呻吟视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲激情在线av| 99国产综合亚洲精品| 桃红色精品国产亚洲av| 在线看三级毛片| 亚洲在线自拍视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 大型黄色视频在线免费观看| 国产主播在线观看一区二区| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲五月天丁香| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲男人的天堂狠狠| 欧美日本视频| 久9热在线精品视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 操出白浆在线播放| 伦理电影免费视频| 国产熟女xx| 国产午夜福利久久久久久| 无遮挡黄片免费观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美激情高清一区二区三区| 制服诱惑二区| 老司机福利观看| 丁香六月欧美| 在线观看66精品国产| 丁香欧美五月| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 99久久无色码亚洲精品果冻| 1024手机看黄色片| 99热这里只有精品一区 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 午夜福利欧美成人| 在线天堂中文资源库| 国产成人精品久久二区二区91| 免费在线观看黄色视频的| 国产高清videossex| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲五月色婷婷综合| 自线自在国产av| 欧美成人午夜精品| www.精华液| 国产精品久久久久久精品电影 | 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看 | 欧美又色又爽又黄视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 激情在线观看视频在线高清| 欧美日韩精品网址| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲第一青青草原| 亚洲黑人精品在线| 日韩有码中文字幕| 国产精品 欧美亚洲| av电影中文网址| 国产一区二区三区视频了| 99re在线观看精品视频| 亚洲精品美女久久av网站| 久久亚洲真实| e午夜精品久久久久久久| 怎么达到女性高潮| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产真人三级小视频在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲第一av免费看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品久久久久久久末码| 成年免费大片在线观看| 久久青草综合色| 亚洲专区字幕在线| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产精品影院久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| а√天堂www在线а√下载| 操出白浆在线播放| 男女那种视频在线观看| 欧美日韩精品网址| 精品久久久久久,| 亚洲av电影在线进入| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品一区二区免费欧美| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 嫩草影视91久久| 88av欧美| 这个男人来自地球电影免费观看| 十分钟在线观看高清视频www| 久久青草综合色| 久久精品91蜜桃| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日本a在线网址| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 两个人免费观看高清视频| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲人成电影免费在线| 九色国产91popny在线| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产午夜精品久久久久久| 大香蕉久久成人网| 人妻久久中文字幕网| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美日韩黄片免| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久精品国产亚洲av高清一级| 老司机午夜十八禁免费视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲熟女毛片儿| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 精品欧美一区二区三区在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美三级亚洲精品| 午夜免费观看网址| 黄片大片在线免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲男人天堂网一区| 成年人黄色毛片网站| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲精品国产区一区二| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲人成电影免费在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品久久久久久久毛片微露脸| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产免费男女视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 18美女黄网站色大片免费观看| 看黄色毛片网站| 久久精品国产清高在天天线| 美女扒开内裤让男人捅视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 在线看三级毛片| 久久精品91蜜桃| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 天堂动漫精品| 久久国产精品人妻蜜桃| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产97色在线日韩免费| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 两性夫妻黄色片| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 一级毛片高清免费大全| 亚洲熟妇熟女久久| 午夜免费鲁丝| 亚洲男人天堂网一区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 此物有八面人人有两片| 久9热在线精品视频| 黄色成人免费大全| 亚洲黑人精品在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美日韩乱码在线| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品一区二区三区四区久久 | 午夜免费成人在线视频| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久精品成人免费网站| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 男女那种视频在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 美女免费视频网站| 久久草成人影院| 亚洲 国产 在线| 久久性视频一级片| 女同久久另类99精品国产91| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 超碰成人久久| 一夜夜www| 在线国产一区二区在线| 久久久国产精品麻豆| 色av中文字幕| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 日韩免费av在线播放| 91国产中文字幕| 欧美日韩精品网址| 大型av网站在线播放| netflix在线观看网站| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产av一区在线观看免费| 欧美在线黄色| 久久草成人影院| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一夜夜www| 欧美乱码精品一区二区三区| 免费高清在线观看日韩| 男男h啪啪无遮挡| 欧美黑人欧美精品刺激| 91老司机精品| 波多野结衣高清作品| 国产av一区在线观看免费| 久久狼人影院| 欧美中文综合在线视频| 久热这里只有精品99| 精品日产1卡2卡| 亚洲美女黄片视频| 国产成人欧美在线观看| 丁香欧美五月| 午夜福利成人在线免费观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 精品午夜福利视频在线观看一区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 在线看三级毛片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 麻豆成人午夜福利视频| ponron亚洲| 久9热在线精品视频| 欧美三级亚洲精品| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产野战对白在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| www.自偷自拍.com| xxxwww97欧美| 精品久久久久久,| 夜夜夜夜夜久久久久| 韩国精品一区二区三区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人国产一区最新在线观看| 99热6这里只有精品| 精品电影一区二区在线| 亚洲成人久久爱视频| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精华一区二区三区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 最近在线观看免费完整版| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 美女免费视频网站| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产高清激情床上av| 国产激情久久老熟女| av在线播放免费不卡| 人妻久久中文字幕网| 国产真人三级小视频在线观看| 久久草成人影院| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 男人舔奶头视频| 国产麻豆成人av免费视频| 18禁观看日本| xxxwww97欧美| 亚洲第一av免费看| √禁漫天堂资源中文www| 一区二区日韩欧美中文字幕| 制服人妻中文乱码| 国产欧美日韩精品亚洲av| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久 成人 亚洲| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲午夜理论影院| 午夜亚洲福利在线播放| 曰老女人黄片| 又大又爽又粗| 老汉色∧v一级毛片| 欧美色视频一区免费| 12—13女人毛片做爰片一| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 女警被强在线播放| 欧美日本亚洲视频在线播放| 色综合欧美亚洲国产小说| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产成人系列免费观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 一a级毛片在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 国产一卡二卡三卡精品| 国产99久久九九免费精品| 美女高潮到喷水免费观看| 看黄色毛片网站| 成在线人永久免费视频| 757午夜福利合集在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久香蕉精品热| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩免费av在线播放| а√天堂www在线а√下载| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 免费人成视频x8x8入口观看| 熟女电影av网| 国产真实乱freesex| 精品电影一区二区在线| 欧美黄色淫秽网站| 在线观看一区二区三区| 久久人妻av系列| 亚洲男人天堂网一区| 脱女人内裤的视频| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲专区字幕在线| 免费搜索国产男女视频| 欧美三级亚洲精品| 无人区码免费观看不卡| 亚洲自拍偷在线| 国产亚洲欧美精品永久| 免费av毛片视频| 91老司机精品| a级毛片a级免费在线| 一本大道久久a久久精品| а√天堂www在线а√下载| 亚洲专区字幕在线| 亚洲精华国产精华精| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲av电影不卡..在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲人成网站高清观看| a级毛片a级免费在线| 又黄又粗又硬又大视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 国产av一区二区精品久久| 最新美女视频免费是黄的| 免费高清视频大片| 国产亚洲精品av在线| 男女之事视频高清在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 久99久视频精品免费| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 岛国视频午夜一区免费看| 久久 成人 亚洲| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 黄色成人免费大全| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产片内射在线| 天堂动漫精品| 香蕉久久夜色| 免费看十八禁软件| 男人舔女人的私密视频| 人妻久久中文字幕网| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美日韩精品网址| 好男人在线观看高清免费视频 | 在线播放国产精品三级| 久久香蕉国产精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 男人舔女人的私密视频| 色av中文字幕| 免费高清视频大片| 一本大道久久a久久精品| 麻豆av在线久日| 日韩欧美 国产精品| 欧美色欧美亚洲另类二区| 一区福利在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 久久中文字幕人妻熟女| 又紧又爽又黄一区二区| 99久久国产精品久久久| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 亚洲专区字幕在线| 俺也久久电影网| 成人国产一区最新在线观看| 99热这里只有精品一区 | 日韩欧美 国产精品| 最新在线观看一区二区三区| 两个人免费观看高清视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 一夜夜www| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| x7x7x7水蜜桃| 在线永久观看黄色视频| 看黄色毛片网站| 亚洲国产精品成人综合色| 身体一侧抽搐| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 香蕉av资源在线| 精品高清国产在线一区| 欧美日韩乱码在线| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日本a在线网址| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美激情 高清一区二区三区| 午夜福利成人在线免费观看| 自线自在国产av| 在线观看日韩欧美| 日本黄色视频三级网站网址| cao死你这个sao货| 欧美激情久久久久久爽电影| 日日干狠狠操夜夜爽| 香蕉久久夜色| 欧美性猛交黑人性爽| 一级毛片高清免费大全| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 麻豆一二三区av精品| 亚洲无线在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| or卡值多少钱| 欧美乱码精品一区二区三区| 99国产综合亚洲精品| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产成人精品无人区| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 最近最新免费中文字幕在线| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久久久九九精品影院| 亚洲三区欧美一区| 欧美色视频一区免费| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 免费在线观看亚洲国产| 久久久国产欧美日韩av| 人妻久久中文字幕网| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产人伦9x9x在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 在线观看www视频免费| xxxwww97欧美| 岛国视频午夜一区免费看| 又黄又粗又硬又大视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久青草综合色| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 日韩欧美国产一区二区入口| 国产精品永久免费网站| 成在线人永久免费视频| 久久精品91蜜桃| 成年女人毛片免费观看观看9| www.999成人在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| av福利片在线| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲av片天天在线观看| 十八禁人妻一区二区| 精品久久久久久,| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲av熟女| 大型黄色视频在线免费观看| 伦理电影免费视频| 日韩欧美免费精品| 免费在线观看影片大全网站| 国产亚洲欧美精品永久| 久久久久久大精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品久久蜜臀av无| 国产精品九九99| 欧美激情久久久久久爽电影| 99久久国产精品久久久| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久久国产成人免费| 欧美黑人精品巨大| 韩国av一区二区三区四区| 成年人黄色毛片网站| 久久狼人影院| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 中文字幕久久专区| 欧美黑人巨大hd| 亚洲精品一区av在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 午夜福利在线在线| 我的亚洲天堂| 久久亚洲真实| 免费看a级黄色片| 怎么达到女性高潮| 日本 欧美在线| 国产野战对白在线观看| 免费在线观看日本一区| 国产精品久久视频播放| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 一级毛片精品| 久久久久九九精品影院| 99re在线观看精品视频| 亚洲午夜理论影院| 成年人黄色毛片网站| 国产高清激情床上av| 国产精品亚洲美女久久久| 在线观看日韩欧美| 午夜免费观看网址| www日本在线高清视频| 很黄的视频免费| 十八禁网站免费在线| 婷婷精品国产亚洲av| 国产单亲对白刺激| 国产亚洲欧美在线一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影|