內(nèi)皮細胞敲除TFPI對小鼠急性肺損傷的影響

施 夢 苗 峰 陳 佶 龐烈文 黃杰春 王宜青 陳曉峰

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種重要并發(fā)癥，異常激活炎性細胞和凝血系統(tǒng)是急性肺損傷的關(guān)鍵致病因素[1]。急性肺損傷患者尸體解剖的研究發(fā)現(xiàn)，損傷的肺部微血管中存在廣泛的微血栓[2]。急性呼吸系統(tǒng)感染的早期，肺組織局部凝血功能的激活可以限制微生物的浸潤及在局部消滅病原微生物。研究也表明，凝血功能增強可以在肺損傷病理變化和肺功能損傷過程中起重要作用[3]。因此，肺組織局部凝血狀態(tài)改變可能是急性肺損傷患者藥物治療的潛在靶點。組織因子(tissue factor,TF)是凝血系統(tǒng)的主要分子，在血栓性疾病中起關(guān)鍵作用。肺損傷研究發(fā)現(xiàn)TF引起的凝血系統(tǒng)激活，導(dǎo)致肺部炎癥加重[4]。組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)是一種天然的抗凝血物質(zhì)，可以抑制凝血蛋白酶復(fù)合物TF/FVⅡa/FXa。TFPI主要產(chǎn)生于內(nèi)皮細胞，凝血酶刺激細胞時釋放入血[5]。

急性肺損傷治療手段有限，缺乏有效的藥物，治療中較棘手。膿毒癥引起的急性肺損傷動物模型發(fā)現(xiàn)，肺組織中TF表達上調(diào)和炎性細胞浸潤[6]。TFPI可以降低膿毒癥肺損傷動物的死亡率[7]。然而，臨床研究中發(fā)現(xiàn)TFPI只改善一部分肺損傷患者的肺功能，治療效果有限[8]。復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院代謝疾病研究所馬端教授實驗團隊制備了內(nèi)皮細胞敲除TFPI基因的小鼠，肺損傷后血管內(nèi)皮通透性增加，腫瘤的肺部轉(zhuǎn)移增多[9]。內(nèi)毒素可以誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)生，是制備急性肺損傷動物模型的常用方法[10]。肺血管內(nèi)皮細胞敲除TFPI后使急性肺損傷的血管通透性增加及肺損傷加重，本研究旨在探索其發(fā)病機制。

材料與方法

1.實驗動物:成年C57BL/6野生型小鼠由上海中科院斯萊克實驗動物中心提供；血管內(nèi)皮細胞特異性敲除TFPI的純合及雜合小鼠由復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院代謝疾病研究所馬端教授實驗室提供。

2.實驗方法:(1)內(nèi)毒素氣道滴注建立小鼠急性肺損傷模型:所有實驗過程都遵循復(fù)旦大學(xué)實驗動物使用條例。TFPI基因敲除鼠是C57BL/6遺傳背景小鼠，提鼠DNA，用TFPI和TEK基因引物進行PCR反應(yīng)，再進行瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)電泳結(jié)果分成野生型、TFPIflox/flox和TFPIflox/flox/Tek-Cre小鼠。飼養(yǎng)至8～12周，體重約25g；氣管內(nèi)滴注內(nèi)毒素建立急性肺損傷小鼠模型。各組小鼠，取血漿行凝血功能，TF和TFPI濃度檢測。用0.5ml預(yù)冷的PBS液進行左肺肺泡灌洗，離心收集細胞沉淀行炎性細胞計數(shù)及分類，上清液保存在-80℃，后行蛋白、炎性因子、TFPI和TF濃度測定。取右肺中葉，固定行HE病理檢查和免疫組化檢測。取右肺下葉計算濕干重比。取右肺上葉提取蛋白及RNA，進行檢測。(2)全血的收集和血漿的制備：全血與枸櫞酸鈉溶液按9∶1混合，制備去除血小板的新鮮血漿。留取上清液，分裝保存至-80℃。整個過程要在取全血后2h內(nèi)完成[11]。(3)血漿凝血功能的檢測:血漿上清液用法國的Stago半自動血凝儀和西門子的診斷試劑進行APTT(activated partial thromboplastin time,APTT)，PT (prothrombin time,PT)和TT(thrombin time,TT)時間的測定。(4)肺干濕重比:肺干濕重比=(肺總濕重-錫箔紙)/(肺總干重-錫箔紙)[12]。(5)肺泡灌洗液中炎性細胞計數(shù)：肺泡灌洗液收集后，在4℃離心機中400×g離心10min，取上清液分裝后-80℃保存。用100μl PBS液重懸細胞沉淀，用小動物血細胞分析儀檢測炎性細胞數(shù)量。(6)肺損傷的形態(tài)學(xué)評分：取右肺中葉固定和石蠟包埋，制成HE病理切片，用半定量方法評價肺損傷程度。每一個樣本的病理評分都用5個視野評分的平均值來表示。(7)用ELISA的方法評估小鼠TFPI、TF及炎性因子的含量：使用購自美國R&D公司的ELISA試劑盒，檢測小鼠肺泡灌洗液中的炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。檢測小鼠血漿、肺泡灌洗液、肺組織中TF和TFPI的含量。(8)檢測伊文思藍滲出率：定量檢測白蛋白與伊文思藍結(jié)合物含量是一種常用于檢測組織內(nèi)血管屏障及單層內(nèi)皮細胞完整性的方法。處死小鼠前2h，尾靜脈給予伊文思藍溶液(20mg/kg)，左肺灌洗留取肺泡灌洗液，將灌洗后的左肺浸入到甲酰胺溶液中，在65℃溫箱中孵育72h后，收集甲酰胺孵育液，將左肺組織取出后烘干，稱重記錄干肺重。測量630nm含有伊文思藍的肺泡灌洗液和甲酰胺溶液的吸光度，計算伊文思藍的含量[12]。(9)免疫組化檢測:石蠟切片進行脫蠟及脫水，用相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，相應(yīng)二抗3℃孵育30min，制備免疫組化切片標本。(10)組織蛋白的提取和Western blot法檢測:肺組織標本留取后立即放入液氮內(nèi)凍存，然后保存至-80℃冰箱中。肺組織標本塊用蛋白裂解液勻漿、離心、留取上清液。用10%及12%的SDS/PAGE膠跑電泳，用Western blot法鑒定各組小鼠單位肺組織中MPO、NF-κB、VCAM-1和TFPI含量。

結(jié) 果

1.內(nèi)皮細胞TFPI敲除小鼠的培育及鑒定:用PCR及瓊脂糖凝膠電泳方法鑒定各小鼠的基因型，根據(jù)基因型分組，每組6只小鼠。用Western blot法和ELISA方法評價TFPI敲除小鼠的敲除效率。Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)TFPI敲除小鼠肺組織TFPI蛋白含量只有野生小鼠的28%(P=0.003)。ElISA檢測發(fā)現(xiàn)TFPI敲除小鼠肺組織TFPI蛋白含量只有野生小鼠的13.9%(P=0.000)；TFPI敲除小鼠肺泡灌洗液中TFPI蛋白含量只有野生小鼠的29%(P=0.000)；TFPI敲除小鼠血漿中TFPI蛋白含量比野生小鼠血漿中的含量低91.8%(P=0.000),詳見圖1。

圖1 內(nèi)皮細胞TFPI敲除鼠的鑒定A.用瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型；B.敲除鼠肺組織中TFPI蛋白的表達明顯降低；C.用ELISA方法測定TFPI敲除鼠血漿、肺組織及肺泡灌洗液中TFPI的蛋白含量明顯降低；**P<0.01, ***P=0.000

2.TFPI敲除鼠急性肺損傷后凝血功能和TFPI濃度的變化:用半自動血凝儀檢測發(fā)現(xiàn)3種基因型小鼠的凝血功能差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。用LPS處理過的小鼠，其凝血功能各參數(shù)也沒有明顯變化。急性肺損傷后48h，TFPI基因敲除小鼠(502±63pg/ml)和野生小鼠(1638±89pg/ml)肺泡灌洗液中TFPI含量和對照組(基因敲除小鼠：143±7pg/ml，野生型小鼠：501±26pg/ml)比較都明顯升高(P<0.05)。急性肺損傷后基因敲除小鼠(584±188pg/mg)和野生小鼠(2890±280pg/mg)肺組織中TFPI的含量與對照組野生型小鼠(3872±566pg/mg)比較明顯降低(P<0.05)。肺泡灌洗液TFPI濃度的增加是由于急性肺損傷后肺泡灌洗液中的蛋白濃度增高所致。但是，急性肺損傷后小鼠血漿中TFPI濃度與對照組小鼠比較變化不大(P>0.05)，詳見圖2。

圖2 各組小鼠凝血功能和各組織中TFPI含量的變化A.各組小鼠凝血功能檢測指標的變化;B.血漿中TFPI蛋白含量的變化;C.肺組織中TFPI蛋白含量的變化;D.肺泡灌洗液中TFPI的變化；**P<0.01,***P=0.000

3.敲除TFPI后LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷病理改變加重:應(yīng)用半定量評分方法評價肺損傷的嚴重性(圖3B)。內(nèi)皮細胞TFPI敲除小鼠急性肺損傷病理變化加重(P<0.01)。和野生型對照組小鼠比較，野生型小鼠及TFPI基因敲除小鼠急性肺損傷后肺組織炎性反應(yīng)明顯增加(P=0.000)，詳見圖3。

圖3 肺損傷后各組小鼠病理改變A.各組小鼠肺損傷后病理損傷的示意圖(HE，×100);B.各組小鼠肺損傷評分的變化；**P<0.01,***P=0.000

4.敲除TFPI后急性肺損傷的血管滲透性增加:肺濕干重比表示肺水腫程度。LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中蛋白濃度明顯增加。LPS也可以引起白蛋白結(jié)合的伊文思藍從血管內(nèi)滲出到肺間質(zhì)中，進一步證實了LPS對血管內(nèi)皮屏障的影響。野生型對照組小鼠肺泡灌洗液中伊文思藍濃度為3.89±0.70μg/ml，組織中伊文思藍濃度為1.70±0.90μg/mg,急性肺損傷野生型小鼠肺泡灌洗液伊文思藍濃度上升至16.20±0.80μg/ml，肺組織中伊文思藍濃度為4.07±0.65μg/mg。經(jīng)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的基因敲除小鼠，其肺濕干重比及肺泡灌洗液蛋白濃度都高于野生型急性肺損傷小鼠；同時基因敲除小鼠急性肺損傷后，其肺泡灌洗液和肺組織中伊文思藍濃度也明顯增加,詳見圖4。

圖4 內(nèi)皮細胞敲除TFPI可以引起肺損傷血管滲透性增加A.急性肺損傷后濕干重比；B.肺泡灌洗液中蛋白含量；C.肺泡灌洗液中伊文思藍含量；D.肺組織中伊文思藍含量;**P<0.01, ***P=0.000

5.敲除TFPI后急性肺損傷中炎性細胞浸潤及炎性反應(yīng)加重：LPS誘導(dǎo)急性肺損傷后肺泡灌洗液中炎性細胞數(shù)量明顯增加。TFPI基因敲除急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中白細胞數(shù)量比野生型急性肺損傷小鼠的炎性細胞高50%。急性肺損傷肺組織中MPO濃度的增加表示中性粒細胞的浸潤及活性增加。組織中MPO含量也可以用免疫組化的方法來確定。筆者用ELISA的方法檢測了小鼠肺組織中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度。TFPI基因敲除小鼠急性肺損傷后肺泡灌洗液和肺組織中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度與野生型小鼠急性肺損傷比較增加更多，詳見圖5。

圖5 內(nèi)皮細胞敲除TFPI可以引起急性肺損傷炎性反應(yīng)增加A.肺泡灌洗液中炎性細胞數(shù)量變化；B、C.用Western blot法檢測肺組織中MPO含量；D.用免疫組化方法檢測肺組織中MPO含量(辣根過氧化物酶法，×100);(E、F、G)用ELISA方法檢測肺泡灌洗液中炎性因子含量變化；*P<0.05, ***P=0.000

6.TFPI敲除鼠急性肺損傷后可以通過NF-κB通路破壞內(nèi)皮細胞屏障:通過進一步探索TFPI基因敲除小鼠急性肺損傷程度加重的機制。筆者檢測了內(nèi)皮細胞炎性損傷的主要信號通路，VCAM-1和NF-κB信號通路。LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠與對照組比較VCAM-1表達明顯增加，而且TFPI基因敲除小鼠急性肺損傷后肺組織中VCAM-1蛋白表達更為明顯。用Western blot法檢測肺組織中p-NF-κB和NF-κB蛋白的表達；LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷后肺組織中p-NF-κB的蛋白表達增加明顯(圖6)。同時也發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞TFPI基因敲除小鼠急性肺損傷肺組織中p-NF-κB表達增加更為明顯。

討 論

LPS可以通過對大血管及小血管內(nèi)皮細胞的破壞而破壞肺部血管內(nèi)皮屏障[13]。LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型是研究急性肺損傷主要的動物模型。血管內(nèi)皮細胞屏障功能失調(diào)可以通過內(nèi)皮細胞滲透性、形態(tài)和LPS誘導(dǎo)的炎性信號及細胞來評價。

急性肺損傷的患者和動物模型中都發(fā)現(xiàn)了體內(nèi)凝血功能和纖溶功能的異常，這些異常導(dǎo)致肺組織炎性反應(yīng)加重。急性肺損傷后，用霧化抗凝藥物可以減輕肺部的炎性反應(yīng)[14]。凝血功能可能是急性肺損傷新的治療靶點[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)40%的急性肺損傷患者伴有凝血功能異常和彌散性血管內(nèi)凝血[15]。

圖6 內(nèi)皮細胞特異性敲除TFPI可以通過NF-κB途徑破壞內(nèi)皮細胞間隙A.用Western blot法檢測各組肺組織中VCAM-1及p-NF-κB蛋白含量；B.TFPI敲除后肺組織中VCAM-1含量增加；C.TFPI敲除后肺組織中p-NF-κB蛋白表達增加；**P<0.01,***P=0.000

本研究發(fā)現(xiàn)，通過氣管內(nèi)滴注LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的凝血功能與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，同時血漿中TFPI濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是肺組織中TFPI表達明顯減少。有研究認為，由于TF-VⅡ復(fù)合物可以激活肺組織的凝血，導(dǎo)致血栓和纖維素形成增加[16]。TFPI蛋白分子通過蛋白聚糖結(jié)合在內(nèi)皮細胞上，調(diào)節(jié)TF的表達和活性，血管內(nèi)皮細胞是TFPI的主要來源細胞[17]。

本研究用內(nèi)皮細胞TFPI基因敲除小鼠，探究內(nèi)皮細胞中TFPI對急性肺損傷的影響。內(nèi)皮細胞中TFPI基因敲除后，小鼠血漿及肺組織中TFPI表達明顯下降，急性肺損傷后，血管滲透性增加更明顯，損傷更嚴重。血管滲透性是肺損傷急性階段的特征，內(nèi)皮細胞的激活可以引起黏附分子VCAM-1的表達。研究表明，LPS刺激后內(nèi)皮細胞和氣道平滑肌細胞表達VCAM-1[18,19]。本研究表明，小鼠急性肺損傷后VCAM-1表達明顯增加，TFPI基因敲除小鼠肺損傷后表達更加明顯。NF-κB的激活是調(diào)節(jié)肺組織炎性反應(yīng)的關(guān)鍵。本研究表明， TFPI基因敲除可以增強LPS誘導(dǎo)磷酸化NF-κB蛋白的表達，證明內(nèi)皮細胞TFPI基因敲除可以通過NF-κB的信號通路，來增強LPS誘導(dǎo)的血管滲出和炎癥。通過NF-κB信號激活而調(diào)節(jié)的VCAM-1蛋白的表達增加，VCAM-1是一種促炎癥的轉(zhuǎn)錄因子。

綜上所述，本研究證實了內(nèi)皮細胞敲除TFPI基因小鼠急性肺損傷后通過激活NF-κB信號通路促進肺組織內(nèi)炎性反應(yīng)和血管滲出性增加。