云南重樓UPLC特征圖譜研究

文/高妍 李德旺 過(guò)立農(nóng) 馬雙成 劉杰 鄭健 昝珂

重樓為傳統(tǒng)中藥中常用的大宗藥材，在傣族、蒙古族、苗族、藏族等多個(gè)民族中具有悠久的藥用歷史，是云南白藥、宮血寧、重樓解毒酊等81 種中成藥的主要原料[1，2]。其味苦、微寒，有清熱解毒、消腫止血、涼肝定驚等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，重樓在抗腫瘤、抑菌消炎、抗病毒、止血、止痛鎮(zhèn)靜、免疫調(diào)節(jié)等方面具有很好的活性[3-7]。重樓藥材及飲片為《中國(guó)藥典》2015年版一部收載品種，為百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.或 七葉一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara的干燥根莖[2]。依據(jù)拉丁名檢索，七葉一枝花對(duì)應(yīng)于《中國(guó)植物志》1978年版的中華重樓。云南重樓的化學(xué)成分有甾體皂苷類(lèi)、甾醇、蛻皮激素、黃酮類(lèi)等。其中甾體皂苷研究較多，并認(rèn)為是重樓中最主要的活性物質(zhì)[8-12]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，重樓屬植物全世界有24 種，中國(guó)有19 種，各品種在原植物特征和藥材性狀上具有相似性，僅依據(jù)根莖鑒定難度較大。已有研究發(fā)現(xiàn)[13，14]，重樓的生長(zhǎng)環(huán)境遭到破壞，植物繁殖率低，資源再生較慢，各產(chǎn)區(qū)藥材蘊(yùn)藏量普遍下降。目前，在云南、四川等地已有規(guī)模較大的人工栽培基地[15-17]。前期研究發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)上重樓飲片多為云南重樓，且存在混偽品，例如以吉林延齡草充重樓飲片銷(xiāo)售的現(xiàn)象。因此，需要建立一種可以有效鑒別云南重樓的分析方法，以控制重樓藥材及飲片的質(zhì)量。

基于本課題組的前期研究基礎(chǔ)[8]，本研究通過(guò)收集云南重樓、華重樓及偽品飲片樣品，采用UPLC 法建立了云南重樓特征圖譜。同時(shí)，計(jì)算云南重樓、華重樓和偽品的相似度，并開(kāi)展聚類(lèi)分析和主成分分析。本方法可以為重樓藥材和飲片的鑒別和安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1.儀器與材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC型高效液相色譜儀（包括自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD 檢測(cè)器，柱溫箱，工作站）；ELMA P120H 型超聲波清洗器（德國(guó)ELMA 公司）；默克Milli-Q 純水系統(tǒng)；Mettler XS 105 Du 十萬(wàn)分之一天平（德國(guó)梅特勒公司）；Mettler AE240萬(wàn)分之一天平（德國(guó)梅特勒公司）。

1.2 材料

藥材：云南重樓（編號(hào)為1～10），華重樓（編號(hào)為11～13），偽品（編號(hào)為14～20），樣品經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院鄭健研究員鑒定，樣品信息見(jiàn)表1。

試藥：偽原纖細(xì)薯蕷皂苷（批號(hào)：Y19F7H9835， 純度98%）、重樓皂 苷H（ 批號(hào)：Y21A9H68360， 純度98%）、纖細(xì)薯蕷皂苷（批號(hào)：CF0227QC14，純度98%）和重樓皂苷Ⅴ（批號(hào)：Y19F7H9835，純度98%）由上海源葉生物科技有限公司提供；重樓皂苷Ⅶ（批號(hào)：111593-201604， 純度94%）、重樓皂苷Ⅵ（批號(hào)：111592-201604， 純 度98%）、重樓皂苷Ⅱ（批號(hào)：111591-201604，純度96.1%）、薯蕷皂苷（批號(hào)：111707-201703，純度91.4%）、重樓皂苷Ⅰ（批號(hào)：111590-201604，純度93.6%）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

試劑：甲醇（色譜純，Lot.152023，F(xiàn)isher公司）和乙腈（色譜純，Lot.150942，F(xiàn)isher 公司），水為默克Milli-Q制超純水。

2.方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液

分別精密稱(chēng)取偽原纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ對(duì)照品適量于1 ml 量瓶中，以甲醇定容至刻度，即得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于量瓶中，甲醇定容至刻度，即得對(duì)照品單標(biāo)溶液。

表1 云南重樓、華重樓、偽品樣品信息

2.1.2 供試品溶液

本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.5g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱(chēng)定重量，加熱回流30 分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）；以乙腈為流動(dòng)相A、水溶液為流動(dòng)相B 進(jìn)行梯度洗脫（表2）；流速0.3 ml/min，進(jìn)樣量10μl，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，記錄35 分鐘的色譜圖。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件，精密吸取同一供試品溶液（編號(hào)：2）連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次10 μl，所得特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均＜0.78%，特征峰的相對(duì)峰面積RSD 均＜2.28% （n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（編號(hào)2），于配制后的0、4、8、12、16、24 小時(shí)進(jìn)樣，所有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均＜1.13%、相對(duì)峰面積的RSD均＜2.56%（n=6），表明供試品溶液在配制后24 小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（編號(hào)：2）樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，依法測(cè)定，所得特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均＜0.96%，特征峰的相對(duì)峰面積 的RSD 均＜2.87%（n=6），結(jié)果表明本方法重復(fù)性較好。

2.4 特征圖譜

2.4.1 云南重樓特征圖譜的建立

取10 批云南重樓樣品（樣品1 ～10）粉末，精密稱(chēng)定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μl，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄35 分鐘的UPLC 色譜圖（ 圖1）。 采用ChemPattern 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件（北京科邁恩科技有限公司）對(duì)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，設(shè)定樣品1、3、7、10 為代表性圖譜生成共有模式圖，將其他樣品的色譜峰與共有模式圖進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成云南重樓的特征圖譜（圖2），計(jì)算樣品1 ～10 與特征圖譜的相似度，分別為0.72、0.83、0.74、0.75、0.73、0.72、0.74、0.70、0.70、0.83，各批云南重樓正品之間的相似度均大于0.70，說(shuō)明相似度良好。

表2 梯度洗脫程序

2.4.2 特征峰的標(biāo)定

根據(jù)10 批云南重樓的特征圖譜檢測(cè)結(jié)果，共標(biāo)定8 個(gè)特征峰，如圖2所示。經(jīng)過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，并結(jié)合DAD 光譜，可知1 號(hào)峰為偽原纖細(xì)薯蕷皂苷、2號(hào)峰為重樓皂苷Ⅶ、3 號(hào)峰為重樓皂苷H、4 號(hào)峰為重樓皂苷Ⅱ、5 號(hào)峰為薯蕷皂苷、6 號(hào)峰為纖細(xì)薯蕷皂苷、7 號(hào)峰為重樓皂苷Ⅰ、8 號(hào)峰為重樓皂苷Ⅴ。

2.4.3 華重樓與云南重樓特征圖譜比較

圖1 10 批云南重樓UPLC 疊加圖

圖2 云南重樓UPLC 特征圖譜

圖3 3 批華重樓UPLC 疊加圖

取不同批次的華重樓（樣品11～13）粉末，精密稱(chēng)定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄35 分鐘的UPLC 色譜圖（圖3），圖中主要包含3 個(gè)峰，其中1 號(hào)峰為重樓皂苷Ⅶ。華重樓與云南重樓特征圖譜的主要區(qū)別為：云南重樓中具有較高含量的薯蕷皂苷類(lèi)成分，如重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷和重樓皂苷Ⅰ，而華重樓幾乎不含上述成分。 采 用ChemPattern 化 學(xué)計(jì)量學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)算樣品11～13 華重樓與特征圖譜的相似度，分別為0.32、0.26、0.37，可見(jiàn)華重樓和云南重樓特征圖譜差異大，存在顯著不同。

2.4.4 偽品與云南重樓特征圖譜比較

取不同批次的偽品（樣品14～20）粉末，精密稱(chēng)定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄35 min的UPLC 色譜圖（圖4），圖中主要包含3 個(gè)峰，其中1 號(hào)峰為重樓皂苷Ⅶ，3 號(hào)峰為重樓皂苷Ⅵ。本實(shí)驗(yàn)中收集到的偽品與云南重樓特征圖譜的主要區(qū)別為：云南重樓同時(shí)含有重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷和重樓皂苷Ⅰ，而偽品幾乎不含上述成分。同時(shí)，重樓皂苷Ⅵ為偽品的主要成分，云南重樓和華重樓中幾乎不含該成分。采用ChemPattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)算樣品14～20 偽品與特征圖譜的相似度，分別為0.18、0.22、0.22、0.19、0.15、0.17、0.20，可見(jiàn)偽品和正品特征圖譜差異大，存在顯著不同，可用于重樓的鑒別和質(zhì)量控制。

圖4 7 批偽品UPLC 疊加圖

圖5 云南重樓、華重樓及偽品相似度分析

云南重樓、華重樓和偽品相似度分析見(jiàn)圖5。

2.4.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

將色譜儀采集的數(shù)據(jù)以＊.cdf格式導(dǎo)出，再導(dǎo)入ChemPattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件，對(duì)相應(yīng)的色譜峰進(jìn)行積分，按樣品對(duì)峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖6）和主成分分析（圖7）。如圖6和圖7所示，建立的特征圖譜方法采用聚類(lèi)分析和主成分分析均能夠?qū)⒃颇现貥呛推渌麡悠罚ㄈA重樓、偽品）分成2 組，進(jìn)一步，華重樓與偽品分為2 組，從而達(dá)到鑒別的目的。

3.討論

3.1 色譜條件的選擇

圖6 云南重樓、華重樓及偽品聚類(lèi)分析結(jié)果

圖7 云南重樓、華重樓及偽品主成分分析結(jié)果

本文選用UPLC 梯度洗脫法建立了云南重樓的特征圖譜，獲得了云南重樓化學(xué)成分的整體情況，35 分鐘內(nèi)完成分離。其主要成分偽原纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ的分離效果良好。通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器考察最適紫外吸收波長(zhǎng)時(shí)，綜合考慮8 個(gè)主要成分的最大吸收，最終選擇203 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 特征圖譜

10 批云南重樓UPLC 圖譜與特征圖譜之間的相似度均大于0.70，相似度良好，表明各批次云南重樓的化學(xué)成分種類(lèi)、比例相似，而3 批華重樓與特征圖譜之間相似度為0.26～0.37，說(shuō)明《中國(guó)藥典》規(guī)定的重樓兩個(gè)正品品種云南重樓和華重樓化學(xué)成分存在差異；7 批偽品UPLC 圖譜與特征圖譜之間相似度均小于0.22，相似度較低，與正品化學(xué)成分差異較大。由聚類(lèi)分析和主成分分析結(jié)果可知，兩種分析方式均能夠?qū)⒃颇现貥?、華重樓和偽品區(qū)分開(kāi)來(lái)。由此可見(jiàn)，本文建立的特征圖譜可以有效區(qū)分云南重樓、華重樓和偽品，可以為控制重樓質(zhì)量提供依據(jù)。

《中國(guó)藥典》2015 版一部以重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅷ為指標(biāo)成分對(duì)重樓藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，不能達(dá)到區(qū)分市場(chǎng)上云南重樓、華重樓和偽品的目的，尤其是以重樓投料生產(chǎn)的中成藥中，若摻入偽品，中成藥質(zhì)量將難以控制。本實(shí)驗(yàn)建立了云南重樓的特征圖譜以區(qū)分云南重樓、華重樓和偽品，為有效控制重樓質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。