反復(fù)上呼吸道感染患兒補充維生素D后LL-37、IL-10含量變化

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000)

反復(fù)上呼吸道感染是小兒常見病及多發(fā)病，具有反復(fù)發(fā)作的特點，嚴(yán)重影響兒童健康，并給家庭帶來不小的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。以往研究[1]顯示，維生素D缺乏在該病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，補充維生素D可以減輕反復(fù)上呼吸道感染的疾病負(fù)擔(dān)[2]。維生素D是一種脂溶性維生素，幾乎所有的免疫細(xì)胞上都有維生素D受體，通過與受體結(jié)合，維生素D可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。Hcap18是LL-37的前體肽，Hcap18相關(guān)基因的啟動區(qū)域有多個維生素D受體反應(yīng)原件(vitamin D receptor element，VDRE)，維生素D與受體結(jié)合形成的二聚體，通過VDRE可以上調(diào)LL-37的表達(dá)[3]。而LL-37具有抗感染作用，在反復(fù)上呼吸道感染患兒中含量下降，與其發(fā)病有關(guān)[4]?，F(xiàn)代免疫學(xué)研究顯示T淋巴細(xì)胞在反復(fù)上呼吸道感染的發(fā)病及進(jìn)展中起到了關(guān)鍵作用[5]，T細(xì)胞可分為Th1、Th2兩類。IL-10是Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有抗炎作用。體外小鼠實驗中，燙傷后小鼠補充維生素D，可以促進(jìn)抗炎因子IL-10的產(chǎn)生及釋放[6]。同樣，體外試驗中，將LL-37加入活化的胎盤衍生的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞中，可以增強T細(xì)胞增殖，從而刺激IL-10等炎性因子的釋放[7]。因而維生素D的免疫調(diào)節(jié)作用有可能與LL-37、IL-10有關(guān)，課題組為了尋找這其中的關(guān)聯(lián)特設(shè)計本研究。

1 對象與方法

1.1 對象

1.1.1 入組標(biāo)準(zhǔn)

(1)1年以內(nèi)發(fā)生上呼吸道感染次數(shù)超過正常范圍，即0～2歲大于7次/年、2～5歲大于6次/年、5～14歲大于5次/年[8]。(2)不存在免疫缺陷、耳部及鼻部發(fā)育異常、呼吸道慢性疾病等基礎(chǔ)疾病。

1.1.2 分組

2017年5月至11月到河北大學(xué)附屬醫(yī)院門診就診反復(fù)上呼吸道感染并存在維生素D缺乏患兒中，隨機抽樣選擇64例患兒，隨機分成2組，2組在年齡、性別等方面構(gòu)成比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組給予常規(guī)聯(lián)合維生素D治療，對照組給予常規(guī)聯(lián)合感官上相似的安慰劑治療，隨訪12個月，檢測治療前基線含量和治療12個月后血漿25-羥維生素D3含量、血清IL-10含量及痰上清LL-37的變化。僅有61例完成了隨訪，實驗組失訪1例，對照組失訪2例。隨訪期間，間隔3個月左右隨訪1次，定期檢測患兒25-羥維生素D3含量。

1.2 方法

1.2.1 治療方案

維生素D缺乏的診斷標(biāo)準(zhǔn)及治療方案參考《兒童微量營養(yǎng)素缺乏防治建議》[9]。反復(fù)上呼吸道感染診治原則參考中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組于2008年制定的《反復(fù)呼吸道感染的臨床概念和處理原則》[10]。

1.2.2 標(biāo)本采集

血標(biāo)本的采集及保存：在空腹?fàn)顟B(tài)下采靜脈血，標(biāo)本保存于普通生化管(紅帽或黃帽管)中，血清IL-10標(biāo)本采用-80 ℃保存，25-羥維生素D3標(biāo)本避光保存。

痰上清的采集及制作：清晨患兒進(jìn)食或吃奶前，用無菌生理鹽水清潔口腔后，用4%高滲氯化鈉溶液霧化吸入15 min后叩擊患兒肺部，然后負(fù)壓吸引下于聲門下部吸取痰標(biāo)本，用一次性無菌小瓶留取痰液。操作使用的負(fù)壓吸引器、一次性吸痰管、消毒等物品均一致。痰液標(biāo)本保存于4 ℃冰箱或保溫桶，在1 h內(nèi)處理，將培養(yǎng)皿中的痰液肉眼去除唾液及雜物后放置于振蕩器上混勻后取1 mL于刻度離心管中，加入4倍質(zhì)量的0.1%二硫蘇糖醇(DTT)，置于37 ℃水浴箱5 min，吹打致黏液完全溶解，2 500 r/min離心10 min，上清液置于-80 ℃保存。

1.2.3 試驗方法

25-羥維生素D3的檢測：血清中25-羥維生素D3標(biāo)本離心(3 500 r/min，10 min)后，取上清液置于干凈的離心管中，低溫運輸和貯存(樣本穩(wěn)定性：室溫1 d，4 ℃冷藏2 d，-80 ℃冷凍30 d)，送到北京和合醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)股份有限公司進(jìn)行檢測，采用液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。

LL-37和IL-10：采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測外周血血清抗菌肽LL-37，試劑盒采用進(jìn)口LL-37專用試劑盒(批號3213K21，Hycult Biotech，荷蘭)，按試劑盒說明書要求使用聚丙烯微量離心管，EDTA抗凝劑抗凝，皆-80 ℃超低溫冰箱保存。IL-10的ELISA法檢測試劑盒購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

王老常說：我就是對農(nóng)牧業(yè)感興趣。他理解和尊重知識分子，自己也很注意學(xué)習(xí)，在這方面的知識和見解，頗具專家水平。走進(jìn)王部長的書房，他收藏的有關(guān)農(nóng)牧業(yè)政策、技術(shù)方面的書籍，滿滿幾大柜。1971年他贈我十幾本大學(xué)程度的專業(yè)書，有些書上有很多他親筆勾畫的批注和校釋。

2 結(jié)果

2.1 治療前情況

開始治療前實驗組與對照組比較，25-羥維生素D3、LL-37、IL-10含量及呼吸道感染次數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 實驗組、對照組治療前情況比較

2.2 治療1年后情況

治療1年后，實驗組與對照組比較，25-羥維生素D3、LL-37、IL-10含量均顯著增高，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；呼吸道感染次數(shù)顯著下降，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 實驗組、對照組治療1年后情況比較

2.3 實驗組治療前后情況

與治療前相比，實驗組治療1年后25-羥維生素D3、LL-37及IL-10均顯著增高，呼吸道感染次數(shù)顯著下降，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

表3 實驗組治療1年前后情況比較

2.4 實驗組25-羥維生素D3、LL-37及IL-10之間的相關(guān)性

血漿25-羥維生素D3含量與痰上清LL-37含量呈正相關(guān)(r=0.582，P<0.05)(圖1)；血漿25-羥維生素D3含量與IL-10含量呈正相關(guān)(r=0.415，P<0.05)(圖2)；痰上清LL-37含量與血清IL-10含量呈正相關(guān)(r=0.614，P<0.05)(圖3)。

圖1 血漿25-羥維生素D3含量與痰上清LL-37含量呈正相關(guān)

圖2 血漿25-羥維生素D3含量與血清IL-10含量呈正相關(guān)

圖3 血清IL-10含量與痰上清LL-37含量呈正相關(guān)

3 討論

反復(fù)呼吸道感染是兒科的常見疾病，特別是反復(fù)上呼吸道感染，具有反復(fù)發(fā)作的特點，耗費看護者較多精力和財力。該病與環(huán)境、免疫、營養(yǎng)、感染等多種因素有關(guān)，維生素D缺乏是其中一個發(fā)病因素。維生素D是一類物質(zhì)的總稱，主要包括維生素D2和維生素D3，以維生素D3為主要形式。維生素D在肝臟進(jìn)行第一次羥化，轉(zhuǎn)化為25-羥維生素D，這是維生素D的主要儲備形式，在血液循環(huán)中較為穩(wěn)定。之后在腎臟進(jìn)行第二次羥化，形成1，25-羥維生素D，這是維生素D發(fā)揮活性的主要形式。因此，一般通過檢測血漿25-羥維生素D3含量來了解人體內(nèi)維生素D的含量。

LL-37是一種重要的抗感染因子，IL-10是常見的抗炎因子，在感染性疾病中均有重要作用。上述研究顯示維生素D與兩者均存在密切關(guān)系，而反復(fù)上呼吸道感染作為小兒常見的感染性疾病，與維生素D、LL-37、IL-10的關(guān)系尚不明確。因此課題組對此開展了研究。

本研究設(shè)置實驗組與對照組，實驗組在常規(guī)治療上加入補充維生素D方案，對照組僅給予常規(guī)治療加安慰劑。兩組的基線情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，治療隨訪1年后比較2組25-羥維生素D3含量、血清IL-10含量及痰上清LL-37含量，實驗組均較對照組明顯增高；而上呼吸道感染發(fā)生次數(shù)，實驗組較對照組明顯減少。這說明補充維生素D有助于改善反復(fù)上呼吸道感染病情，與之前的研究結(jié)果相同[18]。而且2組LL-37及IL-10差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明補充維生素D后可以促進(jìn)LL-37和IL-10的產(chǎn)生。由于這2種物質(zhì)均具有抗感染作用，因此，推測維生素D對呼吸道感染的治療作用可能與他們有關(guān)，這在以往的研究中涉及較少。

實驗組治療隨訪1年后發(fā)現(xiàn)，25-羥維生素D3含量、血清IL-10含量及痰上清LL-37含量均有顯著增加，上呼吸道感染次數(shù)顯著減少。進(jìn)一步進(jìn)行維生素D、LL-37和IL-10的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)三者互相之間均存在正相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)與國內(nèi)外他人研究[16-17]也有共同之處。而且這些結(jié)果均與前期背景調(diào)查相一致。根據(jù)目前試驗結(jié)果，考慮維生素D對反復(fù)上呼吸道感染的治療作用，與維生素D促進(jìn)抗感染因子LL-37、IL-10的產(chǎn)生有關(guān)。但翻閱文獻(xiàn)，目前關(guān)于LL-37與IL-10的相關(guān)基礎(chǔ)研究較少，這也是今后研究的一個方向。