全外顯子組測序在德朗熱綜合征診斷中的應(yīng)用

楊黎明，張華，袁路，譚鑫，張富青

(鄭州市婦幼保健院，河南 鄭州45000)

德朗熱綜合征 (Cornelia de Lange syndrome，CdLS)是一種罕見的、多為散發(fā)的、常累及多個(gè)器官及組織的遺傳性疾病。其典型特征為特殊面容、生長遲滯(宮內(nèi)及出生后)、多毛癥、上肢缺陷。IQ值介于30～102之間，很多患者有自閉及自我傷害的傾向。該疾病在人群中的發(fā)病率大概為1/10000，目前認(rèn)為沒有種族和性別差異[1]。

1 材料與方法

1.1 材料 患兒，女，1天 G39+2周，因臀位剖宮產(chǎn)娩出，羊水III度污染，阿氏評(píng)分1分鐘8分，皮膚顏色，呼吸各扣1分。患兒系第1胎第1產(chǎn)，臍帶短、細(xì)，胎盤小，出生體重1800g，因足月兒小于胎齡急診轉(zhuǎn)入我院重癥監(jiān)護(hù)室。體格檢查，（見圖1）：身長 39cm，頭圍 30.5cm，胸圍 30.5cm；足月小樣貌，發(fā)育異常，營養(yǎng)差，神志清，精神反應(yīng)欠佳；顱面部畸形：弓形眉(一字眉)，濃眉，睫毛長，鼻梁扁平而寬，人中長；肢體畸形：四肢短小，梭形手，手指及腳趾指端短小，雙手指關(guān)節(jié)異常(只有2個(gè)指節(jié))，四肢肌張力高；全身多毛，喂養(yǎng)困難(多次嘔吐)。B超提示動(dòng)脈導(dǎo)管未閉，卵圓孔未閉。患兒父親23歲，母親22歲，均體健，家族中無遺傳病史，無血液病，精神病史，無傳染性家族史。母孕早期感冒一次，具體服藥情況不詳；血糖血壓正常，孕期圍產(chǎn)保健情況不詳。根據(jù)臨床資料，懷疑Cornelia de Lange綜合征。

1.2 方法 考慮到可能合并有其他的遺傳病，經(jīng)與患者父親溝通同意后，取患兒外周血進(jìn)行全外顯子組基因測序(WES)以及拷貝數(shù)變異(CNV)檢測。如果發(fā)現(xiàn)陽性突變，則采集患兒父母外周血進(jìn)行Sanger測序技術(shù)驗(yàn)證突變位點(diǎn)，以確定該突變是否為新發(fā)突變。CNV檢測主要用于檢測染色體非整倍體或100Kb以上已知的、明確的致病基因拷貝數(shù)變異。

圖1 患兒外觀

外顯子組是指基因組中全部外顯子區(qū)域的集合，它(人類基因組的蛋白編碼區(qū)域)代表不到2%的人類基因組，卻包含約85%的已知致病變異[2]。全外顯子組基因測序(WES)是指運(yùn)用目標(biāo)序列捕獲技術(shù)將全基因組中的全部外顯子序列捕獲并進(jìn)行高通量測序，一次檢測人類基因組中約20,000個(gè)目標(biāo)基因的分析方法。它只對(duì)基因組的編碼區(qū)域進(jìn)行測序，這樣便將資源集中到最可能會(huì)影響表型的基因，因此能夠縮短周轉(zhuǎn)時(shí)間和節(jié)約成本。對(duì)單個(gè)和多個(gè)個(gè)體的全外顯子測序是尋找罕見病、復(fù)雜病或孟德爾病致病變異的常用方法。研究發(fā)現(xiàn)NGS技術(shù)所測得的變異中有多達(dá)2%難于重復(fù)，因此需要使用Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證[3]。Sanger測序法的優(yōu)勢是其測序讀長能夠達(dá)到1,000bp，并且測序的準(zhǔn)確率高達(dá) 99.999%[4]。

2 結(jié)果

德朗熱綜合征可分為[5]：I型：標(biāo)準(zhǔn)型，患者具有典型的顱面部特征，骨骼異常改變，宮內(nèi)發(fā)育遲緩，中度到重度精神運(yùn)動(dòng)遲滯，若伴有嚴(yán)重畸形導(dǎo)致死亡。II型：溫和型，患者具有與類型I相似的面部特征，輕度至臨界精神運(yùn)動(dòng)遲滯，程度較輕的宮內(nèi)和產(chǎn)后發(fā)育遲緩，沒有嚴(yán)重畸形或畸形程度不如I型 。III型：擬CdLS，患者具有類似CdLS的表型，主要由于染色體非整倍體改變或暴露于致畸環(huán)境中所致。

2.1 CNV結(jié)果 未檢出染色體非整倍體或100Kb以上已知的、明確的致病基因拷貝數(shù)變異(CNVs)。2.2全外顯子組檢測結(jié)果顯示 根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)指南(Richards et al,2015)，提示基因NIPBL的c.5567G＞T突變?yōu)橐粋€(gè)致病突變位點(diǎn)。該突變發(fā)生在Armadillo-like helical功能結(jié)構(gòu)域，在進(jìn)化上保守，具有潛在的功能影響；經(jīng)SIFT和Polyphen等對(duì)其進(jìn)行蛋白功能預(yù)測，結(jié)果顯示為有害，且對(duì)該致病位點(diǎn)進(jìn)行了Sanger測序驗(yàn)證。因此，該患兒確診為德朗熱綜合征I型患者。該突變在其父母標(biāo)本中均未發(fā)現(xiàn)，是一個(gè)新發(fā)突變。如下圖基因序列所示：BE0596為患兒，BE0596F為父親，BE0596M為母親；患兒NIPBL：NM_133433.3：exon29：c.5567G＞T：p.R18561，父母均正常。見圖2、圖3。

圖2 WES技術(shù)檢測結(jié)果

圖3 WES技術(shù)檢測基因序列分析

3 討論

德朗熱綜合征又名阿姆斯特丹侏儒癥，是一類多器官發(fā)育畸形的遺傳病。該病的臨床表現(xiàn)[1]：(1)宮內(nèi)及產(chǎn)后生長發(fā)育遲緩(68%)；(2)肌張力高(100%)；(3)顱面部畸形睫毛長且卷曲(99%)、多毛癥(78%)、濃眉連眉(98%)、扁平鼻梁(85%)，人中長而扁平(94%)，上唇薄而下翻(94%)，鄂弓高(86%)；(4)骨骼異常上肢異常多于下肢異常，也可見四肢均短小(93%)，小手、小腳，指關(guān)節(jié)異常,第5指側(cè)彎(74%)；5)胃食管反流，喂養(yǎng)困難。 Kline 等[6]報(bào)道了CdLS患者的先天畸形包括：厚而粗的睫毛(99%)，連眉、弓形眉(98%)，長人中(94%)，小手和腳有細(xì)尖(90%)等。Mingyan Hei等[7]研究報(bào)道的20例中國德朗熱綜合征患者的臨床特征也證實(shí)了這些特征的發(fā)生頻率大致相同。Sielicka D等[8]研究也報(bào)道其特殊面容：弓形眉、連體眉、長人中、耳位低、上唇薄，顎/頜小。本例患者的臨床表現(xiàn)中存在生長發(fā)育遲緩、顱面部畸形、多毛癥、濃眉連眉指關(guān)節(jié)異常以及喂養(yǎng)困難與CdLS的癥狀相符，且基因檢測也進(jìn)行了確診。

約65%的CdLS患者主要是由以下幾個(gè)基因突變導(dǎo)致[9]，NIPBL(5p13.2)占 50%～60%，SMC1(Xp11.2)及 SMC3(10q25)占 5%左右；此外，RAD21和HDAC8也是導(dǎo)致CdLS的常見致病基因。Krantz ID等[10]的研究也證實(shí)，60%病例為NIPBL基因突變，少部分為SMC1、SMC3基因突變。NIPBL基因突變的患者比非NIPBL基因突變患者表型更嚴(yán)重，患者生長發(fā)育遲緩、上肢畸形及語言發(fā)育遲緩都更加顯著[9-12]。該患兒屬于NIPBL的基因位點(diǎn)c.5567G＞T突變，且是一個(gè)致病突變位點(diǎn)。其遺傳方式分為2種：常染色體顯性遺傳(NIPBL、SMC3)，X連鎖顯性遺傳(SMC1)。超過99%的CdLS都是散發(fā)病例，是由新發(fā)突變導(dǎo)致的。該患兒父母檢測結(jié)果均正常，屬于新發(fā)突變。目前，國內(nèi)報(bào)道的基因突變病例均為NIPBL基因發(fā)生突變[13]。如果父母為NIPBL導(dǎo)致的患者，則其后代均有50%的發(fā)病率；若父母為正常個(gè)體，則先證者的同胞患病率為0.5-1.5%。該患者基因檢測采用全外顯子組測序的方法進(jìn)行。由于其對(duì)目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度更高，有利于基因變異的檢出，提高遺傳疾病的診斷率。2016年NATURE發(fā)表的一項(xiàng)前瞻性的全外顯子組測序的評(píng)估[14]，此篇文獻(xiàn)結(jié)果顯示，其診斷陽性率可高達(dá)57.5%，相對(duì)于傳統(tǒng)方法提高4成的診斷率；32.6%檢測陽性的患者，因此調(diào)整了治療方式，對(duì)他們的生活質(zhì)量或者生命延長可有實(shí)質(zhì)性的幫助。因此，專家認(rèn)為全外檢測已可成熟應(yīng)用在兒科,且建議針對(duì)疑似單基因疾病的患者，應(yīng)把全外當(dāng)成第一線檢測工具。2016年一篇發(fā)表在《European Journal of Human Genetics》上的文章顯示[15]，全外顯子組測序?qū)ξ创_診疾病的診斷率比經(jīng)典遺傳診斷方法還高。鑒于本例的報(bào)道，以及疑似單基因遺傳病的患兒，全外顯子測序應(yīng)是一項(xiàng)查找病因，提高確診率的良好手段。另外，如檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，父母也有攜帶變異基因，可提示父母于再生育時(shí)做相關(guān)基因的檢測,避免患兒再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。