附子理中湯對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響*

柴宇琪 滕磊 忻耀杰

變應(yīng)性鼻炎是機(jī)體在接觸變應(yīng)原后主要由免疫球蛋白IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)。在此過(guò)程中，多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞因子起到關(guān)鍵作用，且骨髓中細(xì)胞因子是募集、趨化和激活引起變應(yīng)性鼻炎的炎性細(xì)胞的主要來(lái)源[1]。而間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有多向分化潛能和免疫調(diào)控的作用[2]，被認(rèn)為可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的水平進(jìn)而影響變應(yīng)性鼻炎炎性細(xì)胞的表達(dá)[3]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建變應(yīng)性鼻炎的大鼠模型，并給予附子理中湯治療，觀察治療前后以及與對(duì)照組比較，變應(yīng)性鼻炎大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）增殖的影響。

資料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡清潔級(jí)SD大鼠36只，雌雄各半，體重均位于160～230g之間，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。自由進(jìn)水、常規(guī)飼料喂養(yǎng)，室溫穩(wěn)定于20～25℃,空氣濕度為60%。

2 實(shí)驗(yàn)試劑和設(shè)備

卵清蛋白（Ⅴ級(jí)Sigma，美國(guó)）；氫氧化鋁、PBS磷酸鹽緩沖液、抗體稀釋液(科夷生物科技有限公司提供)；CD29（ab179471）單克隆抗體和APC-Goat Anti-Rabbit（Ab130805）（Abcam，美國(guó)）；CD44-PE（88151） 單克隆抗體 （CST，美國(guó)）；CD45-FITC（561867）單克隆抗體（BD，美國(guó)）；Fresco離心機(jī)（Thermo，美國(guó)）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)）；Scepter細(xì)胞計(jì)數(shù)器（Millipore，美國(guó)）。

3 實(shí)驗(yàn)分組

將36只SD大鼠按雌雄分別隨機(jī)分成兩組，每組雌雄各半，各組18只。A組為變應(yīng)性鼻炎模型組；B組為變應(yīng)性鼻炎模型+附子理中湯方組。B組于模型建立次日開(kāi)始連續(xù)7天用按成人劑量折算用藥量的附子理中湯2ml灌胃；A組不做灌胃處理。

4 模型復(fù)制

①系統(tǒng)致敏階段：以20mg卵清蛋白加入30mg氫氧化鋁為免疫佐劑，溶于1ml 0.9%氯化鈉注射液中，腹腔注射，隔日1次，共8次。②鼻腔激發(fā)階段：在完成系統(tǒng)致敏后，每日以50mg卵清蛋白溶于1ml 0.9%氯化鈉注射液中，制成濃度為5%的溶液，滴鼻激發(fā)變態(tài)反應(yīng)，每只大鼠每側(cè)鼻腔50μL滴鼻，連續(xù)10日。③局部維持階段：每次治療前鼻腔繼續(xù)用卵清蛋白激發(fā)，以維持變應(yīng)性鼻炎的發(fā)作狀態(tài)。5檢測(cè)方法

變應(yīng)性鼻炎模型建立當(dāng)天為0天，在1、3、7天，B組灌胃治療后2小時(shí)，給A、B兩組取材，每次每組6只大鼠，雌雄各半。大鼠拉頸處死后，取完整右側(cè)股骨，洗滌后沖洗骨髓腔，經(jīng)洗滌離心稀釋后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度后收集100ul做檢測(cè)，分別加入CD44-PE、CD45-FITC、CD29一抗震蕩，PBS洗滌重懸后加入APC-Goat Anti-Rabbit二抗孵育，PBS洗滌后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。將檢測(cè)到的表面標(biāo)志物CD29/CD44陽(yáng)性/CD45陰性的細(xì)胞定為BMSCs。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 鼻部癥狀評(píng)分

比較1、3、7天取材的大鼠的鼻部癥狀，包括噴嚏、抓鼻、喘息、鼻分泌物4項(xiàng)，輕重程度分別為0-1-2-3分。A組和B組在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的鼻部癥狀評(píng)分見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，A組在第1、3、7天的積分比較無(wú)明顯差異性（P＞0.05）。B組在第3天時(shí)積分已減少，在第7天時(shí)積分進(jìn)一步減少，與第1天比較均有差異性（P＜0.05）。兩組間比較，第1天時(shí)積分比較無(wú)明顯差異性（P＞0.05）。第3天、第7天的積分比較均有差異性（P＜0.05）。說(shuō)明B組（附子理中湯）能有效、持續(xù)地改善變應(yīng)性鼻炎大鼠的癥狀。

表1 A、B兩組在 1、3、7 天的鼻部癥狀評(píng)分表（±s）（n=6）

表1 A、B兩組在 1、3、7 天的鼻部癥狀評(píng)分表（±s）（n=6）

*：同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)與A組比較P＜0.05；△：與第1天比較P＜0.05。

第1天 第3天 第7天A組 6.5 0±1.3 7 7.3 3±1.7 5 6.8 3±2.0 4 B 組 6.8 3±0.7 5 5.1 7±0.7 5*△ 3.5 0±0.8 4*△

2 BMSCs檢測(cè)結(jié)果

比較1、3、7天取材的大鼠的BMSCs，將檢測(cè)到的表面標(biāo)志物CD29/CD44陽(yáng)性/CD45陰性的細(xì)胞占比取對(duì)數(shù)（lg）比較。A組和B組在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的BMSCs對(duì)數(shù)值見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，A組的BMSCs在第 1、3、7天的比較無(wú)明顯差異性（P＞0.05）。B 組的BMSCs在第3天、第7天時(shí)均與第1天比較均有差異性（P＜0.05）。兩組間比較，第 1、3、7 天時(shí)的 BMSCs比較均有差異性（P＜0.05）。說(shuō)明B組（附子理中湯）能有效促進(jìn)BMSCs的增殖，在第3天時(shí)BMSCs的增殖明顯，第7天時(shí)仍維持在較高水平。

表2 A、B兩組在 1、3、7 天的 BMSCs比較（±s）（n=6）

表2 A、B兩組在 1、3、7 天的 BMSCs比較（±s）（n=6）

*：同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)與A組比較P＜0.05；△：與第1天比較P＜0.05。

第1天 第3天 第7天A組 4.9 1±0.0 2 4.9 3±0.0 2 4.8 1±0.1 5 B組 4.9 4±0.0 2* 5.0 1±0.0 3*△ 5.0 1±0.0 2*△

討論

變應(yīng)性鼻炎的根本原因是臟腑虛損，正氣不足，與肺、脾、腎三臟的功能關(guān)系最為密切。病位雖在肺，但病源在脾，病根在腎[4]。如玉屏風(fēng)散治療變應(yīng)性鼻炎的廣泛應(yīng)用，不僅可改善癥狀，還可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，調(diào)節(jié)免疫失衡[5]。但治療上總是以益氣溫陽(yáng)為主[6]。因此，具有溫陽(yáng)祛寒，益氣健脾的附子理中湯臨床常用于變應(yīng)性鼻炎的治療。本實(shí)驗(yàn)也表明了附子理中湯確實(shí)可以有效持續(xù)地緩解變應(yīng)性鼻炎大鼠的局部癥狀。研究證實(shí)附子理中湯可以提升細(xì)胞免疫功能，改善體液免疫[7]。而調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡恰恰對(duì)治療變應(yīng)性炎癥具有重要作用，也是治療方面重要的切入點(diǎn)。

近年來(lái)的研究表明多種來(lái)源的MSCs均可糾正Th1/Th2免疫失衡[8，9]，顯示出強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)能力，主要體現(xiàn)在其可分泌大量的可溶性細(xì)胞因子，如巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、前列腺素E2(PGE2)、白血病抑制因子(LIF)等，這些細(xì)胞因子可直接接觸細(xì)胞，介導(dǎo)其免疫調(diào)節(jié)活性，或通過(guò)抗原遞呈細(xì)胞參與介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)，或直接誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，還可通過(guò)信號(hào)通路介導(dǎo)形成綜合網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用。其中主要的作用途徑是通過(guò)顯著抑制淋巴細(xì)胞增殖，升高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)比例而發(fā)揮作用[10，11]。正常人群中Treg能夠有效地抑制Th2反應(yīng)，而過(guò)敏人群常伴有Treg功能受損會(huì)導(dǎo)致Th2的異常激活，出現(xiàn)免疫失衡。MSCs可促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖，糾正Th1/Th2免疫失衡，且誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg細(xì)胞在MSC定植消失后可繼續(xù)控制過(guò)敏炎癥。

正是基于MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用，MSCs正逐漸成為治療變應(yīng)性鼻炎的一顆新星。BMSCs來(lái)源于骨髓，具有自我復(fù)制、多向分化和低免疫原性及免疫調(diào)節(jié)功能，不僅可以分化替代損傷細(xì)胞，還可通過(guò)分泌和表達(dá)一系列免疫抑制因子，促進(jìn)組織原位前體細(xì)胞增殖分化，介導(dǎo)組織修復(fù)再生。雖然基礎(chǔ)研究仍處于細(xì)胞和動(dòng)物模型試驗(yàn)階段。但研究BMSCs的增殖及中藥干預(yù)作用無(wú)疑具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

基于以上認(rèn)識(shí)，有學(xué)者提出假說(shuō)，補(bǔ)氣溫陽(yáng)等扶正治法可以修復(fù)患者的MSCs，進(jìn)一步調(diào)節(jié)其免疫細(xì)胞的功能，以提高對(duì)抑炎因子的釋放，達(dá)到促炎/抑炎的免疫平衡狀態(tài)，并且也通過(guò)臨床實(shí)踐觀察到比較好的療效[12]。本次實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，觀察附子理中湯對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠BMSCs增殖的影響，在治療第1天時(shí)，B組（附子理中湯）的BMSCs數(shù)量即和A組（空白組）比較有差異，到第3天時(shí)，兩組的差異進(jìn)一步擴(kuò)大，結(jié)果差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），并一直維持到治療結(jié)束。提示附子理中湯的干預(yù)對(duì)BMSCs的增殖有積極的影響。而治療初期B組雖然顯示出對(duì)BMSCs的增殖作用，但整體強(qiáng)度不高，一方面考慮是治療剛剛開(kāi)始，血藥濃度不高，另一方面大鼠自身的BMSCs可能對(duì)早期實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響。而在治療中后期的顯著性差異，可能是由于大鼠自身BMSCs消耗后，附子理中湯促進(jìn)并維持BMSCs的增殖的體現(xiàn)。但附子理中湯對(duì)BMSCs的增殖是如何介導(dǎo)變應(yīng)性鼻炎鼻腔黏膜組織的屏障修復(fù)和功能恢復(fù)的，還需要深入的基礎(chǔ)研究。