馬鈴薯甲蟲RNA干擾高效致死基因的篩選

米熱古麗·胡爾西達(dá)，付開赟，徐晴玉，吐爾遜·艾合買提，丁新華，何 江，郭文超

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；3. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后流動(dòng)站，新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站，烏魯木齊 830052;4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；5.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)是馬鈴薯上國(guó)際檢疫的食葉毀滅性害蟲[1]。馬鈴薯甲蟲是世界上應(yīng)用化學(xué)防治最早、最為廣泛的害蟲，也是最早產(chǎn)生抗藥性的害蟲之一。到目前為止馬鈴薯甲蟲對(duì)所有已注冊(cè)的化學(xué)農(nóng)藥均產(chǎn)生了抗藥性[2]。RNA干擾現(xiàn)象在1998年發(fā)現(xiàn)以來(lái)[3]，逐步應(yīng)用于基因功能研究、基因檢測(cè)和醫(yī)療領(lǐng)域[4]，在昆蟲領(lǐng)域中雖然RNAi技術(shù)尚無(wú)應(yīng)用于田間害蟲防治的產(chǎn)品，但其綠色無(wú)公害，專一性強(qiáng)，作為“基因農(nóng)藥”是最具潛力的害蟲防治手段之一。研究通過(guò)篩選更為快速高效的馬鈴薯甲蟲致死基因，針對(duì)性提高RNAi效力，為RNAi防控技術(shù)能更好的應(yīng)用田間提供了理論和技術(shù)支持?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】RNA干擾研究的昆蟲種類已達(dá)幾十種，包括鱗翅目、直翅目、膜翅目、同翅目、雙翅目等多種昆蟲[5-9]。通過(guò)注射或喂食dsRNA的方法比較發(fā)現(xiàn)組織器官的差異、物種的差別、基因的選擇對(duì)RNA干擾效果影響較大[5]。先前研究通過(guò)dsRNA原核表達(dá)系統(tǒng)研究了馬鈴薯甲蟲ATP酶E亞基的致死效果。結(jié)果表明，四齡幼蟲的化蛹致死中濃度為dsATPaseE表達(dá)菌液的0.001 2倍，處理高濃度的dsATPaseE的幼蟲均會(huì)在處理后3 d 出現(xiàn)拒食表型，在較高濃度處理下的馬鈴薯甲蟲幼蟲行動(dòng)力下降，全部不能入土化蛹，在適中的濃度處理下的馬鈴薯甲蟲能夠入土，但是在土中全部不能正?；糩10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】研究利用赤擬谷盜中報(bào)導(dǎo)的高效快速致死基因[11]，以dsATPaseE和dsATPaseA為對(duì)照基因，初步建立高效致死基因的評(píng)價(jià)方法，鑒定分析馬鈴薯甲蟲中快速高效的RNA干擾靶標(biāo)基因?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究RNA干擾技術(shù)篩選高效致死基因，提出高效致死基因的關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)?？偨Y(jié)RNA干擾鞘翅目中兩種昆蟲的直系同源基因的試驗(yàn)結(jié)果，分析RNA干擾致死率的差異造成的原因。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試?yán)ハx

馬鈴薯甲蟲卵塊均隨機(jī)采集于新疆農(nóng)科院植物保護(hù)研究所安寧渠試驗(yàn)地。(N：43.9128，E：87.4918)。培養(yǎng)箱飼養(yǎng)溫度：(26±1)℃；光周期：14L∶10D；相對(duì)濕度50%～60%。用新鮮馬鈴薯葉片飼喂，取同一時(shí)間蛻皮至2齡初的幼蟲作實(shí)驗(yàn)用蟲。

1.1.2 主要試劑

總RNA提取試劑(TRIzol)購(gòu)自Invitrogen公司，引物合成購(gòu)自南京金斯瑞公司、SuperScript III反轉(zhuǎn)錄酶、Oligo (dT)18隨機(jī)引物、TaqDNA聚合酶、dNTP mixture (2.5 mM 和10 mM) RNase抑制劑、DNA Marker購(gòu)自TaKaRa寶生物公司。pGEM-T easy vector購(gòu)自Promega公司。DNA凝膠回收試劑盒為AXYGEN公司或Promega公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)或進(jìn)口產(chǎn)品如酵母提取液和胰蛋白胨為Oxiod公司產(chǎn)品。

利用相似性搜索工具BLAST-2.2.27+，在馬鈴薯甲蟲的轉(zhuǎn)錄組和基因組中(轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)李國(guó)清老師惠贈(zèng)，馬鈴薯甲蟲的基因組數(shù)據(jù)下載自美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院人類基因組測(cè)序中心網(wǎng)站https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/colorado-potato-beetle-genome-Project。)搜索在赤擬谷盜中報(bào)導(dǎo)的40個(gè)高效致死基因[5]。選定赤擬谷盜致死基因中致死效率最高的10個(gè)基因，分別為Tcpp1alpha-96a、TcRpt3、Tcalphasnap、TcSrp54k、TcRpn6、TcRop、TcGawky、Tcshi、Tccact、Tcinr-a，以及比較致死效率的2個(gè)馬鈴薯甲蟲陽(yáng)性對(duì)照基因LdATPaseE和LdATPaseA，獲得的cDNA序列通過(guò)PCR驗(yàn)證序列的正確性后提交到Genbank獲取登錄號(hào)。

1.2 方 法

1.2.1 dsRNA原核表達(dá)載體的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)用大腸桿菌EscherichiacoliHTl15(DE3) RNase Ⅲ缺失品系和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)的pET-2p dsRNA表達(dá)載體。載體構(gòu)建方法參照[12]中記載方法，用于構(gòu)建馬鈴薯甲蟲致死基因Tcpp1alpha-96a、TcRpt3、Tcalphasnap、TcSrp54k、TcRpn6、TcRop、TcGawky、Tcshi、Tccact、Tccpf的dsRNA的cDNA片段，超純水和dsegfp為對(duì)照，PCR克隆獲得。PCR產(chǎn)物的回收與純化、連接和轉(zhuǎn)化及單克隆的挑選參照[13]中記載方法。獲得的陽(yáng)性克隆通過(guò)測(cè)序和異丙基硫代半乳糖(isopropyl-D-hiogalactoside，IPTG)誘導(dǎo)發(fā)酵dsRNA驗(yàn)證結(jié)果。誘導(dǎo)發(fā)酵的步驟參照[14]中記載方法，在菌液重新擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=1.0時(shí)加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，發(fā)酵表達(dá)6 h即可獲得穩(wěn)定表達(dá)的濃度約為0.05 μg/μL 的dsRNA[14]。采用 Premier Primer5.0設(shè)計(jì)dsRNA片段的引物。表1

表1 用于構(gòu)建dsRNA原核表達(dá)載體的引物
Table 1 Primers used for dsRNA synthesis

代號(hào)Symbol基因名GeneName上游引物Forwardprimer(5′-3′)下游引物Reverseprimer(5′-3′)dsRNA片段長(zhǎng)度LengthofdsRNAfragmentL1Ldalpha-snapTTCGGTAGTTCTAGTCGTAATAGTCTGGTGGTGCTT288L2LdcactGAGGGTTGCTCAGGGTATTTCGCTGTCTTCAGTATCG222L3Ldinr-aAGCTCGTTCCTTCGCTAGGCAGTCCTTTGCCCTAAC226L4LdGawkyCGGCTCAAGTTGTCGTTCTGAGGTCGTCAGATAGTTCG224L5LdRpn6GATAAAGATAATGCCGTGAGGTGTAGCGGACAAATGCT323L6LdshiCGTTTACGGGAAGTAGTGGAACCTTTGCGAATGACCT217L7Ldsrp54kAGGAGCGTATGACCAAGTTCAGGTTTCACAGCGTTA219L8LdropCAAGAACACTGCGTTTAGCTTATGCTGTCTGGGATT178L9LdRpt3GGTCCACTACAGGTTCCAGTCCATACATCAACACCC309L10LdpplaphaGCAGAAGTCGTAGGGAAATAACTGACATCATCGCACC171L11LdATPaseAGCGGAAGTAGTAATAATGGGACAACTGATAAGCACCTA197L12LdATPaseEAATCCTGGAAAGCCTCATCCAACTGCTGCGAAATCA281dsegfpdsegfpAAGTTCAGCGTGTCCGCTTGCCGTAGTTCCAC414

1.2.2 喂食dsRNA試驗(yàn)

將已經(jīng)構(gòu)建好的pET-2p-alpha-snap、pET-2p-cact、pET-2p-inr、pET-2p-Gawky、pET-2p-Rpn6、pET-2p-shi、pET-2p-srp54k、pET-2p-rop、pET-2p-rpt、pET-2p-pplapha、pET-2p-ATPaseA、pET-2p-ATPaseE、pET-2p-egfp的大腸桿菌表達(dá)載體在含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中以體積比1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，于37℃ 220 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)3.5 h，即OD100=1.0時(shí)，按1∶1 000比例(v/v)添加已經(jīng)配好的IPTG母液(母液濃度0.023 8 g/mL)，至終濃度為0.1 mmol /L，繼續(xù)恒溫震蕩4～5 h，以此過(guò)程獲得新鮮dsRNA，dsRNA濃度約為50 μg /mL。選取飼養(yǎng)一致的2齡初的幼蟲，分別設(shè)置超純水與表達(dá)dsegfp稀釋10倍菌液即濃度5 μg / mL為空白對(duì)照和陰性對(duì)照。將馬鈴薯甲蟲二齡幼蟲置于9 cm標(biāo)準(zhǔn)玻璃皿中，用菌液處理過(guò)的葉片進(jìn)行飼喂。各處理濃度為50、5、0.5和0.05 μg / mL，每個(gè)處理5頭幼蟲，6組生物學(xué)重復(fù)。共計(jì)用蟲1 500頭。干擾24 h后喂食新鮮葉片。觀察記錄幼蟲生長(zhǎng)狀況、取食率、死亡率。當(dāng)幼蟲出現(xiàn)化蛹跡象，將其轉(zhuǎn)入土壤深度為10 cm的封閉環(huán)境中，觀察化蛹率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

研究數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel、IBM spss statistics 20.0處理，做線性回歸分析模型以及計(jì)算取食20%劑量AD20，化蛹中量PD50和致死中量LD50。存活率、化蛹率和羽化率通過(guò)ANOVA的Tukey-Kramer分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，顯著性水平選擇P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯甲蟲幼蟲致死基因的序列信息

選定的10個(gè)基因，分別參與不同的生物學(xué)功能，其中L1為參與細(xì)胞間的粘合；L2參與Toll免疫信號(hào)通路；L3為mRNA前體剪切體復(fù)合體2蛋白Pcf11，參與mRNA的剪切；L4為三核苷酸重復(fù)蛋白，參與miRNA的調(diào)節(jié)；L5、L9參與蛋白酶體的構(gòu)成；L6為GTP酶，參與細(xì)胞內(nèi)吞；L7參與細(xì)胞膜上的信號(hào)識(shí)別；L8參與突觸信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)；L10為絲/蘇氨酸磷酸酯酶。對(duì)每個(gè)基因設(shè)計(jì)了dsRNA，dsRNA引物及序列長(zhǎng)度。表2

表2 馬鈴薯甲蟲致死基因序列信息Table 2 Information
Table of Lethal Genes ofLeptinotarsadecemlineata

代號(hào)Symbol基因庫(kù)登錄號(hào)GenbankAccessionNo蛋白質(zhì)長(zhǎng)度AALength黑腹果蠅直系同源基因OhthologiesinDrosophilamelanogasterE值Evalue一致率IdentityNr數(shù)據(jù)庫(kù)最佳匹配的注釋AnnotationofbesthitinNrDatabaseL1KY285070291CG662500.96PREDICTED:alpha-solubleNSFattachmentprotein[Anoplophoraglabripenn]L2KY285067365CG58483E-1170.53PREDICTED:NF-kappa-Binhibitorcactus-like[Anoplophoraglabripennis]L3KY2850691603CG1022800.5PREDICTED:pre-mRNAcleavagecomplex2proteinPcf11[Triboliumcastaneum]L4KY2850681295CG3199200.18PREDICTED:proteinGawkyisoformX6[Anoplophoraglabripennis]L5KY285071389CG537800.93PREDICTED:26Sproteasomenon-ATPaseregulatorysubunit6[Anoplophoraglabripennis]L6KY285072825CG1810200.76PREDICTED:dynamin-like[Anoplophoraglabripen-nis]L7KY285043508CG465900.95Predicted:signalrecognitionparticle54kDaprotein[Anoplophoraglabripennis]L8KY285050593CG1581100.91PREDICTED:proteinROPisoformX1[Anoplophoraglabripennis]L9KY285060409CG1691600.99PREDICTED:26Sproteaseregulatorysubunit6B[Ano-plophoraglabripennis]L10KY285076327CG659301PREDICTED:serine/threonine-proteinphosphataseal-pha-2isoform[Anoplophoraglabripennis]

2.2 喂食致死基因dsRNA對(duì)馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲取食量的影響

連續(xù)喂食一周表達(dá)L1～L12菌液后，馬鈴薯甲蟲幼蟲表現(xiàn)出拒食、發(fā)育遲緩的情況。在4個(gè)劑量50、5、0.5和0.05 μg的dsRNA處理中，在劑量50與5 μg處理葉片上的幼蟲取食率呈明顯下降趨勢(shì)，極顯著低于對(duì)照組、dsegfp處理組和低濃度處理組葉片上幼蟲的取食率。

黨的十九大報(bào)告把黨的政治建設(shè)納入新時(shí)代黨的建設(shè)總體布局，明確要求要以黨的政治建設(shè)為統(tǒng)領(lǐng)、把黨的政治建設(shè)擺在首位，為堅(jiān)持和加強(qiáng)黨對(duì)高校的全面領(lǐng)導(dǎo)、推進(jìn)高校黨的建設(shè)指明了方向、提供了遵循。對(duì)高校來(lái)講，強(qiáng)化黨的政治建設(shè)的統(tǒng)領(lǐng)地位，要突出加強(qiáng)政治領(lǐng)導(dǎo)、增強(qiáng)政治能力、把握政治方向、強(qiáng)化政治功能四大重點(diǎn)。

處理24 h時(shí)后，50 μg的各處理組葉片取食率與dsegfp處理組葉片上取食率差異不顯著(P>0.05)，取食率均在25%以下，危害等級(jí)為Ⅰ；0.05 μg 的處理組與對(duì)照組取食率差異不顯著(P>0.05)，但與其它處理濃度與dsegfp處理組的取食率有差異(P<0.05)。處理48 h后，各處理組取食率隨幼蟲生長(zhǎng)均有上升，其中Ldalphasnap與LdSrp54k處理組較其他處理組取食率增長(zhǎng)微效且緩慢，仍表現(xiàn)出最強(qiáng)的取食抑制，與對(duì)照組和dsegfp處理組存在極顯著差異(P<0.05)。其余各處理組在48 h時(shí)取食率大小依次為：LdGawky>Ldshi>Ldcact>LdRop>Ldinr-a>LdRpt3>LdRpn6>LdATPaseA>LdATPaseE。處理72和96 h后，Ldalphasnap、Ldcact、LdRpn6、LdSrp54k、LdRpt3、LdATPaseA、LdATPaseE處理組幼蟲取食量隨天數(shù)增長(zhǎng)呈明顯下降趨勢(shì)，濃度越高抑制反應(yīng)越強(qiáng)，而在對(duì)照組和dsegfp處理組幼蟲取食率則呈繼續(xù)上升，接近甚至達(dá)到IV級(jí)的取食為害。圖1A-D

幼蟲在喂食表達(dá)dsRNA菌液后，于處理后第3 d出現(xiàn)顯著的的取食抑制表型，各處理組濃度加大，拒食率升高，即以處理后第3 d作為抑制取食表型的分析時(shí)刻。運(yùn)用SPSS 20.0對(duì)幼蟲3 d的拒食率進(jìn)行回歸分析。除LdRop處理組和拒食活性較低的Ldinr-a，其余各處理組中在dsRNA濃度為50 μg/mL與5 μg/mL是取食率均低于達(dá)12.5%，甚至不取食。其中LdSrp54k處理組拒食活性最高，拒食率回歸分析為：Y=2.711x-1.353，取食20%劑量為(1.39±0.13) μg。表3

圖1 喂食濃度梯度的dsRNA后第1～4 d(A-D)幼蟲取食的為害等級(jí)
Fig. 1 Larvae feed intake 1-4 days(A-D) after feeding dsRNA at gradient concentrations

表3 拒食活性統(tǒng)計(jì)分析與線性回歸方程
Table 3 Regression and D20analysis of 3-day after feeding dsRNA to 2nd instar CPB larvae

代號(hào)Symbol基因Gene拒食率回歸方程LinearregressingequationAD20AD20稀釋倍數(shù)DilutionmultipleL1Ldalpha-snapY=5.873x-3.0641.51±0.06 33.2±0.7L2LdcactY=4.523x-2.3021.57±0.09 31.9±2.8L3Ldinr-aY=9.892x-3.102228.13±6.72 0.2±0.1L4LdGawkyY=2.858x-1.371.61±0.0031±0.5L5LdRpn6Y=4.523x-2.3021.57±0.0331.9±0.3L6LdshiY=5.873x-3.0641.51±0.0133.2±0.7L7Ldsrp54kY=2.711x-1.3531.39±0.1335.9±3.0L8Ldrop---L9LdRpt3Y=7.403x-3.8351.78±0.0728±1.5L10LdpplaphaY=5.273x-2.4942.61±0.1519.2±0.9L11LdATPaseAY=3.46x-1.1875.29±0.279.5±3.2L12LdATPaseEY=4.076x-1.713.47±0.0614.4±0.8

注：AD20與稀釋倍數(shù)后的值為±SE

2.3 喂食致死基因dsRNA對(duì)馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲致死效果的評(píng)價(jià)

各處理組干擾后幼蟲減少取食甚至停止進(jìn)食，迫使其生長(zhǎng)發(fā)育得到抑制，最后導(dǎo)致死亡。 每日統(tǒng)計(jì)死亡頭數(shù)，待老熟幼蟲入土化蛹前，即dsRNA喂食處理第7 d后統(tǒng)計(jì)死亡率。各基因?qū)︸R鈴薯幼蟲在入土前均具有一定的毒殺作用，其中處理組LdSrp54k、LdRpn6、LdRpt3、Ldalphasnap在dsRNA濃度為50 μg /mL下對(duì)馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲表現(xiàn)出高致死活性，致死率高達(dá)90%～93%。LdGawky、LdRop、Ldcact、LdRpn6、LdRpt3、LdATPaseA、LdATPaseE、Ldalphasnap、LdSrp54k處理組在dsRNA濃度為50 μg /mL與5 μg /mL下致死率均超過(guò)50%，致死活性隨濃度增高而增大，表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。與對(duì)照組存在顯著差異(P< 0.05)。圖2

注：誤差線為±SE，誤差線上端不同字母表示處理組內(nèi)顯著性水平不同

Note:Bars means ±SE, different letters depict different significant level

圖2 喂食馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲dsRNA菌液后第7 d的存活率
Fig. 2 7-day survival rate of 2nd instar larvae after treated with dsRNA-expressing bacterial solution

運(yùn)用SPSS20.0對(duì)處理后7 d的死亡率進(jìn)行顯著性分析與回歸分析。入土化蛹前時(shí)間大約為處理后的第7 d，各致死基因LD50具體數(shù)值。表4

表4 致死活性統(tǒng)計(jì)分析與線性回歸方程
Table 4 Linear regression equation for medium mortality of 2nd instar larvae ofLeptinotarsadecemlineata

代號(hào)Symbol基因Gene死亡率回歸方程Linearregressingequation致死中量LD50稀釋倍數(shù)DilutionmultipleL1Ldalpha-snapY=3.45x-1.5933.52±0.3614.2±0.7L2LdcactY=3.708x-2.0341.84±0.3027.1±3.0L3Ldinr-aY=4.491x-0.99961.07±10.170.8±0.1L4LdGawkyY=5.797x-2.865.42±0.529.2±1.6L5LdRpn6Y=4.087x-2.4621.18±0.1042.4±3.1L6LdshiY=5.174x-2.10812.59±0.484±0.7L7Ldsrp54kY=3.227x-1.8861.3±0.0638.3±1.8L8LdropY=4.164x-2.4111.48±0.0033.8±3.7L9LdRpt3Y=3.814x-2.0791.93±0.0725.9±3.4L10LdpplaphaY=6.195x-2.6216.63±0.733±0.5L11LdATPaseAY=4.308x-2.1833.08±0.2316.2±0.2L12LdATPaseEY=4.681x-2.2454.54±0.5411±0.3

2.4 喂食致死基因dsRNA對(duì)馬鈴薯甲蟲幼蟲化蛹率的影響

老熟幼蟲入土化蛹后第7 d統(tǒng)計(jì)化蛹率。結(jié)果表明,各基因?qū)︸R鈴薯幼蟲化蛹率均具有一定抑制作用，與對(duì)照組存在顯著差異(P<0.05)。且化蛹率隨處理濃度的增加而減小，其中處理組Ldalpha-snap、LdSrp54k、Ldcact、LdRpn6、LdSrp54k、LdATPaseA、LdATPaseE、在dsRNA濃度為50 μg /mL下對(duì)馬鈴薯甲蟲老熟幼蟲化蛹率低至0。Ldpp1alpha-96a、LdRpt3、Ldalphasnap、LdSrp54k、LdRpn6、LdRop、LdGawky、Ldshi、Ldcact、處理組在dsRNA劑量為50 μg與5 μg下化蛹率均未超過(guò)50%。即使劑量低至0.05 μg，也能相比對(duì)照降低幼蟲20%～30%的化蛹率。圖3

注：誤差線為±SE，誤差線上端不同字母表示處理組內(nèi)顯著性水平不同

Note:Bars means ±SE, different letters depict different significant level

圖3 喂食dsRNA菌液的馬鈴薯甲蟲幼蟲化蛹率
Fig. 3 Pupation rate of larvae of fed with dsRNA bacterial solution

運(yùn)用SPSS21.0對(duì)老熟幼蟲入土化蛹率進(jìn)行顯著性分析與回歸分析。入土?xí)r間大約為7 d，各致死基因PD50具體數(shù)值。表5

表5 處理dsRNA后幼蟲化蛹率的線性回歸方程
Table 5 Linear regression and PD50analysis for pupation rate

代號(hào)Symbol基因Gene化蛹率回歸方程Linearregressingequation化蛹中量PD50稀釋倍數(shù)DilutionmultipleL1Ldalpha-snapY=5.073x-3.4430.39±0.01128.4±5.7L2LdcactY=3.633x-2.2620.81±0.0861.5±0.0L3Ldinr-aY=6.064x-2.13231.20±1.891.6±0.3L4LdGawkyY=6.934x-5.3440.06±0.01788.5±61.9L5LdRpn6Y=5.581x-4.5180.07±0.00758.6±130.0L6LdshiY=4.779x-3.0290.67±0.0874.2±9.9L7Ldsrp54kY=2.708x-1.8050.65±0.1076.7±11.3L8LdropY=3.987x-2.3930.98±0.0851.0±4.2L9LdRpt3Y=3.697x-2.1191.24±0.2440.5±6.8L10LdpplaphaY=2.976x-1.7880.98±0.1951.0±4.3L11LdATPaseAY=3.551x-2.4280.50±0.09100.8±11.7L12LdATPaseEY=3.21x-2.2610.46±0.02109.8±15.9

2.5 備選基因dsRNA的致死效果的綜合分析和致死效應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)

L1～L10基因與LdATPaseA、LdATPaseE的拒食活性、致死活性、 抑制化蛹活性對(duì)比分析。Ldalpha-snap、LdSrp54k、LdRpn6、LdRpt3、LdGawky、Ldcact、Ldshi總計(jì)7個(gè)基因的dsRNA取食20%劑量顯著低于LdATPaseA與LdATPaseE；Ldcact、LdSrp54k、LdRpn6、LdRpt3、Ldrop總計(jì)5個(gè)基因的dsRNA致死中量低于LdATPaseA與LdATPaseE；Ldalpha-snap、LdRpn6、Ldcact總計(jì)三個(gè)基因的dsRNA化蛹中濃度顯著低于LdATPaseA與LdATPaseE。在綜合比較對(duì)葉片減少為害的速效性和致死效率來(lái)看，Ldcact、LdSrp54k、LdRpn6、LdRpt3、Ldrop五個(gè)基因在表現(xiàn)上優(yōu)于LdATPaseA與LdATPaseE。表6

表6 備選致死基因拒食活性、致死活性、 抑制化蛹活性對(duì)比
Table 6 Comparison and analysis of repulsion, lethal and Chrysalis activities

代號(hào)Symbol基因名稱Genename取食20%劑量ID20致死中量LD50化蛹中量PC50L1Ldalpha-snap1.51±0.063.52±0.360.39±0.01L2Ldcact1.57±0.091.84±0.300.81±0.08L3Ldinr-a228.13±6.7261.07±10.1731.20±1.89L4LdGawky1.61±0.005.42±0.520.06±0.01L5LdRpn61.57±0.031.18±0.100.07±0.00L6Ldshi1.51±0.0112.59±0.480.67±0.08L7Ldsrp54k1.39±0.131.3±0.060.65±0.10L8Ldrop-1.48±0.000.98±0.08L9LdRpt31.78±0.071.93±0.071.24±0.24L10Ldpplapha2.61±0.1516.63±0.730.98±0.19L11LdATPaseA5.29±0.273.08±0.230.50±0.09L12LdATPaseE3.47±0.064.54±0.540.46±0.02

3 討 論

目前RNA干擾技術(shù)在基因功能方面的研究已經(jīng)較為成熟[15]。然而，在RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治方面，還面臨著諸多問(wèn)題[16-17]。例如所選取的RNA干擾的靶標(biāo)基因，作用時(shí)間過(guò)于緩慢，往往需要7 d甚至更久才能使昆蟲出現(xiàn)拒食，蛻皮或不能正?；嫉缺硇?，作用方式類似于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。因此,需要進(jìn)一步對(duì)高效快速的致死基因進(jìn)行挖掘。先前對(duì)LdATPase的研究，其致死中濃度為dsRNA表達(dá)菌液的0.001 2倍，處理LdATPase的幼蟲均會(huì)在處理后第2 d出現(xiàn)拒食表型，在較高濃度處理下的馬鈴薯甲蟲幼蟲行動(dòng)力下降，全部不能入土化蛹，在中低濃度處理下馬鈴薯甲蟲能夠入土，但是在土中部分甚至全部不能正常化蛹[12]。實(shí)驗(yàn)選定的赤擬谷盜致死效率最高的10個(gè)基因中的Ldalpha-snap、LdRpn6、LdSrp54k、LdRpt3基因在馬鈴薯甲蟲上表現(xiàn)的致死效果高于LdATPaseA和LdATPaseE。

Tcpp1alpha-96a、TcRpt3、Tcalphasnap、TcSrp54k、TcRpn6、TcRop、TcGawky、Tcshi、Tccact、Tcinr-a以上10個(gè)基因在赤擬谷盜上注射8 d即可達(dá)到100%的死亡率[11]。而在研究中沒有在馬鈴薯甲蟲上表現(xiàn)出如此高的致死活性?？紤]可能是以下幾個(gè)方面導(dǎo)致。一方面，dsRNA的遞送方式不同，Ulrich等對(duì)赤擬谷盜的研究[11]采用注射dsRNA的方法。其優(yōu)點(diǎn)是dsRNA迅速精準(zhǔn)到達(dá)組織，干擾效率相對(duì)高，但是在干擾過(guò)程中對(duì)幼蟲造成了機(jī)械損傷，該損傷是否對(duì)RNA干擾的效果造成協(xié)同的影響不可而知。而研究采用的喂食dsRNA的方法雖然操作容易、成本低、省時(shí)、對(duì)蟲體不會(huì)造成機(jī)械性損傷[18-20]，但是由于需要經(jīng)過(guò)腸道消化吸收，基因沉默效率相比較于注射法會(huì)低。另一方面，物種差別也可能導(dǎo)致RNA干擾的差異，不同昆蟲由于血淋巴和腸道環(huán)境差異大導(dǎo)致dsRNA降解消化和攝取的效率差異也大。如煙草天蛾Manducasexta相比德國(guó)小蠊Blattellagermanica，血淋巴和腸道中具有更高活性的雙鏈核酸酶。而赤擬谷盜是雜食性的倉(cāng)儲(chǔ)害蟲，而馬鈴薯甲蟲屬于專食性的食葉害蟲，雖然同屬于鞘翅目但是食性差別仍然較大。此外，dsRNA所用的劑量也有差異，Ulrich等對(duì)赤擬谷盜的研究[11]注射dsRNA劑量為3 ng/μL、30 ng/μL、300 ng/μL、1 μg/μL。研究通過(guò)飼喂法向馬鈴薯甲蟲喂食50 μg /mL、5 μg /mL以及0.5 μg /mL濃度劑量的dsRNA，攝取劑量不同差異也會(huì)較大。因此，未來(lái)應(yīng)對(duì)原核表達(dá)dsRNA的系統(tǒng)，建立一套在蟲體、植株內(nèi)和環(huán)境中的dsRNA的定量檢測(cè)技術(shù)，利于注射法、喂食法的平行比較。

此外，RNA干擾雖然作用過(guò)程緩慢，普遍要5～7 d才會(huì)導(dǎo)致幼蟲死亡[11,12]，但是研究對(duì)易獲得的表型指標(biāo)進(jìn)行了量化，包括葉片的取食量、7 d的致死率和化蛹率。發(fā)現(xiàn)在適當(dāng)?shù)膭┝肯?，致死基因的dsRNA能夠在2～3 d即可導(dǎo)致幼蟲的取食量大幅下降，甚至絕食，在第7 d導(dǎo)致幼蟲的完全死亡，這足以達(dá)到田間防控的目的。因此,研究提出的AD20和7 d幼蟲的LD50，尤其是AD20是評(píng)價(jià)致死基因效果的關(guān)鍵指標(biāo)。

4 結(jié) 論

通過(guò)RNA干擾從馬鈴薯甲蟲中篩選獲得了Ldcact、Ldalpha-snap、LdRpn6、LdSrp54k、LdRpt3五個(gè)具有較高抑制取食活性和致死效果的基因。提出并推薦AD20和LD50是評(píng)價(jià)備選基因dsRNA對(duì)幼蟲致死效果的關(guān)鍵指標(biāo)。