草莓不同生育期根際微生物的動(dòng)態(tài)變化

仝利紅，高 潔，靳永勝 *

(1.北京農(nóng)學(xué)院 a.植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；b.生物科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

根際是植物根系的表面與土壤親密接觸，并相互產(chǎn)生影響，圍繞在根系表面幾毫米的那部分區(qū)域。該區(qū)域微生物種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化會(huì)直接影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，以及對(duì)病蟲(chóng)害不良環(huán)境的抵抗能力[1]。根際微生物的多樣性及其豐富度，是植物的第二大基因庫(kù)，與植物健康聯(lián)系密切。根際微生物是土壤肥力的指標(biāo)之一。有不少研究表明根際微生物受植物類(lèi)型及生長(zhǎng)發(fā)育階段影響顯著，其微生物數(shù)量變化隨植物生長(zhǎng)發(fā)育階段呈現(xiàn)一定的動(dòng)態(tài)變化[2]。

草莓長(zhǎng)期連作會(huì)使土壤養(yǎng)分失調(diào)、微生物區(qū)系失衡、土傳病害增加。有研究表明，草莓土傳病害的發(fā)生與植物根際微生物群體變化有密切關(guān)系[3,4]。研究和掌握不同生育時(shí)期草莓根際微生物群體的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，有助于及時(shí)采取適當(dāng)?shù)霓r(nóng)藝措施防止草莓土傳病害的發(fā)生，促進(jìn)草莓生長(zhǎng)。目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)關(guān)于在草莓不同生育時(shí)期根際微生物動(dòng)態(tài)變化方面的研究。本研究中采用 Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)研究了草莓5個(gè)生育時(shí)期根際微生物區(qū)系的變化規(guī)律，為防治草莓土傳病害，保證土壤生態(tài)環(huán)境的良性循環(huán)提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

土壤樣品在2015年11月-2016年5月采自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)(北京市海淀區(qū)上莊鎮(zhèn))長(zhǎng)期種植草莓‘紅顏’定位試驗(yàn)的溫室大棚內(nèi)。分別在草莓的恢復(fù)生長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期、開(kāi)花和結(jié)果期以及盛果期(S1、S2、S3、S4和S5)在大棚內(nèi)按“S”型挑選9株草莓連根拔起，抖掉根系周?chē)寥篮笱b于滅菌袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。每3株視為1個(gè)重復(fù)，共3個(gè)重復(fù)?；氐綄?shí)驗(yàn)室后，將每個(gè)重復(fù)的根際土用毛刷輕輕分別刷入滅菌袋內(nèi)，然后將3個(gè)重復(fù)土樣混合，對(duì)角線取一半將其作為土壤待測(cè)樣品用于分析。將收集的土樣置于-20 ℃保存，用于高通量測(cè)序分析。CK則在草莓種植前在溫室內(nèi)多點(diǎn)采集土壤表層樣品，進(jìn)行混合后四分法取一半于-20 ℃保存，用于土壤微生物的測(cè)定。土壤pH采用電位法測(cè)定(水土體積比為5∶1)；土壤有機(jī)質(zhì)采用重絡(luò)酸鉀—外加熱法測(cè)定；土壤全氮測(cè)定采用硫酸—高氯酸消煮—?jiǎng)P氏定氮儀法[5]。試驗(yàn)地土壤有機(jī)質(zhì)含量26.54 g/kg，全氮含量1.43 g/kg，pH 為7.3。

1.2 土壤DNA提取

稱(chēng)取0.5 g的土壤使用FastDNA SPIN Kit For Soil(MP Biomedicals，LLC)試劑盒提取基因組DNA，并通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶明亮、完整則可直接用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 MiSeq及數(shù)據(jù)分析

PCR采用 TransGen AP221-02，PCR為20 μL的反應(yīng)體系。5×FastPfu Buffer (4 μL); 2.5 mol/L dNTPs (2 μL); 5 mol/L Forward Primer (0.8 μL); 5 mol/L Reverse Primer (0.8 μL); Template DNA (10 ng); FastPfu Polymerase (0.4 μL)，補(bǔ)ddH2O至 20 μL。

1.3.1 細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增反應(yīng) 用于測(cè)序細(xì)菌的16S rDNA PCR擴(kuò)增引物Prime338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，Prime806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min，27次循環(huán)(變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s)，最后72 ℃ 10 min，10 ℃保存。

1.3.2 真菌18 SrDNA PCR擴(kuò)增反應(yīng) 用于測(cè)序真菌18S rDNA PCR擴(kuò)增引物Prime0817F 5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′，Prime 1196R 5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min，35次循環(huán)(變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s)，最后72 ℃ 10 min，10 ℃保存。

1.3.3 序列分析 利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控后，使用Usearch (http://drive5.com/uparse/)軟件將97%的相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)，在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)葘?duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU123)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%，然后利用mothur (http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)軟件對(duì)Ace、Chao1和Shannon指數(shù)進(jìn)行分析。采用R語(yǔ)言vegan包，vegdist和hclust進(jìn)行距離計(jì)算和聚類(lèi)分析，然后利用R語(yǔ)言進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物學(xué)信息分析

對(duì)6個(gè)土壤樣本的細(xì)菌進(jìn)行測(cè)序后共獲得23.7203萬(wàn)條序列，平均每個(gè)樣本獲得3.953 4萬(wàn)條序列；真菌測(cè)序后共獲得23.84萬(wàn)條序列，平均每個(gè)樣本獲得3.973 3萬(wàn)條序列。使用mothur version v.1.30.1 軟件進(jìn)行指數(shù)分析，用于指數(shù)評(píng)估的OTU相似水平97%。

表1 細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Bacteria and fungi diversity index statistics

由表1可知，細(xì)菌Chao1豐富度指數(shù)表明土壤中細(xì)菌的物種數(shù)量隨草莓生長(zhǎng)發(fā)育的變化而逐漸增多。與對(duì)照相比，土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)表明在S1和S3時(shí)期下降，在S2、S4和S5時(shí)期時(shí)上升。細(xì)菌Ace指數(shù)表明，細(xì)菌群落均勻度隨草莓的生長(zhǎng)發(fā)育逐漸上升。真菌豐富度指數(shù)Chao1表明各生育期土壤真菌群落的物種數(shù)量與對(duì)照樣本相比都有不同程度的增加，尤其在S2時(shí)期達(dá)到了整個(gè)生育期的最大值。真菌Shannon指數(shù)表明，只有S2時(shí)的真菌群落多樣性升高，其他生育期的真菌群落多樣性都有不同程度的下降。草莓大部分時(shí)期的真菌Ace指數(shù)均有不同程度增加，特別是在S2時(shí)Ace指數(shù)達(dá)到了整個(gè)生育期的最大值，這表明在S2時(shí)土壤真菌群落中某些真菌種群發(fā)育較好，在群落中的優(yōu)勢(shì)度上升。

2.2 草莓不同生育期根際土壤細(xì)菌相對(duì)豐度的變化

將草莓 6個(gè)土壤樣品質(zhì)控后序列按97 %相似性進(jìn)行聚類(lèi)，共得到 8 091個(gè) OTUs。統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析表明，6個(gè)土壤樣品中一共檢測(cè)到35個(gè)土壤細(xì)菌門(mén)、82個(gè)綱、158個(gè)目、283個(gè)科、450個(gè)屬、818個(gè)種。在門(mén)水平上，土壤細(xì)菌共分為14個(gè)類(lèi)群，整個(gè)生育期中細(xì)菌相對(duì)豐度較高的有Proteobacteria、Acidobacteria、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)。隨著草莓的生長(zhǎng)發(fā)育，土壤細(xì)菌主要菌群的相對(duì)豐度也發(fā)生了明顯變化。與對(duì)照相比，Proteobacteria的相對(duì)豐度隨著草莓的生長(zhǎng)發(fā)育而逐漸升高，Acidobacteria的相對(duì)豐度隨草莓生育期的變化出現(xiàn)不同程度的下降。

圖1 細(xì)菌綱水平柱狀圖Fig.1 Bacteria level histogram

如圖1所示，6個(gè)樣品中共檢測(cè)到82個(gè)綱。相對(duì)豐度較高的有酸桿菌綱(Acidobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)。與對(duì)照相比，Acidobacteria的相對(duì)豐度隨生育期的變化出現(xiàn)不同程度的下降。但是Gammaproteobacteria的相對(duì)豐度隨生育期的變化出現(xiàn)不同程度的增加，在S3時(shí)期相對(duì)豐度達(dá)到最高為29.5%。Alphaproteobacteria的相對(duì)豐度同樣隨生育期的變化出現(xiàn)不同程度的增加，在S4時(shí)期相對(duì)豐度達(dá)到最高為21.8%。Bacilli的相對(duì)豐度只有在S1時(shí)期顯著增加，相對(duì)豐度達(dá)到17.7%，在其他生育時(shí)期變化不明顯。Betaproteobacteria的相對(duì)豐度只有在S4時(shí)期顯著增加，相對(duì)豐度達(dá)到9.1%，在其他生育時(shí)期變化不明顯。

圖2 細(xì)菌熱圖Fig.2 Bacteria relative abundanceheatmap

由圖2可知，依據(jù)6個(gè)樣品細(xì)菌分布豐度特征，從屬的水平上進(jìn)行聚類(lèi)，分成3類(lèi)：CK聚成一類(lèi)(Gl)；S4和S5聚成一類(lèi)(G2)；S1、S2、S3聚成一類(lèi)(G3)。從這一結(jié)果可以看出各生育時(shí)期草莓根際細(xì)菌的豐度與非種植草莓的對(duì)照土壤有顯著的差異。圖2表明，草莓在整個(gè)生育期的細(xì)菌具有相似性。在G1土樣中Subgroup_6_norank的相對(duì)豐度最高，為26.1%。G2的兩個(gè)土樣中，Pseudomonas的相對(duì)豐度最高，分別為12.7%和12.1%。另外Bryobacter和Rhodospirillaceae_uncultured多種菌屬在G2的相對(duì)豐度也較高，并且這幾種菌屬的相對(duì)豐度比其他兩組的豐度高。在G3的3個(gè)土樣中Pseudomonas的相對(duì)豐度最高，相對(duì)豐度分別為18.1%,21.5%和30.9%，而且比其他兩組的相對(duì)豐度都要高。在G3的3個(gè)土樣中相對(duì)豐度較高的還有Bacillus和Flexibacter等，且其相對(duì)豐度比其他兩組的豐度高。在G2和G3中，Pseudomonas的相對(duì)豐度均是最高，并且G3中的Pseudomonas相對(duì)豐度達(dá)到了整個(gè)草莓生育期的最高。除Pseudomonas外，在G2和G3中分別有多種菌屬的相對(duì)豐度比其他兩組要高，屬于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)菌屬。Pseudomonas在草莓整個(gè)生育期內(nèi)都屬于優(yōu)勢(shì)菌，其豐度隨草莓生育期的變化而變化。因此可知，該菌屬在草莓生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期都可能起到重要作用。

2.3 草莓不同生育期根際土壤真菌相對(duì)豐度的變化

將草莓不同時(shí)期的 6 個(gè)土壤樣品質(zhì)控后序列按97%相似性進(jìn)行聚類(lèi)，共得到 23.84萬(wàn)個(gè) OTUs。6個(gè)樣品共檢測(cè)到33個(gè)土壤真菌門(mén)(Phylum)、49個(gè)綱(Class)、72個(gè)目(Order)、83 個(gè)科(Familiy)、95 個(gè)屬(Genus)、98個(gè)種(Species)。6個(gè)樣品共檢測(cè)到4個(gè)已知真菌門(mén)，Ascomycota、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、纖毛亞門(mén)(Ciliophora)和Choanomonada。6個(gè)樣品中，Ascomycota的相對(duì)豐度最高，其次分別是Basidiomycota和Ciliophora。Ascomycota的相對(duì)豐度隨草莓生育期的變化呈現(xiàn)波動(dòng)性變化，尤其在S2時(shí)期時(shí)相對(duì)豐度顯著下降。Basidiomycota和Ciliophora的相對(duì)豐度隨草莓生育期的變化出現(xiàn)不規(guī)則變化，Basidiomycota的相對(duì)豐度在S4時(shí)期最高；Ciliophora的相對(duì)豐度在S2時(shí)期最高。

6個(gè)樣品中共檢測(cè)到51種真菌綱。由圖3可知：相對(duì)豐度較高的有糞殼菌綱 (Sordariomycetes)、Ascomycota_unclassified、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、盤(pán)菌綱(Pezizomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)。與對(duì)照土樣的相對(duì)豐度相比，Sordariomycetes的相對(duì)豐度隨草莓生育期的變化出現(xiàn)無(wú)規(guī)律變化，其相對(duì)豐度在S3時(shí)期達(dá)到最大值為67.3%，在S2時(shí)期處于最低值，為35.3%。Ascomycota_unclassified的相對(duì)豐度隨生育期的變化逐漸下降。Eurotiomycetes只有在S5時(shí)期相對(duì)豐度顯著增加(19.6%)，而在其他生育時(shí)期無(wú)明顯變化。Pezizomycetes在S4時(shí)期時(shí)相對(duì)豐度處于最大值(10.3%)，在S3時(shí)期處于最低值(1.6%)。Agaricomycetes在S2和S4時(shí)期時(shí)相對(duì)豐度增加，并且在S4時(shí)期時(shí)顯著增加達(dá)到最大值17.5%。

圖3 真菌綱水平柱狀圖Fig.3 Fungi level histogram

將6個(gè)樣品依據(jù)真菌分布豐度特征，從屬的水平上進(jìn)行聚類(lèi)，通過(guò)圖4可以看出，6個(gè)樣品明顯地分成3類(lèi)：CK聚成一類(lèi)(Gl)；S4、S1和S3聚成一類(lèi)(G2)；S2和S5聚成一類(lèi)(G3)。CK聚為一類(lèi)，而草莓整個(gè)生育期聚在一起，表明草莓在整個(gè)生育期的真菌具有相似性。在G1中Ascomycota_unclassified和Microascaceae_unclassified相對(duì)豐度較高而且比其他兩個(gè)組中的相對(duì)豐度還要高。相對(duì)豐度最高的區(qū)域分布在G2；Chaetomium在G2的3個(gè)土樣中相對(duì)豐度最高，而且比其他兩組的豐度都要高；Chaetomium在G2中的相對(duì)豐度達(dá)到了草莓整個(gè)生育期的最大值，其相對(duì)豐度分別為42.4%,45.7%,56.1%。在G3的2個(gè)土樣中Chaetomium的相對(duì)豐度最高，但豐度低于G2，相對(duì)豐度分別為21.1%和26.8%。Chaetomium在草莓整個(gè)生育期內(nèi)都是優(yōu)勢(shì)菌屬，其豐度隨草莓生育期的變化而變化。因此可知，毛殼屬(Chaetomium)對(duì)草莓的生長(zhǎng)發(fā)育有其重要作用。

圖4 真菌熱圖Fig.4 Fungi relative abundance heatmap

3 討論和結(jié)論

植物不同生長(zhǎng)發(fā)育期根系分泌物不同，從而對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，并且隨生育期的變化也呈現(xiàn)一定的動(dòng)態(tài)變化。孫曉棠等采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)不同生育期番茄根際細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明根際細(xì)菌種類(lèi)和數(shù)量在初花期發(fā)生較為顯著的變化，初果期根際群落多樣性指數(shù)(H)和物種豐度(S)值都達(dá)到最高，微生物最豐富[6]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌和真菌的群落豐富度和多樣性、主要種群的相對(duì)豐度隨草莓的生長(zhǎng)發(fā)育均發(fā)生了變化。細(xì)菌豐富度隨生育期的變化而逐漸上升；細(xì)菌群落多樣性在恢復(fù)生長(zhǎng)期和開(kāi)花期時(shí)期時(shí)下降，現(xiàn)蕾期、結(jié)果期和盛果期上升。真菌豐富度和多樣性都在S2時(shí)期時(shí)顯著升高。這可能是由于在草莓不同生育期根系分泌物的含量和組成不同，使根際微生物的結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生了改變。草莓生長(zhǎng)前期細(xì)菌群落多樣性的下降和真菌群體的增加，會(huì)導(dǎo)致草莓土傳病害的發(fā)生。根據(jù)這個(gè)現(xiàn)象，在草莓生長(zhǎng)前期采取措施促進(jìn)根際細(xì)菌的數(shù)量和群體，有利于防止草莓土傳病害的發(fā)生。

草莓根際土壤中細(xì)菌的相對(duì)豐度較高的有Proteobacteria和Acidobacteria。變形菌門(mén)的相對(duì)豐度隨著草莓的生長(zhǎng)發(fā)育而逐漸升高，酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度隨草莓生育期的變化出現(xiàn)不同程度的下降。真菌相對(duì)豐度最高的是Ascomycota。Ascomycota的相對(duì)豐度隨草莓生育期的變化呈現(xiàn)波動(dòng)性變化，尤其在S2時(shí)期時(shí)相對(duì)豐度顯著下降。根據(jù)土壤細(xì)菌熱圖分析，土壤細(xì)菌在草莓整個(gè)生育期都聚在一起，表明在整個(gè)生育期內(nèi)草莓根際的細(xì)菌具有相似性。而且Pseudomonas在草莓整個(gè)生育期內(nèi)都屬于優(yōu)勢(shì)菌。由此推斷，該菌屬在草莓生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期都起到重要作用。Pseudomonas在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[7]。它在抑制多種作物疾病[8],促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[9]，降解多種用于植物保護(hù)的殺蟲(chóng)劑[10]等方面均有作用。但是一些假單胞菌也表現(xiàn)出對(duì)植物的致病性[11]，使農(nóng)作物減產(chǎn)。土壤真菌熱圖顯示草莓在整個(gè)生育期的真菌具有相似性，并且Chaetomium在草莓整個(gè)生育期內(nèi)都是優(yōu)勢(shì)菌屬。毛殼菌(Chaetomiumspp.)已經(jīng)被廣泛用于防治由Rhizoctoniasolani和Fusariumoxysporium等引起的松苗猝倒病、Venturiainaequalis引起的蘋(píng)果黑星病、Valsamali引起的蘋(píng)果樹(shù)腐爛病[12]。因此，Chaetomium對(duì)草莓的生長(zhǎng)發(fā)育有其重要作用。