三七總皂苷傳遞體凝膠劑的制備及其離體皮膚滲透性研究

陳思思 鄭杭生 錢麗梅 王俊

[摘要]目的 制備三七總皂苷（PNS）傳遞體凝膠劑，并對其體外皮膚滲透性能和滯留特性進(jìn)行考察。方法 采用薄膜分散法制備PNS傳遞體，再以卡波姆-940為基質(zhì)制備PNS傳遞體凝膠劑;對所制得的PNS傳遞體凝膠劑的穩(wěn)定性與安全性進(jìn)行初步評價;采用Franz擴(kuò)散池法對PNS傳遞體凝膠劑進(jìn)行體外透皮考察（以PNS脂質(zhì)體凝膠劑為對照組），分別于上樣后0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36 h取樣，同時于36 h體外透皮試驗完成后，取下離體皮膚用于PNS皮膚滯留量測定，以高效液相色譜法測定PNS的皮膚累積滲透量和皮膚滯留量。結(jié)果 本研究制得的PNS傳遞體凝膠劑中各成分的含量分別為：人參皂苷Rg1（1.82±0.13）mg/g、人參皂苷Re（0.33±0.05）mg/g、三七皂苷R1（0.57±0.10）mg/g及人參皂苷Rb1（1.58±0.07）mg/g（n=3）。PNS傳遞體凝膠劑為細(xì)膩半透明淺白色膠體，皮膚刺激性小，在低溫[（4±2）℃]和避光條件下穩(wěn)定性良好。PNS傳遞體凝膠劑中各成分的36 h皮膚累積滲透量分別為：人參皂苷Rg1（601.70±42.26）μg/cm2、人參皂苷Re（171.45±12.46）μg/cm2、三七皂苷R1（327.23±16.41）μg/cm2及人參皂苷Rb1（397.08±29.61）μg/cm2（n=4），約為PNS脂質(zhì)體凝膠劑的2.0～3.5倍。36 h后PNS脂質(zhì)體凝膠劑中各成分的皮膚滯留量分別為：人參皂苷Rg1（8.16±1.60）μg/cm2、人參皂苷Re（3.70±0.72）μg/cm2、三七皂苷R1（5.34±0.95）μg/cm2及人參皂苷Rb1（11.61±1.77）μg/cm2（n=4），約為PNS傳遞體凝膠劑的2.0～7.0倍。結(jié)論 PNS傳遞體凝膠劑質(zhì)量穩(wěn)定，能促進(jìn)藥物的皮膚滲透。

[關(guān)鍵詞]三七總皂苷;傳遞體;凝膠劑;體外透皮試驗

[中圖分類號] R283.6? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）8（c）-0007-07

[Abstract] Objective To prepare the Panax Notoginseng Saponins （PNS） Transfersome Gel and evaluate the transdermal permeation and skin deposition in vitro. Methods The PNS transfersomes were prepared by using the thin film dispersion method， and the Carbopol-940 was added as matrix for the preparation of the PNS Transfersome Gel. The stability and safety of the PNS Transfersome Gel was preliminary evaluated. In vitro transdermal experiments were done by Franz diffusion pool method and the PNS Liposome Gel was used as control group. Samples were taken in 0.5， 1， 2， 4， 6， 8， 10， 12， 24 and 36 hours after the preparation was loaded. And the in vitro skin was retained for the determination of the skin deposition quantity of the contents of PNS after the transdermal experiments. The skin cumulative permeated quantity and skin deposition quantity of the contents of PNS were determined by high performance liquid chromatography method. Results The contents of ginseng saponin Rg1， ginseng saponin Re， notoginsenoside R1 and ginseng saponin Rb1 of the PNS Transfersome Gel prepared in this study were （1.82±0.13）， （0.33±0.05）， （0.57±0.10） and （1.58±0.07） mg/g respectively （n=3）. The PNS Transfersome Gel had a promising appearance with low skin irritation. It was stable when protected from light and kept at low temperature （[4±2]℃）. The skin cumulative permeated quantity values of ginseng saponin Rg1， ginseng saponin Re， notoginsenoside R1 and ginseng saponin Rb1 of the PNS Transfersome Gel were （601.70±42.26）， （171.45±12.46）， （327.23±16.41） and （397.08±29.61） μg/cm2 （n=4） respectively after 36 hours， the assayed components in PNS Transfersome Gel were about 2.0-3.5 times of those in the PNS Liposome Gel. While the skin deposition quantity values of ginseng saponin Rg1， ginseng saponin， Re notoginsenoside R1 and ginseng saponin Rb1 of the PNS Liposome Gel were （8.16±1.60）， （3.70±0.72）， （5.34±0.95） and （11.61±1.77） μg/cm2 （n=4） respectively after 36 hours， the assayed components in PNS Liposome Gel were about 2.0-7.0 times of those in the PNS Transfersome Gel. Conclusion The PNS Transfersome Gel is stable and it can enhance the transdermal permeation efficiency of PNS.

[Key words] Panax Notoginseng Saponins; Transfersome; Gel; In vitro transdermal experiment

三七總皂苷（Panax Notoginseng Saponins，PNS）是中藥三七的主要有效成分，PNS主要包括人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re和三七皂苷R1等[1]。研究表明，PNS具有改善血液循環(huán)、消炎、鎮(zhèn)痛、改善記憶力和抗腫瘤等作用[2-5]。在臨床上，PNS已廣泛用于治療軟組織損傷，它可通過擴(kuò)張血管、改善血液循環(huán)、消炎止痛等作用，促使損傷部位的生理代謝功能、軟骨組織得以修復(fù)[6-7]。但目前PNS的市售劑型主要以口服和靜脈滴注制劑為主[1，8]，由于用藥后局部損傷部位的藥物濃度較低，當(dāng)這些制劑用于治療身體局部軟組織損傷時難以充分發(fā)揮療效，反而會增加其不良反應(yīng)的發(fā)生，而藥物皮膚應(yīng)用?？梢蕴岣哂盟幉课黄つw下局部組織的藥物濃度并有效降低藥物的不良反應(yīng)。

傳遞體（即柔性納米脂質(zhì)體）作為一種高效的經(jīng)皮給藥載體，其相較于普通脂質(zhì)體擁有更好的皮膚滲透性能[9-11]。近年來，傳遞體逐漸成為了國內(nèi)外經(jīng)皮給藥系統(tǒng)研究中的一大焦點[12-18]。本研究以薄膜分散法制備PNS傳遞體，并將其制成凝膠劑，然后對所制得的PNS傳遞體凝膠劑進(jìn)行質(zhì)量評價及離體皮膚滲透研究，為PNS新型透皮制劑的研究奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1儀器與試藥

1.1儀器

LC-2130高效液相色譜儀（上海天美公司）;LC-2030紫外檢測器（上海天美公司）;UV-1800紫外可見分光光度計（日本島津公司）;XL2000超聲破碎儀（美國MISONIX公司）;BX51光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯）;聚碳酸酯徑跡蝕刻膜（0.05 μm、0.1 μm，英國Whatman公司）;HOMOEX-25高壓膜擠出器（上海赫默仕機(jī)電科技有限公司）;5804R冷凍離心機(jī)（德國EPPENDORF公司）;10K離心超濾管（美國PALL公司）;Nano-ZS90激光粒度儀（英國Malvern公司）;JEM-1200EX型透射電子顯微鏡（日本Jeol公司）;TT-8D型藥物透皮吸收儀（天津市正通科技有限公司）。

1.2試藥

PNS（云南植物藥物有限公司，注射級，批號HB2 0081103）;人參皂苷Rg1對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度98.2%，批號110703-201426）;人參皂苷Rb1對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度93.7%，批號110704-201424）;人參皂苷Re對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度89.1%，批號110754-201322）;三七皂苷R1對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號110745-201015）;膽固醇（上海艾偉特醫(yī)藥科技有限公司，英文縮略語CH，注射級，批號B40333）;維生素E（浙江新和成股份有限公司，英文縮略語VE，批號V20171009）;大豆卵磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司，英文縮略語sbPC，注射級，PC≥70%，批號131002）;檸檬烯（吉安市聚鵬天然香料油有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.3%，批號為140825）;檸檬醛（吉安市聚鵬天然香料油有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97.5%，批號141006）;乙腈（美國Honeywell公司）為色譜純;高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）用水為雙蒸水;其余試劑均為分析純。

1.3實驗動物

清潔級SD大鼠的體重（180±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號SCXK滬2013-0016。所有動物實驗均按照浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物飼養(yǎng)和使用指南進(jìn)行。本研究已通過我校實驗動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與含量測定方法的建立

2.1.1色譜條件

色譜柱為CNW C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相為水（A）-乙腈（B），進(jìn)行梯度洗脫，梯度比例為：0～12 min，A：81%，B：19%;13～60 min，A：81%～64%，B：19%～36%;61～62 min，A：64%～0%，B：36%～100%。流速為1.0 ml/min;柱溫為30℃;檢測波長為203 nm;進(jìn)樣量為20 μl[18]。

2.1.2含量測定方法的建立

精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、三七皂苷R1及人參皂苷Rb1對照品適量，加入甲醇溶解并定容，制成人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、三七皂苷R1及人參皂苷Rb1四種成分的混合對照品儲備液。其中，人參皂苷Rg1的濃度為0.327 mg/ml，人參皂苷Re的濃度為0.0829 mg/ml，三七皂苷R1的濃度為0.0706 mg/ml，人參皂苷Rb1的濃度為0.325 mg/ml。

分別依次精密量取上述人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、三七皂苷R1及人參皂苷Rb1四成分的混合對照品儲備液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，用甲醇定容至5 ml，制得系列濃度的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、三七皂苷R1及人參皂苷Rb1四個成分的混合對照品溶液。其中，人參皂苷Rg1的濃度分別為13.1、32.7、65.4、131.0、196.0、262.0、327.0 μg/ml，人參皂苷Re的濃度分別為3.32、8.29、16.60、33.20、49.70、66.30、82.90 μg/ml，三七皂苷R1的濃度分別為2.82、7.06、14.10、28.20、42.40、56.50、70.60 μg/ml，人參皂苷Rb1的濃度分別為13.0、32.5、65.0、130.0、195.0、260.0、325.0 μg/ml。

按“2.1.1”項下的色譜條件進(jìn)樣進(jìn)行含量測定，以峰面積（A）為橫坐標(biāo)，濃度（C）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、三七皂苷R1及人參皂苷Rb1的回歸方程依次為：A=7621.8 C+4792.9（n=7），r=0.9998;A=3736.9 C+1493.6（n=7），r=0.9996;A=4717.9 C+117.54（n=7），r=0.9997;A=5520.4 C+5130.2（n=7），r=0.9998。表明人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、三七皂苷R1及人參皂苷Rb1的濃度分別在13.10～327.00、3.32～82.90、2.82～70.60、13.00～325.00 μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。日內(nèi)精密度RSD為1.62%（n=5），日間精密度RSD為1.71%（n=5）。

2.2統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3樣品的制備

2.3.1傳遞體和脂質(zhì)體的制備

2.3.1.1 PNS傳遞體的制備? 根據(jù)前期實驗成果所得最優(yōu)處方工藝制備PNS傳遞體[18]。處方工藝如下：稱取PNS 100 mg、CH 15 mg、sbPC 120 mg、VE 2 mg、中藥揮發(fā)油（檸檬烯∶檸檬醛=4∶1）80 mg，溶于35 ml甲醇：二氯甲烷（3∶4，V/V）混合溶劑中，轉(zhuǎn)移至500 ml茄形瓶中，在避光、45 ℃、50 r/min下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到干膜，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2 h以確保有機(jī)溶劑除盡，加入10 ml水化液[磷酸鹽緩沖液（PBS），pH為5.0，相對離子濃度為1/10]，振搖至水化完全，放置過夜后進(jìn)行超聲破碎處理（溫度為25℃，功率為19 W，時間為1 min，開5 s，關(guān)5 s），并將傳遞體混懸液在40℃水浴、氮氣壓條件下依次擠壓通過100 nm與50 nm孔徑的聚碳酸酯徑跡蝕刻膜（擠出壓力分別為0.25、0.49 MPa），即得PNS傳遞體。

2.3.1.2 PNS脂質(zhì)體的制備? PNS脂質(zhì)體的處方如下：PNS 100 mg、CH 15 mg、sbPC 120 mg、VE 2 mg，按“2.3.1.1”項下PNS傳遞體的制備工藝制得PNS脂質(zhì)體。

2.3.2 PNS傳遞體/脂質(zhì)體凝膠劑的制備

2.3.2.1空白凝膠基質(zhì)的制備? 稱取0.5 g卡波姆-940，加入蒸餾水且不斷攪拌，放置過夜，使其溶脹完全，以PBS調(diào)節(jié)pH至6.5，得空白凝膠基質(zhì)。

2.3.2.2 PNS傳遞體凝膠劑的制備? 取10 ml“2.3.1.1”項下所制得的PNS傳遞體加入“2.3.2.1”項下所制得的空白凝膠基質(zhì)中，并不斷攪拌，最后加入5 ml甘油，繼續(xù)攪拌均勻即得PNS傳遞體凝膠劑。

2.3.2.3 PNS脂質(zhì)體凝膠劑的制備? 取10 ml“2.3.1.2”項下所制得的PNS脂質(zhì)體加入“2.3.2.1”項下所制得的空白凝膠基質(zhì)中，并不斷攪拌，最后加入5 ml甘油，繼續(xù)攪拌均勻即得PNS脂質(zhì)體凝膠劑。

2.4 PNS傳遞體凝膠劑的含量測定

精密稱取“2.3.2.2”項下的PNS傳遞體凝膠劑0.7 g，置于10 ml的容量瓶中，加入適量甲醇，超聲數(shù)分鐘使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜后，按“2.1.2”項下HPLC法測定樣品中藥物的含量。測定結(jié)果表明，PNS傳遞體凝膠劑中各成分的含量分別為：人參皂苷Rg1（1.82±0.13）mg/g、人參皂苷Re（0.33±0.05）mg/g、三七皂苷R1（0.57±0.10）mg/g及人參皂苷Rb1（1.58±0.07）mg/g（n=3）。

2.5 PNS傳遞體凝膠劑的性狀

本品為淺白色半透明凝膠，質(zhì)地均勻細(xì)膩，無黏性塊狀物，涂展性好。分別取3批“2.3.2.2”項下PNS傳遞體凝膠劑樣品1 g，置于燒杯中，以10 ml蒸餾水稀釋后，攪拌均勻，測得pH值為6.0～7.0。

2.6離心試驗

分別取3批“2.3.2.2”項下PNS傳遞體凝膠劑樣品5 g，置于離心管中，于5000 r/min下離心30 min，結(jié)果顯示所制備的凝膠均無分層現(xiàn)象。

2.7滲漏率測定

精密稱取“2.3.2.2”項下PNS傳遞體凝膠劑樣品1.0 g，加入PBS（pH 6.5）浸泡4 h后，渦旋10 s，置于冷凍離心機(jī)中，于20 000 r/min下離心30 min，取上清液（游離藥物部分），進(jìn)樣，按“2.1.2”項下方法測定含量，按公式1計算滲漏率（%）[19]。公式1中，Wf為游離藥物量，Wb為包封率測定時游離藥物量，Wa為藥物含量。

2.8溫度、濕度及光照試驗

2.8.1溫度對PNS傳遞體凝膠劑穩(wěn)定性的影響

精密稱取“2.3.2.2”項下PNS傳遞體凝膠劑樣品3.0 g，置于棕色玻璃瓶中密封保存，分別于（4±2）℃、（20±2）℃、（40±2）℃恒溫條件下放置10 d，定時取樣，測定藥物含量（%）、藥物滲漏率（%）及pH值，與同條件第0天的樣品進(jìn)行比較。同時對樣品的性狀進(jìn)行觀察，以評價溫度對PNS傳遞體凝膠劑穩(wěn)定性的影響。

試驗結(jié)果表明，在（4±2）℃時，傳遞體凝膠劑的藥物含量和性狀均無明顯變化，但其第5天和第10天的藥物滲漏率高于同條件第0天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），在（20±2）℃和（40±2）℃時，傳遞體凝膠劑第5天和第10天的藥物滲漏率高于同條件第0天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且制劑由淺白色變?yōu)闇\黃色，同時其第5天和第10天的藥物含量也低于同條件第0天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。提示在低溫[（4±2）℃]條件下，PNS傳遞體凝膠劑穩(wěn)定性良好。

2.8.2濕度對PNS傳遞體凝膠劑穩(wěn)定性的影響

精密稱取“2.3.2.2”項下的PNS傳遞體凝膠劑樣品3.0 g，置于棕色玻璃瓶中，敞口，置于相對濕度（RH）分別為（75±5）%和（90±5）%的4 ℃恒溫密閉容器中，放置10 d，定時取樣，測定藥物含量（%）、藥物滲漏率（%）及pH值，與同條件第0天的樣品進(jìn)行比較。同時對樣品的性狀進(jìn)行觀察，以評價濕度對PNS傳遞體凝膠劑穩(wěn)定性的影響。

試驗結(jié)果表明，不同濕度下，傳遞體凝膠劑的藥物含量和性狀均無明顯變化，但是在RH為（75±5）%、（90±5）%條件下，第5天和第10天的藥物滲漏率均高于同條件第0天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2）。其藥物滲漏率均較?。?3.0%），PNS傳遞體凝膠劑穩(wěn)定性均良好。

2.8.3光照對PNS傳遞體凝膠劑穩(wěn)定性的影響

精密稱取“2.3.2.2”項下PNS傳遞體凝膠劑樣品3.0 g，置于透明無色玻璃瓶中密封保存，使其接收（4500±500）lx的強(qiáng)光光照，于溫度為4 ℃的條件下放置10 d，定時取樣，測定藥物含量（%）、藥物滲漏率（%）及pH值，與同條件第0天的樣品進(jìn)行比較。同時對樣品的性狀進(jìn)行觀察，以評價光照對PNS傳遞體凝膠劑穩(wěn)定性的影響。

試驗結(jié)果表明，在強(qiáng)光照射下，傳遞體凝膠劑第5天和第10天的藥物滲漏率高于第0天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且制劑由淺白色變?yōu)闇\黃色，同時其第5天和第10天的藥物含量也低于第0天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表3）。提示避光條件下，PNS傳遞體凝膠劑穩(wěn)定性良好。

2.9皮膚刺激性試驗

2.9.1單次給藥皮膚刺激性試驗

選取8只雌雄各半的健康SD大鼠，將其隨機(jī)分為基質(zhì)對照組和PNS傳遞體凝膠劑組，每組各4只。試驗前，將兩組大鼠的腹部毛發(fā)剃除，進(jìn)行左右等分，左側(cè)作為正常皮膚，右側(cè)皮膚用400號的紗布紙進(jìn)行摩擦造成局部擦傷（以滲血為度），作為損傷皮膚[20]。次日，在兩組大鼠的正常皮膚和損傷皮膚上分別涂抹“2.3.2.1”項下制得的空白凝膠基質(zhì)和“2.3.2.2”項下制得的PNS傳遞體凝膠劑3 g（給藥面積控制在25 cm2），用醫(yī)用滅菌紗布固定，6 h后，用滅菌溫水清洗皮膚。分別于停藥后1、24、48和72 h對給藥部位的紅斑、水腫等情況進(jìn)行觀察，做好記錄，并按照標(biāo)準(zhǔn)（表4）進(jìn)行評分。

試驗結(jié)果表明，基質(zhì)對照組和PNS傳遞體凝膠劑組對大鼠正常皮膚和破損皮膚的刺激反應(yīng)評分值均為（0±0）分（n=4），提示PNS傳遞體凝膠劑單次給藥對大鼠完整皮膚和破損皮膚均無刺激性。

2.9.2多次給藥皮膚刺激性試驗

在單次給藥皮膚刺激性試驗結(jié)果良好的前提下，筆者進(jìn)行了多次給藥皮膚刺激性試驗，同樣選取8只雌雄各半的健康SD大鼠，分組方法、試驗動物皮膚處理方法同“2.9.1”項下的“單次給藥皮膚刺激性試驗”。次日，在兩組大鼠的正常皮膚和損傷皮膚上分別涂抹“2.3.2.1”項下制得的空白凝膠基質(zhì)和“2.3.2.2”項下制得的PNS傳遞體凝膠劑3 g（給藥面積控制在25 cm2），用醫(yī)用滅菌紗布固定，每天1次，連續(xù)給藥7 d，末次給藥24 h后，用滅菌溫水清洗皮膚。分別于停藥后1、24、48和72 h對給藥部位的紅斑、水腫等情況進(jìn)行觀察，做好記錄，并按照“2.9.1”項下的“單次給藥皮膚刺激性試驗”中表4的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。

試驗結(jié)果表明，基質(zhì)對照組和PNS傳遞體凝膠劑組對大鼠正常皮膚和破損皮膚的刺激反應(yīng)評分值均為（0±0）分（n=4），表明PNS傳遞體凝膠劑多次給藥對大鼠完整皮膚和破損皮膚均無刺激性。

2.10體外皮膚滲透性試驗

2.10.1制備離體皮膚

取雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死，固定于鼠板上，用剃毛器與彎頭剪去除大鼠胸骨至腹部的毛發(fā)，剪下大鼠腹部皮膚，去除皮下組織，確保皮膚角質(zhì)層的完整性，取生理鹽水將皮膚漂洗干凈，展平并吸去多余水分后用錫箔紙包裹，置于-70℃冰箱中冷藏備用。

2.10.2體外透皮試驗

試驗前，先將“2.10.1”項下制得的離體皮膚于室溫下解凍，剪取適宜大小（有效皮膚面積為0.636 cm2），固定于供給池與接受池之間，將角質(zhì)層面向供給池，放入接受液[0.9%生理鹽水-乙醇（4：1）混合液]，排盡接受池中的氣泡使接受液液面與皮膚內(nèi)層完全接觸，接受池保持（32±1）℃恒溫水浴，池內(nèi)磁力攪拌速度為400 r/min，平衡15 min后，更換新的接受液，取“2.3.2.2”項下PNS傳遞體凝膠劑0.5 g涂布于皮膚表面，記錄時間為0 h，于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36 h時間點取樣200 μl，并及時補(bǔ)加等體積的新鮮接收液。試驗以“2.3.2.3”項下制得的PNS脂質(zhì)體凝膠劑作為參比制劑。

2.10.3體外皮膚累積滲透量的計算

取“2.10.2”項下的體外透皮試驗中所得樣品，按“2.1.2”項下方法測定樣品中各成分的含量，按公式2計算累積滲透量。公式2中0.636為透皮擴(kuò)散面積（cm2），5為接受池體積（ml），0.2為取樣體積（ml），Cn為第n個取樣點測得的藥物成分濃度（μg/ml），Ci為第n個取樣點之前某時間點該成分的測定濃度（μg/ml）。

2.10.4體外皮膚累積滲透結(jié)果及滲透曲線的繪制

2.10.5體外皮膚滲透速率分析

本研究對PNS傳遞體凝膠劑和PNS脂質(zhì)體凝膠劑中各成分的離體皮膚滲透曲線進(jìn)行觀察后，按照不同時間段滲透速率的特點將滲透曲線分割成三部分[依次為0.5～6（V1）、>6～12（V2）及>12～36 h（V3）3個時間段，滲透速率依次減小]，分別進(jìn)行線性回歸以估算不同時間段的滲透速率。結(jié)果提示，在V1和V2兩個時間段，PNS傳遞體凝膠劑中各成分（三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1）的滲透速率都大于PNS脂質(zhì)體凝膠劑中各成分的滲透速率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），V3時間段，PNS傳遞體凝膠劑和PNS脂質(zhì)體凝膠劑中各成分的滲透速率皆趨于0，兩者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表5）。結(jié)果表明，與PNS脂質(zhì)體凝膠劑相比，PNS傳遞體凝膠劑能顯著提高PNS的透皮效率。

表5? ?不同時間段PNS傳遞體凝膠劑和PNS脂質(zhì)體凝膠劑中各成分滲透速率的比較[μg/（cm2·h），x±s，n=3]

與PNS脂質(zhì)體凝膠劑同時間段比較，*P<0.05

2.11 PNS傳遞體凝膠劑和PNS脂質(zhì)體凝膠劑中各成分36 h的皮膚滯留量

取“2.10.2”項下經(jīng)過36 h體外透皮試驗后的離體皮膚。用生理鹽水沖凈皮膚內(nèi)外表面，并用濾紙將皮膚表面水分吸干，剪碎后置于研磨器中，加入200 μl生理鹽水，充分研磨，得皮膚勻漿;加入3 ml提取溶劑（丙酮∶甲醇=3∶1），渦旋2 min，于2000 r/min離心15 min后將上清液轉(zhuǎn)移至具塞塑料離心管中;此提取過程重復(fù)2次，合并各次提取液，于60℃下氮氣流吹干;殘留物用200 μl甲醇溶解，渦旋1 min，離心后吸取20 μl上清液，按“2.1.2”項下方法測定藥物皮膚滯留量，結(jié)果見表6。測得36 h后PNS脂質(zhì)體凝膠劑中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、三七皂苷R1及人參皂苷Rb1的皮膚滯留量約為PNS傳遞體凝膠劑中各成分的2.0～7.0倍。

3討論

本研究所制得的PNS傳遞體凝膠劑性質(zhì)穩(wěn)定、安全性良好。體外皮膚滲透性試驗表明，PNS傳遞體凝膠劑的皮膚滲透性具有明顯優(yōu)勢，PNS傳遞體凝膠劑中各成分的36 h皮膚累計滲透量約為參比制劑PNS脂質(zhì)體凝膠劑的2.0～3.5倍;而皮膚滯留試驗的結(jié)果顯示，36 h后PNS脂質(zhì)體凝膠劑中4種成分的皮膚滯留量約為參比制劑PNS傳遞體凝膠劑的2.0～7.0倍。

通過分析PNS傳遞體凝膠劑與PNS脂質(zhì)體凝膠劑的體外皮膚滲透與滯留特性，本研究結(jié)果提示，PNS傳遞體凝膠劑中的藥物能夠較好的穿透皮膚。相反，PNS脂質(zhì)體凝膠劑中的藥物則是大量滯留于皮膚中而使得其藥物皮膚滲透量大大降低，這一結(jié)果證明了傳遞體相比于傳統(tǒng)脂質(zhì)體具有明顯的經(jīng)皮滲透優(yōu)勢，更適合作為藥物的經(jīng)皮滲透載體。

近年來，已有多位研究者對不同藥物傳遞體制劑的體外透皮性能進(jìn)行了考察[13，15，21]，結(jié)果均表明傳遞體能促進(jìn)藥物的經(jīng)皮吸收，但是關(guān)于傳遞體的透皮機(jī)制僅僅停留在理論猜想階段，而未得出一個權(quán)威性解釋，這一直是困擾大家的一大難題，后期本研究將對載體的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期得出科學(xué)解釋。

本研究以傳遞體為載體，將其制備成凝膠劑，充分發(fā)揮了載體的優(yōu)勢和凝膠劑的特點，促進(jìn)大分子混合物PNS的透皮吸收，實現(xiàn)了其皮膚局部給藥并具有緩釋特性，避免藥物在給藥局部出現(xiàn)峰谷濃度現(xiàn)象，增加其使用的安全性。因此，PNS傳遞體凝膠劑具有良好的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2019-01-17? 本文編輯：孟慶卿）