一種基于N基因的麻疹病毒實時熒光RT-PCR檢測技術(shù)

文奇 ，付倩 ，宋利軍 ，劉琴 ，周郡 ，張艷妮

(1.新余市疾病預防控制中心，江西 新余 338000；2.江西省疾病預防控制中心，江西 南昌 330029)

目前麻疹病例的實驗室診斷方法有：急性期血清中檢出麻疹IgM抗體，恢復期相比急性期血清中麻疹IgG抗體陽轉(zhuǎn)或滴度呈4倍以上增高，鼻咽拭子或尿液中分離到麻疹病毒或檢出麻疹核酸[1]。ELISA法檢測麻疹IgM抗體和RT-PCR方法檢測麻疹核酸因具有操作簡便、快速等優(yōu)點被國內(nèi)外實驗室普遍采用。然而免疫功能低下的患者或在發(fā)病初期，尤其發(fā)病1～3d內(nèi)血清IgM抗體滴度低致使陽性檢出率不高，病例診斷單純依賴IgM抗體結(jié)果不免帶來一定的漏檢[2，3]。RT-PCR檢測可以克服IgM抗體檢測的不足之處，已成為實驗室診斷的重要補充手段[4]。如今該技術(shù)發(fā)展到更高階段的實時熒光RT-PCR獲得越來越多人的青睞，許多商品化熒光RT-PCR試劑盒不斷被研發(fā)上市。本文擬引進一種以麻疹病毒N基因片段為檢測目標的熒光RT-PCR技術(shù)，通過與國產(chǎn)知名的熒光RT-PCR試劑盒、IgM抗體ELISA檢測試劑盒對比檢測2014年新余市所收集的麻疹疑似病例樣本，對其技術(shù)性能進行評估分析。

1 材料與方法

1.1 標本來源 按照 《全國麻疹監(jiān)測方案（2009版）》要求，縣、區(qū)CDC工作人員對轄區(qū)內(nèi)2014年出現(xiàn)的麻疹暴發(fā)疫情或散發(fā)的就診疑似病例，采集出疹前、后5日內(nèi)的鼻咽拭子置于北京友康生產(chǎn)的病毒運送培養(yǎng)基（VTM），同時采集出疹后28d內(nèi)的靜脈血分離出血清，所有樣本于冷藏條件下運送至市CDC麻疹實驗室，不能及時送檢的樣本冷凍保存。

1.2 病毒RNA提取 根據(jù)Qiagen公司的RNeasy Mini Kit 試 劑 盒 （Cat.No：74106，Lot No：145022097）說明書提取咽拭子樣本中的病毒RNA。

1.3 國產(chǎn)某熒光RT-PCR試劑盒檢測麻疹病毒核酸 按照該公司生產(chǎn)的麻疹病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法，Cat.No：BN238）說明書配備反應體系和擴增條件。反應液A(內(nèi)含引物與探針)17μl，反應液 B（混合酶）3μl，RNA 提取物 5μl；逆轉(zhuǎn)錄 50℃ 15min；預熱 95℃ 15min；變性 94℃ 15s，擴增55℃ 45s（FAM通道收集信號），40個循環(huán)，在ABI7300儀器（下同）上進行擴增。

1.4 熒光RT-PCR技術(shù)檢測麻疹病毒N基因 利用ABI公司的AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit（Cat No：AM1005）試劑盒進行反應體系配制，總體積為 25μl。 反應條件參照有關文獻[5，6]：46℃逆轉(zhuǎn)錄 10min，95℃預變性 10min，95℃變性15s，60℃延伸45s，共45個循環(huán)。N基因擴增選用Kimberly設計的引物和探針[7]，具體序列如下，MV-N3（1139-1160F）：5′-TGGCATCTGAACTCGGTATCAC-3′，MV-N3（1213-1190R）：5′-TGTCCTCAGTAGTATG CATTGCAA-3′，MV-N3 （1163-1187P）：5′-(FAM)CCGAGGATGCAAGGCTTGTTTCAGA-3′(BHQ1)，引物與探針委托上海sagon生物工程股份有限公司合成。

1.5 ELISA法檢測麻疹病毒IgM抗體 采用珠海海泰公司的麻疹病毒IgM抗體檢測試劑盒（ELISA捕獲法，Lot No：20140121）對患者血清進行檢測，經(jīng)酶標儀Anthos 2010讀取單波長A450nm值判斷結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0軟件進行卡方檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種熒光RT-PCR檢測結(jié)果分析 在47例麻疹疑似病例咽拭子樣本中，經(jīng)2種熒光RT-PCR檢測結(jié)果均為陽性、陰性的樣本數(shù)分別為11例、35例，經(jīng)國產(chǎn)某RT-PCR試劑盒檢測為陰性而擬引進RT-PCR檢測為陽性的樣本數(shù)只有1例。兩種熒光RT-PCR方法的陽性率分別為23.4%（11/47）、25.53%（12/47），差異無統(tǒng)計學意義，兩法總符合率為 97.87%（（11+35）/47），見表 1。

表1 麻疹疑似病例咽拭子2種熒光RT-PCR檢測結(jié)果分析

2.2 ELISA法與擬引進熒光RT-PCR檢測結(jié)果分析 47例麻疹疑似病例依次經(jīng)ELISA檢測血清IgM抗體和擬引進熒光RT-PCR檢測咽拭子N基因，檢測結(jié)果均為陽性、陰性的病例數(shù)分別為8例、35例，ELISA檢測結(jié)果為陰性而新熒光RTPCR檢測為陽性的病例數(shù)為4例。ELISA法與新RT-PCR法的檢測陽性率分別為17.02%（8/47）、25.53%（12/47），兩種方法檢測陽性率之間比較差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=28.12，P＜0.005），總符合率為 91.49%（（8+35）/47），見表 2。

表2 麻疹疑似病例血清IgM抗體、咽拭子N基因檢測結(jié)果分析

3 討論

麻疹病毒基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA，主要有6個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼核蛋白（N）、基質(zhì)蛋白（M）、血凝素蛋白（H）、融合蛋白（F）、磷蛋白和多聚酶，其中H、N基因變異最大[8]。根據(jù)H、N基因的序列特征，麻疹病毒被劃分為8個基因組和24個基因型[9-11]。文獻報道出來的有關檢測麻疹病毒熒光RT-PCR技術(shù)中，用以檢測的目標片段可以選取H或N基因上的序列，也可以是來源于F或M基因的[12-16]。Kimberly等人在研發(fā)以麻疹病毒H、N和F基因分別作為檢測目標的實時熒光RT-PCR方法中發(fā)現(xiàn)：相比于常規(guī)RT-PCR，這些熒光RT-PCR法在維持高水平的特異性和結(jié)果重復性的同時，具有更低的檢測下限，可達到10拷貝數(shù)/反應；并且在模擬檢測合成RNA時檢測H、F基因的熒光RT-PCR顯示出相同或更強的敏感性，在檢測臨床樣本時針對N基因的檢測方法反而具有最高的敏感性[7]。造成這種相背離現(xiàn)象的原因在于：在麻疹病毒感染細胞中，三者中N基因的mRNA是最為豐富的轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄梯度為N＞F＞H[17]。

盡管血清學檢測在基層實驗室得到了廣泛應用，其中檢測麻疹患者出疹后3～28d IgM抗體的ELISA方法擁有83～89%的靈敏度和95～100%的特異度[18]，但其局限性仍不可忽視。當出疹后過早地采集血清或檢測過程中IgG抗體分離不完全時可能引起假陰性結(jié)果；當血清中存在類風濕因子或者風疹、B19等病毒IgM抗體的干擾時可能造成假陽性結(jié)果[19]。在麻疹低流行區(qū)甄別散發(fā)病例，血清檢測結(jié)果出現(xiàn)難以下結(jié)論而不大可能采集到患者第二份（間隔數(shù)日）血樣的情況下，熒光RT-PCR技術(shù)不僅對血樣，還可以對鼻咽拭子、尿液、唾液等其他樣本進行核酸檢測，借以明確診斷。

本實驗室經(jīng)江西省疾控中心疾檢所推薦，引進一種檢測麻疹病毒N基因的熒光RT-PCR新技術(shù)，它包含的一套特定引物和探針，現(xiàn)已被納入到最新版的麻疹診斷標準（WS296-2017）。通過與國產(chǎn)某熒光RT-PCR試劑盒、IgM抗體ELISA檢測試劑盒對比驗證得知，在檢測陽性率（敏感性）方面，新熒光RT-PCR法和國產(chǎn)熒光RT-PCR試劑盒較高，ELISA法較低，其中兩種熒光RT-PCR方法之間的符合率非常高 (約為98%)。新熒光RTPCR技術(shù)的引入和運用，將有助于提高新余市麻疹實驗室的監(jiān)測技術(shù)水平，增強麻疹散發(fā)病例、不典型病例的發(fā)現(xiàn)力度，對本地區(qū)麻疹控制和消除工作具有重要意義。