25羥基維生素D濃度及其受體基因多態(tài)性與兒童哮喘的相關(guān)性研究

朱莉，李建華，馬曉波

(平頂山市第二人民醫(yī)院兒科，河南 平頂山，467000)

兒童哮喘的發(fā)生嚴(yán)重影響了患兒的日常生活質(zhì)量。流行病學(xué)研究顯示，兒童哮喘的發(fā)病率可達(dá)334～555／10萬人左右[1]，臨床上合并有自身免疫性疾病的人群中，哮喘的發(fā)生率可進(jìn)一步上升[2]。不同的因素均可能影響局部呼吸道平滑肌的痙攣，導(dǎo)致哮喘的發(fā)生，特別是細(xì)胞因子等的改變，能夠通過加劇局部呼吸道黏膜上皮細(xì)胞的代謝、平滑肌的收縮、局部免疫平衡的紊亂等，從而促進(jìn)兒童哮喘的發(fā)生。25羥基維生素D能夠通過影響局部炎癥反應(yīng)、抑制自身免疫性損傷，穩(wěn)定T淋巴細(xì)胞免疫等，進(jìn)而參與到哮喘的發(fā)生過程中[3，4]。部分研究已經(jīng)探討并分析了25羥基維生素D在促進(jìn)哮喘發(fā)生過程中的作用，認(rèn)為25羥基維生素D的表達(dá)下降會增加哮喘易感性，導(dǎo)致哮喘治療不佳的重要因素[5，6]，但對于不同25羥基維生素SNP位點多態(tài)性的分析研究少見。為了進(jìn)一步揭示25羥基維生素D多態(tài)性在影響兒童哮喘發(fā)生過程中的作用，本次研究選取2016年1月至2017年12月在我院治療的哮喘患兒97例，探討了相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)及其與患者病情的關(guān)系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年12月在我院治療的哮喘患兒97例(觀察組)，其中輕度哮喘25例，中度哮喘40例，重度哮喘32。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)會呼吸學(xué)組制定的兒童哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡≤12歲；(3)患兒監(jiān)護(hù)人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院前1周有激素藥物治療史；(2)合并有代謝性疾病、結(jié)核、血液系統(tǒng)疾病、急慢性感染等疾病。同時選取100例健康兒童作為對照組，觀察組和對照組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表 1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 檢測方法 多態(tài)性檢測：取凍存的血清保存液體，按照10000r／min的離心速度進(jìn)行離心分離，每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，進(jìn)行裂解操作，4°C冰上采用無酶的RNA沖洗液進(jìn)行洗滌，再次10000r／min離心5min，得到RNA。混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70℃干浴3min，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60min，室溫放置5min使其完全溶解，使其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以βactin為模版，在反應(yīng)體系中加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得總體積達(dá)20ul，上機，反應(yīng)條件為：93℃2min、93℃ 1min、55℃2min，共40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物擴增后進(jìn)行基因多態(tài)性檢測：參考multiplexkit試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)使用說明，加入各位點對應(yīng)延伸引物進(jìn)行單堿基測序反應(yīng)。并在ABI1310(Life Technologies，美國)進(jìn)行電泳，結(jié)果用 GENEMAPPER軟件(Life Technologies，美國)進(jìn)行分析。清晨采集空腹靜脈血，1000r／min 離心 10min，-20℃保存待測，采集標(biāo)本后1周內(nèi)檢測25-(OH)-VD水平。采用電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀(美國雅培i2000)及試劑盒，檢測試劑盒購自福建新大陸生物技術(shù)有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計分析采用SPSS19.0軟件，計量資料采用()表示，兩組間比較使用t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料比較使用x2檢驗；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析?；蛐皖l率遺傳平衡采用Hardy-Weinberg平衡檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對照組25-(OH)-VD水平 觀察組25-(OH)-VD明顯低于對照組，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表 2。

表2 觀察組和對照組25－(OH)－VD水平

2.2 觀察組不同病情患兒25-(OH)-VD和肺功能比較 重度患兒25-(OH)-VD、FEV1和FVC明顯低于中度和輕度患兒(P＜0.05)；中度患兒25-(OH)-VD、FEV1和FVC明顯低于輕度患兒(P＜0.05)。見表3。

2.3 相關(guān)性分析 將哮喘患兒25-(OH)-VD與肺功能進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示25-(OH)-VD與FEV1、FVC 呈正相關(guān)(r=0.403 和 0.322，P＜0.05)。

2.4 觀察組和對照組VDR基因SNP位點基因型和等位基因分布 觀察組和對照組SNP位點rs2228570、rs1544410和 rs2282679符合 Hardy-Weinberg平衡檢驗；觀察組和對照組SNP位點rs2228570和rs2282679基因型和等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；觀察組和對照組SNP位點1544410基因型和等位基因分布為10.31%比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表4、表5和表6。

3 討論

兒童哮喘的發(fā)生可以導(dǎo)致心血管不良臨床結(jié)局的產(chǎn)生，從而加劇患者遠(yuǎn)期生存的惡化，增加病死率及致殘率。近年來雖然在兒童哮喘的治療或者康復(fù)等方面取得了一定的效果，但其治療總體有效率或者病情緩解率等指標(biāo)均無明顯改善[7]。本次探討了25羥基維生素D濃度及其受體基因多態(tài)性及其與哮喘患者病情的關(guān)系，具有下列幾個方面的現(xiàn)實意義：(1)能夠為哮喘的生物學(xué)治療提供理論基礎(chǔ)，為改善哮喘的急性期哮喘癥狀、改善肺通氣或者肺換氣等提供理論基礎(chǔ)；(2)能夠為哮喘治療后的臨床預(yù)后評估提供新的指標(biāo)。

25羥基維生素D在結(jié)合糖蛋白配體后，可以促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)的三磷酸腺苷信號通路的激活，抑制細(xì)胞炎癥因子如IL-6或者腫瘤壞死因子的激活等，減輕炎癥因子對于支氣管平滑肌的浸潤，保護(hù)平滑肌細(xì)胞膜的完整性[8]；25羥基維生素D包含了多個可結(jié)合巰基的末端羧基結(jié)構(gòu)，其與平滑肌細(xì)胞膜上鈣離子內(nèi)流通道的結(jié)合，能夠降低鈣離子內(nèi)流，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌一氧化氮，促進(jìn)平滑肌的擴張[9，10]。25羥基維生素D多態(tài)性的改變，能夠影響25羥基維生素D的生物學(xué)活性并抑制谷胱甘肽芳基轉(zhuǎn)移酶的活性，減輕氧化應(yīng)激性損傷和線粒體或者氧化自由基對于平滑肌、黏膜組織的浸潤作用[11，12]。已經(jīng)證實的是，25羥基維生素D濃度對于兒童哮喘的發(fā)生、治療結(jié)局、臨床預(yù)后等均具有一定的影響，但對于SNP位點rs2228570和rs2282679等基因型或者等位基因的研究不足。

本次研究通過相關(guān)指標(biāo)的血清學(xué)水平的檢測分析發(fā)現(xiàn)，25-(OH)-VD在哮喘兒童中的表達(dá)濃度可顯著下降，從機制上考慮25-(OH)-VD的表達(dá)對于兒童哮喘的影響主要考慮與下列幾個方面有關(guān)[13，14]：(1)25-(OH)-VD的低表達(dá)會促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞小氣道的狹窄，過度下降的25-(OH)-VD失去了其對于鈣離子通道的穩(wěn)定作用，導(dǎo)致平滑肌的持續(xù)性處于氧化應(yīng)激狀態(tài)；(2)25-(OH)-VD的低表達(dá)失去了其對于患者局部T淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)控作用，導(dǎo)致病毒感染等誘導(dǎo)的平滑肌痙攣更為顯著。趙宏霞等[15]研究者在探討分析了73例哮喘兒童的血清學(xué)資料，發(fā)現(xiàn)25-(OH)-VD的表達(dá)濃度可平均下降25%以上，同時患兒的病情嚴(yán)重程度越高、治療后的病情緩解率越低，25-(OH)-VD的表達(dá)下降越為顯著。在不同的哮喘病情中可以發(fā)現(xiàn)哮喘的嚴(yán)重程度越高，25-(OH)-VD的表達(dá)下降越為明顯，提示了25-(OH)-VD與哮喘病情嚴(yán)重程度間的關(guān)系，這主要由于25-(OH)-VD對于哮喘病情進(jìn)展過程中平滑肌細(xì)胞的收縮狀態(tài)的調(diào)控作用有關(guān)。但也有研究認(rèn)為25-(OH)-VD的表達(dá)只與哮喘的發(fā)生有關(guān)，而與哮喘的病情無顯著性關(guān)系，存在相關(guān)結(jié)論差別的原因主要考慮與臨床病例的發(fā)病病程、基礎(chǔ)性治療措施等的差別有關(guān)。在探討25-(OH)-VD與肺功能的關(guān)系過程中發(fā)現(xiàn)可見，25-(OH)-VD與FEV1、FVC呈正相關(guān)，這主要由于25-(OH)-VD通過改善肺通氣或者肺換氣過程而影響到第一秒呼氣末期容積。最后，本文在探討25羥基維生素D的基因多態(tài)性的過程中發(fā)現(xiàn)，SNP位點1544410基因型和等位基因分布存在顯著的差別，其中GA或者A等位基因的比例明顯上升，提示GA或者A等位基因的差別可能是影響到25羥基維生素D多態(tài)性的主要位點。

表3 觀察組不同病情患兒25－(OH)－VD和肺功能比較

表4 觀察組和對照組rs2228570位點基因型和等位基因分布比較

表5 觀察組和對照組rs1544410位點基因型和等位基因分布比較

表6 觀察組和對照組rs2282679位點基因型和等位基因分布比較

綜上所述，哮喘患兒血清25-(OH)-VD水平降低，與肺功能呈正相關(guān)，其VDR基因rs1544410多態(tài)性與兒童哮喘存在一定的相關(guān)性。