針對結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的DNA疫苗V569免疫原性及保護性的初步研究

粟海波，劉梓健，周洋洋，彭寶洲，龔青

廣州醫(yī)科大學(xué)，廣州醫(yī)科大學(xué)-中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院聯(lián)合生命科學(xué)學(xué)院，廣州 511436

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)感染引起的傳染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球約25%的人為結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent TB infection, LTBI)者，其中5%～10%可能會發(fā)展為活動性TB[1]。每年因Mtb感染而死亡的人數(shù)達100萬人以上，LTBI 者成為TB患者的主要來源[2]。因此，及早發(fā)現(xiàn)和治療LTBI 者是控制TB傳播的有效手段。目前，廣泛使用的TB疫苗——卡介苗(BacillusCalmette-Guérin, BCG)，僅能對抗兒童的原發(fā)性感染，卻無法阻止成年人潛伏期Mtb的復(fù)發(fā)感染[3]。國內(nèi)外進入臨床研究的疫苗多數(shù)用于預(yù)防Mtb早期感染，對LTBI的預(yù)防效果不佳。因此，選擇Mtb早、晚期不同感染階段相關(guān)抗原研制新一代TB疫苗的策略將是可行的。Lin 等將Mtb早期分泌抗原Ag85B、SAT-6與潛伏感染相關(guān)抗Rv2660c蛋白相結(jié)合，開發(fā)了一種多階段的H56 疫苗，對Mtb潛伏感染能起到有效的治療作用[4-5]。Fan等通過融合表達Ag85B-HspX-Rv1813-Rv2660c-Rv2623抗原研制的A1D4疫苗對小鼠Mtb潛伏感染亦表現(xiàn)出良好的免疫保護效果[6]。因此，本研究選取了Mtb在不同感染階段表達的抗原構(gòu)建了針對LTBI的DNA疫苗。

前期研究利用Rv3425、PPE26和Rv2029c優(yōu)勢抗原構(gòu)建的抗LTBI DNA 疫苗p-VAX1-Ag85B-Rv3425-v2029c(A39)在抗LTBI方面具有較好的保護性[7-9]。本研究在質(zhì)粒DNA A39中導(dǎo)入PPE26基因，構(gòu)建了質(zhì)粒Ag85B-Rv3425-PPE26-Rv2029c (V569)，轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后檢測其所編碼的蛋白在真核細胞中的表達水平，在C57BL/6小鼠中檢測其免疫學(xué)特性，在斑馬魚-海分枝桿菌潛伏感染模型中初步檢測其保護效果，為研制抗LTBI DNA疫苗提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡C57BL/6小鼠和3～6月齡成年斑馬魚均購自廣州賽柏諾生物科技有限公司，海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum,M.marinum)、BCG、A質(zhì)粒、A3質(zhì)粒、A39質(zhì)粒均由復(fù)旦大學(xué)王洪海教授惠贈，地塞米松、RPMI 1640購自Sigma公司，三卡因購自廣州寶匯生物科技有限公司，小鼠細胞因子γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)、白細胞介素4(interleukin 4，IL-4)和預(yù)包被enzyme-linked immuno sorbent assay(ELISA)試劑盒購自GENEEZYME公司和深圳達科為生物有限公司，質(zhì)粒抽提和純化使用QIAGEN 公司plasmid giga kit，PBS購自上海生物工程有限公司，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)試劑、內(nèi)切酶和連接酶試劑均購自賽默飛公司，DMEM高糖培養(yǎng)基和新生小牛血清購自Gibco公司，小鼠淋巴細胞分離液購自Cedarlane公司，OADC、Middlebrook 7H9和Middlebrook 7H10購自BD Biosciences公司，羊抗鼠 FITC-CD4和羊抗鼠PE-CD8抗體購自eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 V569質(zhì)粒的構(gòu)建以Mtb H37Rv株基因組為模版，利用PCR擴增PPE26基因[10]，使用BamHⅠ 和NotⅠ雙酶切A39 DNA質(zhì)粒[11]，DNA 連接酶連接酶切后的DNA片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒V569，并使用雙酶切和DNA測序?qū)|(zhì)粒進行鑒定。質(zhì)粒構(gòu)建所需引物見參考文獻[10-11]。將A39 和V569陽性克隆菌分別接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基(含3 μL 1 μg/ml 青霉素)，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜，接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 μL 1 μg/ml 青霉素)擴大培養(yǎng)。 質(zhì)粒抽提和純化后，采用NanoDrop 2000 測定質(zhì)粒DNA 濃度。

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞驗證質(zhì)粒編碼蛋白在真核細胞的表達將HEK293T細胞接種于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%新生小牛血清)培養(yǎng)過夜，待細胞密度達到80%時，使用羅氏脂質(zhì)體Lipo3000將重組質(zhì)粒DNA(1 μg/皿)轉(zhuǎn)染細胞。對照組轉(zhuǎn)入1 μg對照質(zhì)粒pVAX1和A39。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，用蛋白免疫印跡法檢測細胞內(nèi)質(zhì)粒DNA編碼蛋白的表達情況，所用一抗為抗Rv3425和抗PPE26小鼠血清抗體。

1.2.3 小鼠免疫將C57BL/6小鼠分為6組，分別為PBS組、A組、A3組、A39組、V569組和BCG組，每組5只。BCG懸浮于PBS中，終細菌計數(shù) 2×107CFU/mL。各組DNA質(zhì)粒均溶于PBS中，終濃度為1 mg/mL。免疫程序：向小鼠左后腿肌內(nèi)注射50 μL PBS和BCG(1×106CFU)、A、A3、A39、V569組各50 μg DNA。每2周免疫1次，共免疫3次。最后一次免疫2周后處死小鼠，并測定各項免疫指標(biāo)。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測眼球外周血CD4+T細胞和CD8+T細胞免疫2周后，取小鼠眼球外周血并置于含肝素抗凝劑(50 U/mL)的試管內(nèi)，立即混勻。取100 μL抗凝外周血于5 mL試管中，加入2 mL紅細胞裂解液，立即輕輕混勻，在室溫下避光孵育3 min。然后以 2 000 r/min離心2 min，將沉淀物重懸于PBS中，重復(fù)2次后加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體(FITC anti-mouse CD4、 PE anti-mouse CD8)，避光孵育30 min后洗滌，重懸于PBS中。濾膜過濾后使用流式細胞儀(Attune NxT，賽默飛公司)檢測，用FlowJo 7.軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.5 脾淋巴細胞分離和培養(yǎng)將小鼠置75%乙醇消毒5 min后無菌分離脾臟。經(jīng)200目鋼網(wǎng)研磨，制備脾細胞懸液。加入4 mL淋巴細胞分離液后在4 ℃以 1 000 r/min離心10 min，小心吸取雙層液面之間的淋巴細胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌3次。計數(shù)后，將淋巴細胞懸液按照2.5×105個/孔加至24孔板中。每組細胞分別用Ag85B、 Rv2029c、Rv3478和PPE26抗原刺激，濃度為10 μg/mL。混合均勻后，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。

1.2.6 ELISA檢測脾淋巴細胞上清液中IFN-γ、IL-4的水平各組脾淋巴細胞經(jīng)抗原刺激后，收集上清液用于細胞因子檢測，所用試劑盒為小鼠IFN-γ和IL-4預(yù)包被ELISA試劑盒。將上清液以100 μL/孔加入96孔平板中，同時設(shè)空白孔。37 ℃孵育60 min，洗滌3次后，每孔加入生物素標(biāo)記的抗小鼠IL-4或IFN-γ抗體100 μL。37 ℃孵育60 min，洗滌3次后，每孔加入生物素標(biāo)記二抗100 μL。37 ℃孵育30 min，洗滌3次后，每孔加入OPD底物100 μL，避光15 min，每孔加入終止液100 μL。使用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中IFN-γ和IL-4的濃度。

1.2.7 斑馬魚潛伏感染模型的構(gòu)建將海分枝桿菌接種于7H9培養(yǎng)基(7H9+0.2% Tween 80+10% OADC增菌液)，調(diào)OD600值至0.5左右。用0.02%三卡因溶液麻醉成年斑馬魚1～2 min。用無菌PBS稀釋至8×103海分枝桿菌，通過微量注射器和腹腔注射方式向斑馬魚注射5 μL低劑量菌液(30～50 CFU/條)[12]。為檢驗細菌注射的數(shù)量，將5 μL低劑量稀釋后菌液涂布于7H10 固體培養(yǎng)基(7H10+10% OADC增菌液)中，計算細菌菌落數(shù)為33±11CFU。4周后，斑馬魚全身切片行抗酸染色檢測病理狀況。同時，為進一步檢測斑馬魚潛伏感染模型是否成功建立，我們使用微量注射器向斑馬魚腹腔內(nèi)注射5 μL高劑量菌液(2561±238 CFU)，分別統(tǒng)計斑馬魚在注射低劑量和高劑量菌液后的存活率[12]。

1.2.8 斑馬魚臟器菌落計數(shù)斑馬魚海分枝桿菌潛伏感染模型建立后，用DNA疫苗對斑馬魚進行免疫。實驗共分6組，每組60條斑馬魚。免疫過程：各組分別腹腔內(nèi)注射50 μL PBS、BCG、A、A3、A39和V569。其中，BCG含量為1×106CFU，質(zhì)粒含量均為各10 μg。免疫4周后使用地塞米松飼料進行飼養(yǎng)，每條魚給予飼料4 mg/d(即地塞米松10 μg/d)，持續(xù)飼養(yǎng)4周，進行免疫抑制以復(fù)活潛伏海分枝桿菌。復(fù)活后第1、2周每組分別取5條斑馬魚處死，用于臟器菌落計數(shù)。取斑馬魚肝臟在無菌PBS中洗滌，放入組織研磨器后，加入無菌生理鹽水1 mL，制成組織勻漿液。分別取10 μL接種于OADC平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)4周后進行菌落計數(shù)，對比不同時間組、不同免疫組之間臟器菌落形成單位計數(shù)的差異。在實驗過程中統(tǒng)計斑馬魚死亡數(shù)量，繪制生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒DNA編碼蛋白可在轉(zhuǎn)染HEK293T細胞表達

將PPE26(1 182 bp)導(dǎo)入質(zhì)粒A39 (2 568 bp)中，構(gòu)建了質(zhì)粒V569(為 3 750 bp)(圖1A)。質(zhì)粒V569經(jīng)雙酶切后，可產(chǎn)生A39和PPE26兩個片段(圖1B)。

將A39和V569質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細胞后，蛋白免疫印跡法檢測重組蛋白表達。用抗Rv3425抗體檢測重組質(zhì)粒表達，結(jié)果顯示，質(zhì)粒V569轉(zhuǎn)染細胞后，在蛋白相對分子質(zhì)量(Mr)為110～175 kD處有明顯條帶；而質(zhì)粒A39轉(zhuǎn)染細胞后，在72～110 kD處有明顯條帶(圖1C)。用抗PPE26抗體檢測重組質(zhì)粒表達，結(jié)果顯示，質(zhì)粒V569轉(zhuǎn)染細胞后在Mr為110～170 kD處有明顯條帶，而經(jīng)A39和pVAX1轉(zhuǎn)染的細胞無條帶(圖1D)。以上表明V569編碼蛋白可在真核細胞中表達。

A: PCR products of A39 and V569 analyzed by agarose gel electrophoresis. B: Digested products of A39 and V569 analyzed by agarose gel electrophoresis. C: Western blotting analysis of the expression of Rv3425 using anti-Rv3425 antibody. D: Western blotting analysis of the expression of PPE26 using anti-PPE26 antibody.

圖1 蛋白免疫印跡法檢測重組質(zhì)粒DNA在HEK293 T細胞中的表達

Fig.1 The protein expression in HEK293T transfected with the constructed DNA by Western blotting

2.2 質(zhì)粒V569免疫小鼠可以促進外周血CD4+、CD8+T細胞的增殖

取小鼠眼球外周血，用熒光標(biāo)記抗體CD4+和CD8+分別標(biāo)記T細胞，流式細胞儀進行檢測。各組免疫后小鼠眼球外周血中CD4+和CD8+T細胞所占比例見表1。相比PBS，BCG、質(zhì)粒A39和V569均明顯刺激了外周血中CD4+T細胞，數(shù)量顯示增加(圖2A)。與A39免疫組相比，V569免疫組中CD4+T細胞數(shù)量并無變化，CD8+T細胞數(shù)量有所下降，但無顯著性差異(圖2A和表1)。同時，比較各組中CD4+T/CD8+T細胞比值，質(zhì)粒V569免疫組中該比值為1.437±0.186，明顯高于質(zhì)粒A免疫組(1.163±0.241)、質(zhì)粒A3免疫組(1.223±0.183)和BCG免疫組(1.257±0.267)；與質(zhì)粒A39免疫組(1.355±0.208)相比，前者CD4+/CD8+T細胞比值略有升高，但無顯著性差異(圖2B)。這表明V569可引起較強烈的CD4+T細胞免疫反應(yīng)。

表1 小鼠眼球外周血CD4+和CD8+T 細胞百分比

Tab.1 The percentage of CD4+and CD8+T cells in PBMC of immunized mice

CD4+Tcell(%)CD8+Tcell(%)CD4+/CD8+Tcell(%)PBS13.55±1.45012.95±0.73001.048±0.271BCG19.67±1.3815.64±1.491.257±0.267A18.55±1.45015.95±2.131.163±0.241A319.13±1.45015.95±0.73001.223±0.183A3920.63±1.45015.22±1.531.355±0.208V56920.80±1.9714.49±1.271.437±0.186

A: the percent of CD4+T cell in in serum of mice immunized with PBS, A, A3, A39 and V569. B: the ration of CD4+/CD8+T cell in serum of mice immunized with PBS, A, A3, A39 and V569.*:P<0.05; n.s.: no difference.

圖2 V569對外周血CD4+、CD8+T細胞增殖的影響

Fig.2 The effect of v569 vaccination on CD4+and CD8+T cell in mice

2.3 V569免疫可促進IFN-γ的分泌

取免疫后小鼠脾淋巴細胞，分別經(jīng)特異性抗原Ag85B、Rv3425、PPE26和Rv2029c刺激后，采用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中的IFN-γ和IL-4分泌水平。如圖3A所示，與PBS對照組相比，V569免疫組小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清液中的抗原特異性IFN-γ水平明顯升高(分別經(jīng)Rv3425、PPE26和R2029c 刺激，P<0.05 )。與其他各組相比，A39、V569免疫組中IL-4的分泌水平略有減少(分別經(jīng)Rv3425、PPE26和R2029c 刺激，P>0.05 )，但各組間無顯著差異，見圖3B。以上結(jié)果提示質(zhì)粒V569可以誘導(dǎo)較強的細胞免疫應(yīng)答。

A: The concentrations of IFN-γ in splenocytes response to Ag85B, Rv3425, PPE26 and Rv2029c treatment. B: The concentrations of IL-4 in splenocytes response to Ag85B, Rv3425, PPE26 and Rv2029c treatment.*：P<0.05.

圖3 脾淋巴細胞培養(yǎng)上清液中特異性細胞因子分泌水平

Fig.3 Concentrations of IFN-γ and IL-4 in supernatants of mouse splenocytes after vaccination

2.4 質(zhì)粒V569可抑制斑馬魚-海分枝桿菌潛伏感染復(fù)發(fā)

利用斑馬魚-海分枝桿菌潛伏感染模型評價DNA疫苗抗?jié)摲腥颈Ｗo效率(圖4A)。斑馬魚-海分枝桿菌潛伏感染模型建立后，經(jīng)斑馬魚全身切片抗酸染色觀察到了肉芽腫類似結(jié)構(gòu)(圖4B)。肉芽腫結(jié)構(gòu)形成反映了TB發(fā)生的病理階段[12]。與高劑量海分枝桿菌感染相比，低劑量菌液感染后，斑馬魚存活時間明顯延長(圖4C)，提示斑馬魚-海分枝桿菌潛伏感染模型成功構(gòu)建。

將該模型用于評估疫苗抗?jié)摲腥颈Ｗo效應(yīng)。與PBS、質(zhì)粒A、質(zhì)粒A3和BCG組相比，質(zhì)粒V569組斑馬魚14 d存活率接近80%(圖4D)。肝臟細菌菌落計數(shù)結(jié)果顯示，質(zhì)粒V569組中細菌數(shù)量明顯下降(圖4E)。與A39組相比，V569組斑馬魚存活時間延長，菌落計數(shù)均有所減少，但無顯著性差異(圖4D 、4E)。這表明質(zhì)粒V569也許能抑制斑馬魚-海分枝桿菌潛伏感染的復(fù)發(fā)。

A: Schematic representation of the experimental protocol for testing vaccine candidates against the reactivation of a latentM.marinuminfection in zebrafish. B: Acid-fast staining in zebrsfish-M.marinumlatent infection model. C: The survival curve of zebrafish infected with low-dose or high-dose bacteria. D: The survival curve of zebrafish after vaccination. E: colony-forming units (CFU) in zebrafish liver.*:P<0.05;**:P< 0.001; n.s.: no difference.

圖4 V569抗?jié)摲腥镜谋Ｗo效率

Fig.4 The protective efficiency of DNA vaccine V569 in zebrafish model

3 討論

DNA疫苗治療LTBI是預(yù)防Mtb感染復(fù)發(fā)的有效途徑[12]。本研究基于質(zhì)粒A39 DNA構(gòu)建了質(zhì)粒V569 DNA疫苗，與BCG相比，質(zhì)粒V569在小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)更顯著的Th1型細胞免疫反應(yīng)；質(zhì)粒V569對斑馬魚-海分枝桿菌潛伏感染復(fù)發(fā)表現(xiàn)出較好的保護效果，顯著延長了病原菌感染后斑馬魚的存活時間。

Th1型細胞免疫反應(yīng)對于Mtb感染所引起的機體免疫應(yīng)答至關(guān)重要[13]。IFN-γ可促進Th0細胞增殖分化成Th1細胞和激活巨噬細胞，在抗Mtb感染中起重要作用[14]。本研究中，與PBS相比，質(zhì)粒V569促進了小鼠淋巴細胞中IFN-γ分泌。IL-4是Th2細胞分泌的細胞因子，可抑制Th1細胞的增殖，拮抗IFN-γ的作用[15]。然而，本實驗中PBS組小鼠淋巴細胞中IL-4分泌水平較高，與V569實驗組相近。其中原因可能是： IL-4分泌水平在各組中可能都較高，故檢測時PBS組與實驗組差異不大；然而， IL-4分泌水平在各實驗組中無差異，表明質(zhì)粒V569不會促進免疫對象分泌IL-4。

CD4+T細胞百分比是評價Mtb疫苗效果的重要指標(biāo)。CD4+T細胞可產(chǎn)生IFN-γ和IL-2，在清除Mtb過程中起關(guān)鍵作用。在Mtb潛伏感染模型中，CD4+T細胞與病原菌活化密切相關(guān)[16]。CD8+T細胞能溶解宿主細胞并參與清除Mtb[17]。 在本試驗中，與PBS、BCG組相比，V569組的小鼠眼球外周血中CD4+/CD8+T細胞比例均明顯升高。 與A39組相比，V569組中CD4+T、CD8+T細胞比例無顯著差異。這可能是由PPE57(A39和V569均含有)引起的免疫交叉反應(yīng)所致[18]。

斑馬魚-海分枝桿菌潛伏感染模型對于研究Mtb的感染、休眠和活化極為重要[12]，本實驗利用該模型評估V569疫苗抗?jié)摲腥颈Ｗo效率，免疫后可較為有效地誘導(dǎo)Th1型細胞免疫反應(yīng)。因此，質(zhì)粒V569對斑馬魚中低劑量海分枝桿菌潛伏感染的復(fù)發(fā)有較好的保護作用；雖然增加了RD5區(qū)PPE26抗原，但其免疫原性和保護性并無顯著增強，可能是不同PPE抗原之間存在一定程度的免疫交叉反應(yīng)[18]。本研究為研發(fā)新的抗LTBI的DNA疫苗提供了依據(jù)。