營養(yǎng)元素引發(fā)對低溫下棉苗保護(hù)性酶活性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

夏軍 王遠(yuǎn)遠(yuǎn) 喬露 陳宗奎 馬卉 高宏云 羅宏海

摘要：在人工模擬氣候條件下，以MnSO4·H2O、KCl、CuSO4·H2O為相應(yīng)Mn源、K源、Cu源，對棉種進(jìn)行營養(yǎng)元素引發(fā)試驗，研究不同營養(yǎng)元素引發(fā)對低溫（8 ℃）脅迫下棉種發(fā)芽率、棉苗保護(hù)性酶活性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響。結(jié)果表明，在低溫脅迫下，與CK處理相比，經(jīng)過營養(yǎng)元素引發(fā)，棉種種子活力增強(qiáng)，發(fā)芽率提高，棉花幼苗期的過氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）含量降低，可溶性蛋白含量提高;低溫脅迫24 h后，營養(yǎng)元素引發(fā)處理組棉花幼苗葉片的光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、非光化學(xué)猝滅系數(shù)（NPQ）、表觀電子傳遞速率（ETR）、實際光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）平均值分別比CK處理高16.67%、17.55%、42.23%、6.09%，以Mn、K、Cu濃度分別為3.500、0.746、0280 g/L 時，棉種引發(fā)24 h的效果最佳。因此，中微量營養(yǎng)元素引發(fā)可增強(qiáng)低溫脅迫下棉種活力，提高發(fā)芽率，同時增強(qiáng)棉苗的保護(hù)性酶活性，降低膜系統(tǒng)過氧化程度，提高葉片光合性能，進(jìn)而增強(qiáng)棉花的抗低溫能力。

關(guān)鍵詞：棉花;種子引發(fā);低溫脅迫;發(fā)芽率;保護(hù)性酶;葉綠素?zé)晒?棉花幼苗;抗冷性生理機(jī)制;冷害防御措施

中圖分類號：S562.01 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）16-0089-04

收稿日期：2018-05-10

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31460325）;國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（編號：201510759050）。

作者簡介：夏 軍（1995—），男，陜西漢中人，碩士研究生，主要從事棉花抗逆生理研究。

通信作者：羅宏海，博士，教授，主要從事作物高產(chǎn)生理與節(jié)水栽培技術(shù)研究。

棉花（Gossypium hirsutum L.）為錦葵科棉屬植物，起源于熱帶和亞熱帶區(qū)域，是典型的喜溫作物，適宜的生長發(fā)育溫度為20～30 ℃，對冷害脅迫反應(yīng)敏感。新疆在我國棉產(chǎn)區(qū)中占據(jù)主要地位，具有典型的大陸性干旱氣候，在棉花播種和幼苗時期，常出現(xiàn)倒春寒等低溫氣象，致使地表溫度遠(yuǎn)低于棉花幼苗生長溫度的最低點，甚至降低到0 ℃以下，使棉花出現(xiàn)爛種、爛芽甚至死苗等現(xiàn)象，最終造成棉花大幅度減產(chǎn)[1]。因此，提高棉苗抗低溫能力、避免苗期冷害對于穩(wěn)定新疆棉花生產(chǎn)具有重要意義。

低溫脅迫會破壞植物體內(nèi)活性氧平衡、抑制光合作用、大量積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及降低抗氧化酶活性等[2]，使得細(xì)胞代謝錯亂，甚至嚴(yán)重時導(dǎo)致植物死亡。因此，低溫造成的冷害嚴(yán)重影響棉花生產(chǎn)[3]。姜春明等認(rèn)為，低溫條件下植物需要通過提高保護(hù)性酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等的活性以及可溶性蛋白質(zhì)含量來清除有害物質(zhì)，從而有效減小因低溫造成的脅迫傷害[4]。植物在遭遇低溫脅迫時，光合速率與冷害脅迫的持續(xù)天數(shù)及恢復(fù)時長有關(guān)[5]。楊美森等研究表明，在冷害脅迫下，外源NO處理可提高棉花幼苗葉片最小熒光產(chǎn)量（F0）、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、表觀電子傳遞速率（ETR）和實際光化學(xué)效率（ΦPSⅡ），增大非光化學(xué)猝滅系數(shù)（NPQ），使光合機(jī)構(gòu)保持不變，維持光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）光化學(xué)活性的穩(wěn)定，減緩冷害對幼苗生長的抑制作用[6]。低溫常常導(dǎo)致棉花苗期生長發(fā)育受挫、光合速率下降等，進(jìn)而影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。

營養(yǎng)元素在作物生長發(fā)育過程中是不可或缺的無機(jī)元素，對種子萌發(fā)有著不同程度的調(diào)節(jié)作用[7]。營養(yǎng)元素浸種既可提高棉種種胚內(nèi)細(xì)胞膜的修復(fù)及完善功能，又能增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器、蛋白質(zhì)及核酸的活性，是種子打破休眠、促進(jìn)萌發(fā)的重要方法[8]。Miedema研究了低溫脅迫對玉米幼苗生長發(fā)育的影響，結(jié)果表明，低溫限制玉米種子在萌發(fā)階段獲取營養(yǎng)元素[9]。適當(dāng)濃度的營養(yǎng)元素處理可以增強(qiáng)植物幼苗抗氧化系統(tǒng)的相關(guān)酶活性[10]。汪鄧民等采用含有一定濃度K+、Ca2+、Zn2+的營養(yǎng)液對烤煙種子進(jìn)行浸種，提高了種子的活力指數(shù)，并增強(qiáng)了煙苗的抗旱能力[11]。Ros等研究認(rèn)為，播前給種子覆蓋1層營養(yǎng)元素涂層是促進(jìn)其早期生長的有效方法[12]。洪法水等研究表明，鈣、鋅單獨或兩者混合對玉米種子進(jìn)行處理，可提高玉米種子在萌發(fā)過程中淀粉酶、脂肪酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，且可使種子活力增強(qiáng)，并可促進(jìn)幼苗生長發(fā)育[13]。劉建鳳等通過研究錳對玉米種子萌發(fā)的影響發(fā)現(xiàn)，錳處理提高了玉米種子的萌發(fā)特性，使種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和幼苗的呼吸速率以及根系活力均有所提高[14]。侯典云等研究表明，一定濃度的錳處理可促進(jìn)小麥種子萌發(fā)及幼苗生長[15]。因此，通過營養(yǎng)元素引發(fā)可增強(qiáng)作物種子及幼苗的抗逆能力。棉花屬于對冷害脅迫敏感的經(jīng)濟(jì)作物，目前關(guān)于營養(yǎng)元素引發(fā)對冷害脅迫下棉花種子發(fā)芽、幼苗生理生化、葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)特性影響的研究較少。為此，本試驗從營養(yǎng)元素引發(fā)入手，研究營養(yǎng)元素引發(fā)處理對冷害脅迫下棉種發(fā)芽能力、棉花幼苗保護(hù)性酶活性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，探討營養(yǎng)元素引發(fā)提高棉花幼苗抗冷性的生理機(jī)制，為針對棉花苗期低溫冷害制定有效的防御措施提供技術(shù)支撐及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗于2015年在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物栽培實驗室人工氣候箱中完成。供試棉花品種為新陸早52號，以MnSO4·H2O、KCl、CuSO4·H2O為相應(yīng)Mn源、K源、Cu源，參照Imran等的種子引發(fā)試驗方法[16]，并加以改進(jìn)后進(jìn)行試驗。經(jīng)前期預(yù)試驗，篩選出發(fā)芽效果較好的營養(yǎng)元素組合及引發(fā)時間，分別為N1（3.500 g/L Mn+0.746 g/L K，引發(fā)時間24 h）、N2（3.500 g/L Mn+0.746 g/L K+0.280 g/L Cu，引發(fā)時間 12 h）、N3（3.500 g/L Mn+0.746 g/L K+0.280 g/L Cu，引發(fā)時間24 h）;以未引發(fā)、水（蒸餾水）引發(fā)為對照，分別為CK（未進(jìn)行任何浸種）、W1（H2O 12 h）、W2（H2O 24 h）。具體操作為選取籽粒飽滿、胚完整、無霉變、大小一致的棉花種子500粒，使用75%無水乙醇進(jìn)行消毒，消毒后放入錐形瓶中進(jìn)行引發(fā)12、24 h，然后分別浸泡于上述溶液中在8 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行不同時間（12、24 h）的低溫吸脹處理，其后取出棉種，吸干表面水分，于55 ℃下干燥處理48 h，然后轉(zhuǎn)入白天溫度為18 ℃、夜間溫度為8 ℃，光—暗周期為14 h—10 h的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)10 d，每個處理重復(fù)5次，每個重復(fù)100粒。

將經(jīng)過回干處理的棉種播于裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行幼苗培育，每缽播種4～5粒，以不引發(fā)、水引發(fā)棉種為對照。人工氣候箱內(nèi)溫度維持在23～28 ℃范圍內(nèi)，光—黑周期為14 h—10 h，待子葉出土后每2～3 d澆1次水，保留生長均勻一致的幼苗，當(dāng)植株長至2葉1心時對幼苗進(jìn)行低溫脅迫試驗。將幼苗放在8 ℃的人工培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理，在脅迫24 h后取出，轉(zhuǎn)入正常溫度的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。在低溫脅迫12、24 h時選取生長發(fā)育一致的植株，測定處理與對照完全展開的第2片真葉的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，并測定低溫解除后第2片真葉的保護(hù)性酶活性，重復(fù)3次。

1.2 測定方法

1.2.1 發(fā)芽率的測定

記錄各處理在相同時間段內(nèi)的發(fā)芽情況，以胚芽鞘長度大于1 mm記為發(fā)芽，培養(yǎng)7～10 d后，記錄發(fā)芽種子數(shù)。發(fā)芽率計算公式為

發(fā)芽率=發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)×100%。

1.2.2 生理生化指標(biāo)的測定

采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法測定棉種活力。稱取0.5 g幼苗葉片放入研缽中，加入0.1 mol/L pH值為7.8的磷酸緩沖液冰浴研磨后導(dǎo)入離心管中，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，取上清液冷藏備用。采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛（MDA）含量，考馬斯亮藍(lán) G-250 染色法測定可溶性蛋白質(zhì)含量[17]。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

采用PAM-2100便攜式調(diào)制熒光儀和2030-B光適應(yīng)葉夾測定葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。將棉花幼苗遮光處理30 min后取下葉片，調(diào)整葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)并設(shè)定工作參數(shù)，測定葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線，獲取F0、ΦPSⅡ、Fv/Fm、NPQ和ETR等葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計，SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析，Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)元素引發(fā)對低溫脅迫下棉種發(fā)芽率的影響

由圖1可知，與CK處理相比，在低溫脅迫下棉種經(jīng)過營養(yǎng)元素引發(fā)后，發(fā)芽率明顯提高，而水引發(fā)以W2處理效果較好，與CK處理呈顯著性差異。營養(yǎng)元素引發(fā)以N3處理效果最好，其發(fā)芽率為50%，與CK、W1、W2處理差異顯著。在低溫脅迫下，各處理的發(fā)芽率表現(xiàn)為N3處理>N1處理>W2處理>N2處理>CK處理>W1處理。

2.2 營養(yǎng)元素引發(fā)對低溫脅迫下棉花種子活力的影響

由圖2可知，在低溫脅迫下，經(jīng)營養(yǎng)元素引發(fā)的棉花種子活力與CK處理相比提高16%～34%;與水引發(fā)（W1、W2處理）相比，提高9%～27%，差異均顯著。在營養(yǎng)元素引發(fā)處理中以N2處理的種子活力最高，為82%。

2.3 營養(yǎng)元素引發(fā)對低溫脅迫下棉花幼苗MDA含量、POD活性及可溶性蛋白含量的影響

2.3.1 營養(yǎng)元素引發(fā)對低溫脅迫下棉花幼苗MDA含量的影響

MDA含量在植物衰老和抗性生理研究中，體現(xiàn)細(xì)胞膜系統(tǒng)的膜脂過氧化和細(xì)胞分隔化程度[4]。由圖3可知，冷害脅迫后，營養(yǎng)元素引發(fā)處理組的MDA含量顯著低于對照組，其中N3處理的MDA含量最低，為1.741 nmol/g。表明營養(yǎng)元素引發(fā)能降低棉花幼苗葉片內(nèi)的MDA含量，緩解低溫脅迫導(dǎo)致的膜脂過氧化傷害，維持細(xì)胞的正常代謝。

2.3.2 營養(yǎng)元素引發(fā)對低溫脅迫下棉花幼苗POD活性的影響

植物體中含有大量活性較高的過氧化物酶，與超氧化物歧化酶（SOD）、 過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶構(gòu)成植株體內(nèi)主要的活性氧清除系統(tǒng)，其活性可作為組織老化的一種生理指標(biāo)[18]。從圖4可以看出，處理組的POD活性均顯著低于對照組，其中N2處理最低，為0.266 U/（g·min）。說明在冷害脅迫下，營養(yǎng)元素引發(fā)組棉花幼苗體內(nèi)的POD活性低于對照組，可見營養(yǎng)元素引發(fā)可緩解植株在低溫脅迫下的老化速度。

2.3.3 營養(yǎng)元素引發(fā)對低溫脅迫下棉花幼苗可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是細(xì)胞中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)，其增加和積累均能提高細(xì)胞的保水能力，對細(xì)胞生命物質(zhì)和生物膜具有一定的保護(hù)作用[19]。由圖5可知，在低溫脅迫下，營養(yǎng)元素引發(fā)處理中只有N2處理的可溶性蛋白含量低于W1、W2處理，高于CK處理，且與CK處理差異顯著;N1、N3處理的可溶性蛋白含量較高，分別為0.471、0.460 mg/g，高于其他處理，進(jìn)一步說明營養(yǎng)元素引發(fā)提高了幼苗體內(nèi)的可溶性蛋白含量，保護(hù)了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。

2.4 營養(yǎng)元素引發(fā)對低溫脅迫下棉花幼葉葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

葉綠素?zé)晒庾鳛檠芯抗夂献饔米兓奶结?，主要通過分析各種熒光參數(shù)來獲知有關(guān)光能利用途徑信息。從表1、表2可以看出，隨著冷害脅迫時間的增加，葉片的熒光參數(shù)總體呈降低趨勢，其中營養(yǎng)元素引發(fā)組與對照組的NPQ和ΦPSⅡ無明顯差異;冷害脅迫12、24 h后，營養(yǎng)元素引發(fā)處理的F0值分別比CK處理低0.077～0.143、0.082～0.125;營養(yǎng)元素引發(fā)組的Fv/Fm、ETR、NPQ和ΦPSⅡ高于CK組7%～17%，且處理后的ETR顯著提高。

3 討論

溫度為影響種子萌發(fā)的一個重要因素。適宜的生長溫度能為種子提供良好的萌發(fā)環(huán)境[20];研究表明，棉花種子萌發(fā)的最適溫度為28 ℃左右，25 ℃是種子萌發(fā)最適溫度的下限，種子萌發(fā)的最低溫度為10.5～12.0 ℃。隨著溫度的降低，棉種的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子活力等均呈下降趨勢[21]。營養(yǎng)元素作為作物生長發(fā)育過程中不可或缺的無機(jī)元素，在種子萌發(fā)過程中起著一定的調(diào)節(jié)作用[7]。侯典云等研究表明，一定濃度的Mn處理促進(jìn)了小麥種子萌發(fā)及幼苗生長[15]。程昕昕等采用Mn2+、Zn2+、K+營養(yǎng)元素處理種子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組種子的發(fā)芽勢與對照差異顯著[7]。本試驗結(jié)果表明，在低溫脅迫下，棉種經(jīng)過營養(yǎng)元素引發(fā)后，與對照組相比，N1、N3處理發(fā)芽率與種子活力顯著提高，其中以N3處理引發(fā)效果最好，發(fā)芽率為50%，與前人研究結(jié)果[22]相一致，表明營養(yǎng)元素引發(fā)對種子萌發(fā)過程具有一定的調(diào)節(jié)作用，可以提高種子的萌發(fā)特性。

種子在萌發(fā)過程中快速吸脹后，低溫脅迫會破壞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，增大質(zhì)膜的通透性，造成細(xì)胞內(nèi)糖、氨基酸和核苷酸等物質(zhì)外滲，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂[23]?；钚匝酰≧OS）代謝平衡被打破后，出現(xiàn)大量具有高度氧化活性的ROS，細(xì)胞膜系統(tǒng)遭到嚴(yán)重破壞，引起不飽和脂肪酸過氧化生成MDA。為了降低自由基對細(xì)胞造成的傷害，可通過增加植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，降低細(xì)胞滲透勢，提高植物自身適應(yīng)逆境的能力，同時形成與植物細(xì)胞相對應(yīng)的保護(hù)系統(tǒng)[24]。適量的營養(yǎng)元素處理可以增強(qiáng)植物幼苗抗氧化系統(tǒng)中的酶活性，降低MDA含量[7]。本試驗表明，在低溫脅迫下，經(jīng)營養(yǎng)元素引發(fā)，棉苗的MDA含量、POD活性降低，可溶性蛋白含量增加，說明營養(yǎng)元素引發(fā)可加強(qiáng)細(xì)胞膜的自我保護(hù)能力，降低膜系統(tǒng)過氧化程度，加強(qiáng)細(xì)胞中ROS清除能力，進(jìn)而使其抗低溫能力得到提高。

對喜溫植物而言，低溫降低了生化代謝過程中的酶活性，提高了光系統(tǒng)發(fā)生光抑制的可能性，破壞了植物的光合機(jī)構(gòu)[25]。植物在受到冷害脅迫時，光合速率與冷害脅迫的持續(xù)天數(shù)及恢復(fù)時長有關(guān)[5]。前人研究表明，棉花經(jīng)低溫脅迫處理后，線性電子傳遞和二氧化碳固定能力降低，積累PSⅡ反應(yīng)中心過剩激發(fā)能[26]。肖飛等研究表明，棉花經(jīng)低溫處理后，葉片光合系統(tǒng)的Fv/Fm、qP、ETR及Y（Ⅱ）持續(xù)降低，棉花葉片光合作用強(qiáng)度降低，PSⅡ發(fā)生嚴(yán)重的光損傷[27]。本試驗表明，隨著低溫脅迫時間的延長，棉花幼葉的熒光參數(shù)整體呈現(xiàn)降低趨勢，營養(yǎng)元素引發(fā)組與對照組的NPQ和ΦPSⅡ間無明顯差異;N2、N3處理的F0、Fv/Fm、ETR與CK處理達(dá)顯著性差異水平，且ETR顯著提高。表明經(jīng)營養(yǎng)元素引發(fā)后，棉花幼苗在低溫脅迫下的自我保護(hù)能力增強(qiáng)，通過提高熱耗散消耗過多激發(fā)能來適應(yīng)低溫脅迫環(huán)境，具有更好的光化學(xué)性能。

4 結(jié)論

在低溫脅迫條件下，棉種經(jīng)過營養(yǎng)元素引發(fā)后，N1、N3處理發(fā)芽率、種子活力均得到提高，其中以N3處理效果最優(yōu);棉花幼苗在冷害脅迫下，營養(yǎng)元素引發(fā)組棉苗保護(hù)性酶活性與對照組有明顯差異，MDA含量、POD活性顯著降低，可溶性蛋白含量提高;低溫脅迫12 h后，營養(yǎng)元素引發(fā)組幼苗葉片的F0、ETR、ΦPSⅡ與CK處理差異顯著;低溫脅迫24 h后，營養(yǎng)元素引發(fā)組棉花幼苗葉片的F0、NPQ均與CK處理呈顯著性差異。說明營養(yǎng)元素引發(fā)通過增強(qiáng)棉苗的保護(hù)性酶活性、降低膜系統(tǒng)過氧化，改善低溫脅迫下幼苗葉片的光化學(xué)性能，進(jìn)而提高棉花幼苗的抗低溫能力。

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