多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠IL-2R、TNF-αR基因表達(dá)及血清IL-2水平的影響

周猛 梁園園 曲晨菲 翟藝 張濤 亓文倩 張競(jìng)競(jìng) 岳啟安

臨床上發(fā)生面頸部頑固性細(xì)菌感染的患者以青少年多見(jiàn)，該病對(duì)藥物耐藥性較強(qiáng)，易反復(fù)感染，缺乏理想的治療方法，嚴(yán)重影響青少年的身心健康。我們首次在臨床上使用多價(jià)葡萄球菌菌苗治療1 195 例面頸部頑固性細(xì)菌感染患者，一次性治愈率可達(dá)75%左右，具有較理想的治療效果[1]。為探討該藥物的作用機(jī)理，本研究分析多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠白細(xì)胞介素-2 受體（IL-2R）、腫瘤壞死因子受體（TNF-αR）基因表達(dá)及血清IL-2 水平的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 PCR 儀（TC-XP，博日科技），凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-1600R，上海天能），低溫離心機(jī)（Neofuge 13R，上海力申），-80℃超低溫冰箱（海爾），酶標(biāo)儀DNM-9602A（北京普朗新技術(shù)有限公司）。多價(jià)葡萄球菌菌苗[2～4]；RNA 提取與基因擴(kuò)增試劑盒購(gòu)于上海生工；檢測(cè)小鼠IL-2 的ELISA 試劑盒購(gòu)于青島捷世康公司；SD 昆明種小鼠購(gòu)于青島市藥檢所。

1.2 小鼠動(dòng)物試驗(yàn) 隨機(jī)選取健康SD 昆明種小白鼠40 只，體重22～24g，隨機(jī)分成4 組，雌雄混合，放飼養(yǎng)籠內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng)，喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)特制的混合飼料，并供應(yīng)充足的自來(lái)水。分為對(duì)照組、低劑量組（5 億個(gè)/ml 細(xì)菌）、中劑量組（10 億個(gè)/ml 細(xì)菌）、高劑量組（20 億個(gè)/ml 細(xì)菌），每組10 只小白鼠，小白鼠腹腔內(nèi)無(wú)菌注射，實(shí)驗(yàn)組按不同組別每只每次注射1ml菌液，正常對(duì)照組每只每次注射生理鹽水1ml。注射療程：1、3、6、9、14日為全療程，最后一次于第14天實(shí)驗(yàn)前1h 每組先注射無(wú)菌肉湯1ml，再注射細(xì)菌1ml（中劑量），并輕柔腹部，注射30min 后以頸動(dòng)脈放血方法處死。用小剪刀剪開(kāi)腹部，再用無(wú)菌小剪刀將小鼠脾臟和肝臟剪除，放電子天平的無(wú)菌玻璃紙上稱重，然后放-80℃超低溫冰箱保存。

1.3 RNA 提取 取脾臟組織塊（30～50mg）在玻璃勻漿器中研磨粉碎，將玻璃勻漿器加入1ml Trizol 抽打勻漿，移入1.5ml 離心管，用5ml 針頭抽打，冰上放置5min，放置4℃離心機(jī)，12 000r/min 離心5min。取上清液至1.5ml 新離心管，加0.2ml 氯仿，震蕩，冰上孵育5min，＜12 000r/min，4℃離心10min，取上清液移入1.5ml 新離心管，加0.5ml 異丙醇，震蕩，＜12 000r/min，4℃離心5min，棄去上清液，加入1ml 75%乙醇，震蕩，＜7 500r/min，4℃離心5min，棄去上清液，室溫下使之變透明，加入DEPC 水20μl 溶解RNA（放低溫冰箱保存）。

1.4 小鼠脾臟 IL-2R、TNF-αR 基因擴(kuò)增

1.4.1 RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 將1μg RNA 與1μl Oligo（dT）18 引物混合，65℃ 10min，冰浴1～2min，加入4μl 5×buffer、1μl dNTP（2.5mM）、Rnasin 1μl、逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl（20μl）、去離子水15.5μl。將上述反應(yīng)體系在42℃溫育60min，進(jìn)行cDNA 的合成，70℃ 5min 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，冰浴4min，-20℃保存。

1.4.2 PCR 擴(kuò)增 設(shè)計(jì)IL-2R 和TNF-αR 編碼基因的引物序列，IL-2R 上游引物：5'-AACGGCACCATC CTAAACTG-3'；IL-2R 下游引物：5'-ACACTCTGTC CTTCCACGAAA-3'；TNF-αR 上游引物：5'-GTTGT CAATTGCTGCCCTGT-3'；TNF-αR 下游引物：5'-T AATTTGCAAGCGGAGGAG-3'；β-actin 上游引物：5'-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3'；β-actin下游引物：5'-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3'。cDNA模板2μl加入10×buffer 5μl、1～4μl dNTP（2.5mM）、3μl MgCl2（25mM）、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq 酶0.2μl（5μl）、加去離子水補(bǔ)至50μl。在50μl的PCR 體系中加入石蠟油30～50μl，將反應(yīng)管置于PCR 儀內(nèi)，按下列條件進(jìn)行PCR 反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，共進(jìn)行42 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，用電泳儀測(cè)定PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定電泳產(chǎn)物條帶及產(chǎn)物含量。

1.5 用ELISA 法測(cè)定血清中IL-2 含量 免疫結(jié)束后，以無(wú)菌法分別取各組血液于無(wú)菌試管中，待血液凝固后2 000r/min 離心10min，取血清放低溫冰箱保存，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)用酶標(biāo)儀測(cè)定IL-2 的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組樣本間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠脾臟重量的影響 低劑量組、中劑量組和高劑量組與對(duì)照組比較，小鼠脾臟重量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），最佳劑量組為中劑量組，而低劑量組和高劑量組不但沒(méi)有增加脾重，反而抑制了脾重，見(jiàn)表1。

表1 多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠脾臟重量的影響（±s）

表1 多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠脾臟重量的影響（±s）

注：各劑量組分別與對(duì)照組比較

組別 數(shù)量（只） 脾重（g） t P對(duì)照組 10 0.052±0.011低劑量組 10 0.035±0.001 -3.89 ＜0.05中劑量組 10 0.498±0.068 22.63 ＜0.05高劑量組 10 0.030±0.003 -5.429 ＜0.05

2.2 多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠脾臟IL-2R 基因表達(dá)的影響 低劑量組、中劑量組和高劑量組與對(duì)照組比較，小鼠脾臟IL-2R 基因表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而中劑量組與低劑量組和高劑量組比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=34.20，P＜0.05；t=31.97，P＜0.05），以中劑量組效果最佳，見(jiàn)表2。

表2 多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠脾臟IL-2R 基因表達(dá)的影響（±s）

表2 多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠脾臟IL-2R 基因表達(dá)的影響（±s）

注：各劑量組分別與對(duì)照組比較

組別 數(shù)量（只） 灰值 t P對(duì)照組 10 1.54±0.03低劑量組 10 5.63±0.09 20.38 ＜0.05中劑量組 10 13.09±0.14 33.36 ＜0.05高劑量組 10 4.40±0.14 24.48 ＜0.05

2.3 多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠脾臟TNF-αR 基因表達(dá)的影響 低劑量組、中劑量組和高劑量組與對(duì)照組比較，小鼠脾臟TNF-αR 基因表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而中劑量組與低劑量組和高劑量組比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=47.96，P＜0.05；t=30.88，P＜0.05），以中劑量組效果最佳，見(jiàn)表3。

表3 多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠脾臟 TNF-αR 基因表達(dá)的影響（±s）

表3 多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠脾臟 TNF-αR 基因表達(dá)的影響（±s）

注：各劑量組分別與對(duì)照組比較

組別 數(shù)量（只） 灰值 t P對(duì)照組 10 1.50±0.10低劑量組 10 8.33±0.27 8.44 ＜0.05中劑量組 10 13.87±0.40 113.78 ＜0.05高劑量組 10 9.71±0.39 76.24 ＜0.05

2.4 多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠血清中IL-2 含量的影響 低劑量組、中劑量組和高劑量組與對(duì)照組比較，小鼠血清中IL-2 含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中劑量組與低劑量組和高劑量組比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.76，P＜0.05；t=7.14，P＜0.05），以中劑量組效果最佳，見(jiàn)表4。

表4 多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠血清IL-2 含量的影響（±s，ng/ml）

表4 多價(jià)葡萄球菌菌苗對(duì)小鼠血清IL-2 含量的影響（±s，ng/ml）

注：各劑量組分別與對(duì)照組比較

組別 數(shù)量（只） IL-2 含量 t P對(duì)照組 10 0.25±0.03低劑量組 10 0.34±0.03 10.28 ＜0.05中劑量組 10 0.36±0.03 15.65 ＜0.05高劑量組 10 0.29±0.02 4.44 ＜0.05

3 討論

面頸部頑固性細(xì)菌感染多由耐藥性葡萄球菌感染引起，由于多數(shù)致病性的葡萄球菌產(chǎn)生血漿凝固酶，使感染局部周圍的血漿發(fā)生凝固，藥物不易滲透到炎癥內(nèi)部，使局部或全身性抗生素治療效果不佳。在之前的研究中我們使用多價(jià)、不同比例、高濃度葡萄球菌菌苗對(duì)1 195 例頑固性頭頸部感染性皮膚病患者進(jìn)行治療，40d 為1 個(gè)療程，一次性治愈率達(dá)到75%左右，有效率達(dá)到95%以上，獲得了較理想的治療效果，深受青少年患者的歡迎[2～4]。經(jīng)多價(jià)葡萄球菌菌苗治療后效果明顯而持久，無(wú)明顯副作用。為探討該藥物的作用機(jī)理，本研究采用不同劑量的多價(jià)葡萄球菌菌苗免疫小鼠后，檢測(cè)小鼠脾臟重量，脾臟IL-2R、TNF-αR 基因表達(dá)及血清IL-2 含量的變化。經(jīng)過(guò)免疫后的3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，脾臟增重、IL-2R、TNF-αR 基因表達(dá)和血清中IL-2 濃度都以中劑量效果最顯著，中劑量組與其他各劑量組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），顯示具有明顯的劑量依賴關(guān)系。Th1 細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞毒性和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)型超敏性炎癥的發(fā)生，通過(guò)分泌IL-2 細(xì)胞因子促進(jìn)Th1 細(xì)胞進(jìn)一步增殖。因此，IL-2 在血清中含量增多，可以誘導(dǎo)活化T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞的增殖與分化，增強(qiáng)TC、NK 細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的活性，更有利于清除局部感染的病原菌，加快局部組織的修復(fù)[5～8]。同時(shí)IL-2 可作為治療腫瘤的輔助藥物[9～11]，提高人體免疫力，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。TNF-α是單核巨噬細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，除了具有抗腫瘤作用外，可在局部誘發(fā)炎癥作用和免疫調(diào)節(jié)作用，吸引中性粒細(xì)胞到炎癥局部，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用[12]。

本研究表明，多價(jià)葡萄球菌菌苗治療面頸部頑固性細(xì)菌感染，主要是增強(qiáng)了T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，通過(guò)增加血清IL-2 含量和脾臟IL-2R 基因的表達(dá)，更有利于刺激T 細(xì)胞的進(jìn)一步活化，產(chǎn)生更多的IL-2 釋放到體液中，提高了吞噬細(xì)胞的殺傷活性。TNF-αR 基因的表達(dá)可增強(qiáng)單核吞噬細(xì)胞分泌TNF-α細(xì)胞因子，誘發(fā)局部的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)作用，吸引中性粒細(xì)胞到炎癥局部，從而可以明顯增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫功能，提高炎癥局部的吞噬細(xì)胞數(shù)量和增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬功能，最終起到抗感染的作用。