骨化三醇對(duì)肺炎支原體肺炎患兒Th17/Treg失衡的干預(yù)作用

曹 正 余 蓉 薛 冰 王建榮

肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumonia pneumonia，MPP)是由肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)引起的肺實(shí)質(zhì)和(或)間質(zhì)的急性感染，約占兒童社區(qū)獲得性肺炎的10%～30%[1]。世界范圍內(nèi)流行病學(xué)研究表明，每隔3～7年MP感染會(huì)出現(xiàn)周期性社區(qū)流行，持續(xù)數(shù)月到數(shù)年不等[2]。部分患兒病情較重，常累及全身多個(gè)系統(tǒng)，嚴(yán)重影響兒童的身心健康。骨化三醇[1，25(OH)2D3]作為體內(nèi)維生素D的重要產(chǎn)物，近年來，應(yīng)用不僅局限于調(diào)節(jié)鈣磷代謝及內(nèi)分泌功能，其抗炎、抗感染、免疫調(diào)節(jié)作用得到廣泛關(guān)注[3]。劉金等[4]研究表明，MPP患兒存在維生素D缺乏。杜許芳等[5]研究表明，Th17/Treg失衡參與了MPP的發(fā)病過程。邵美琪等[6]報(bào)道予以維生素D體外培養(yǎng)哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，可使Treg 細(xì)胞水平升高，Th17 細(xì)胞降低。但MPP患兒能否口服維生素D調(diào)節(jié)Th17/Treg失衡，目前少見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬定以維生素D輔助治療MPP，旨在探索維生素D對(duì)Th17/Treg失衡的調(diào)節(jié)作用及可能存在的機(jī)制，為MPP患兒合理補(bǔ)充維生素D改善免疫失衡及臨床癥狀提供理論依據(jù)。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：選取2018年9～12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院兒科病房收治的50例MPP患兒為實(shí)驗(yàn)組，并選取50例健康兒童為對(duì)照組，兩組患兒在年齡、性別、BMI方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：50例患兒均符合MPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：病程3～7天，伴咳嗽、發(fā)熱；肺部聽診可聞及固定濕性啰音，胸部X線檢查顯示點(diǎn)片狀陰影；血清特異性MP-IgM≥1∶160為陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肺部其他疾病及多種病原體感染；②合并先天性疾病、免疫缺陷病、營養(yǎng)不良、甲狀腺、肝臟、腎臟疾病及佝僂??；③入院前或病程中需要應(yīng)用激素及免疫調(diào)節(jié)劑。實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為維生素D干預(yù)組、非維生素D干預(yù)組各25例，兩組患兒一般情況及病情嚴(yán)重程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均給予常規(guī)治療(止咳祛痰藥物靜脈滴注+阿奇霉素口服，所用藥物頻次及廠家相同)，干預(yù)組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上同時(shí)口服維生素D制劑(400 IU/次，1次/天，廈門星鯊)治療2周。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)同意，所有參與者受試前均簽署知情同意書。

2.研究方法：納入標(biāo)準(zhǔn)的患兒均于入院第2天及2周后采集清晨空腹血6ml，肝素抗凝，取3～4ml全血加入PBS對(duì)倍稀釋，緩慢倒入裝有4ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心后取白膜層，3倍體積的PBS將其洗3遍，1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度2×106/ml，收集100μl細(xì)胞至離心管中，嚴(yán)格按說明書步驟依次加入胞內(nèi)染色沖洗緩沖液(intracellular staining perm wash buffer)、固定緩沖液(fixation buffer)洗滌重懸細(xì)胞，加入20μl Th17/Treg細(xì)胞抗體，避光孵育0.5h，洗滌后重懸細(xì)胞，加入細(xì)胞染色緩沖液(cell staining buffer)0.5ml，分別以CD3+/CD4+/IL-17+、CD4+/CD25+/Foxp3設(shè)門，上機(jī)檢測(cè)。分析Th17、Treg細(xì)胞的百分率。其余靜脈血靜置2～4h后以3000r/min速率離心15min,分離血清，ELISA法檢測(cè)血清中1,25(OH)2D3、IL-17及IL-10水平(美國BD公司)，嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。

結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)組患兒1,25(OH)2D3、Treg及IL-10細(xì)胞水平均低于對(duì)照組兒童，Th17及IL-17高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組患兒1，25(OH)2D3、IL-10、IL-17含量及Treg、Th17水平比較

治療前兩組患兒1,25(OH)2D3、Treg、IL-10、Th17及IL-17水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。干預(yù)組治療后1,25(OH)2D3、Treg及IL-10水平較治療前增加(P<0.05)，Th17及IL-17水平較治療前降低(P<0.05)；非干預(yù)組治療后1,25(OH)2D3、Treg及IL-10水平較前增加，Th17及IL-17含量降低，但治療前后比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 兩組治療前后1，25(OH)2D3、IL-10、IL-17含量及Treg、Th17水平比較

干預(yù)組與非干預(yù)組治療效果比較，干預(yù)組患兒咳嗽消失時(shí)間及喘息消失時(shí)間均低于非干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)組患兒肺部啰音消失時(shí)間、體溫正常時(shí)間及平均住院時(shí)間與非干預(yù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3。

表3 兩組患兒治療效果比較天)

討 論

MPP是兒童常見的呼吸道感染性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，研究多傾向于病原對(duì)氣道上皮直接破壞和免疫功能引起的損傷，其中免疫紊亂被認(rèn)為是推動(dòng)MPP病情進(jìn)展的關(guān)鍵因素[2]。Treg及Th17細(xì)胞均由轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β) 誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化而成，在功能上相互抑制，且在一定情況下可以互相轉(zhuǎn)化，共同維持免疫狀態(tài)的穩(wěn)定[8]。Treg細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，通過分泌IL-10、IL-4等效應(yīng)細(xì)胞因子抑制T細(xì)胞的活化和增殖，間接發(fā)揮免疫抑制功能[9]；Th17則以分泌效應(yīng)性細(xì)胞因子IL-17為特征，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集，刺激并釋放大量炎性因子及趨化因子，如IL-8、TNF-α和 IL-1β等，促進(jìn)和放大炎性反應(yīng)[10]。

本研究表明，MPP患兒急性期存在Th17/Treg細(xì)胞失衡，促炎性細(xì)胞Th17升高，抑制炎性細(xì)胞Treg降低，與朱章華等[11]研究結(jié)果相一致，其機(jī)制可能為MP感染后通過黏附蛋白吸附于上皮細(xì)胞表面受體，激活并誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子如IL-1β和IL-6等，導(dǎo)致Treg細(xì)胞凋亡并向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生IL-17以發(fā)揮其促炎作用，最終Th17/Treg免疫平衡失調(diào)，推動(dòng)了MPP患兒疾病的進(jìn)展[12]。

維生素D在肺的微環(huán)境中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，目前測(cè)定血清1，25(OH)2D3評(píng)估體內(nèi)維生素 D 的含量是最準(zhǔn)確的方法[13]。本研究納入50 例MPP患兒，檢測(cè)出血清中1，25(OH)2D3水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與繆美華等[14]研究結(jié)果相一致，考慮體內(nèi)1，25(OH)2D3缺乏可能是導(dǎo)致兒童MPP發(fā)生的潛在病因，其水平降低能引起呼吸道黏膜上皮變性、角化和增生，致使氣道上皮合成并分泌抗菌肽、防御素、單核-吞噬細(xì)胞等減少；同時(shí)引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞分化和成熟障礙，免疫球蛋白水平降低，多種因素共同作用下患兒免疫功能出現(xiàn)紊亂，增加了MPP患兒的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[15，16]。

1，25(OH)2D3作為體內(nèi)最基本的信號(hào)分子，通過內(nèi)分泌的方式聯(lián)系細(xì)胞外刺激和細(xì)胞內(nèi)基因應(yīng)答[17]。氣道上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞中均存在維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)的表達(dá)，肺部受到感染時(shí)，局部組織1，25(OH)2D3合成增加，通過維生素D結(jié)合蛋白(vitamin D binding protein,VDBP)運(yùn)送至細(xì)胞核內(nèi)的VDR，激活并表達(dá)一系列抗菌因子調(diào)節(jié)肺組織局部免疫[18]。Gregori等[19]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明維生素 D 可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞的生成，王茜等[20]報(bào)道維生素D可通過抑制Rhoa/Rock信號(hào)通路，減少Th17及IL-17的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予MPP患兒口服維生素D可提高體內(nèi)1,25(OH)2D3濃度，有效降低Th17 細(xì)胞水平，提高 Treg細(xì)胞比例，部分糾正 Th17/Treg 細(xì)胞失衡。分析其機(jī)制為在幼稚T細(xì)胞發(fā)育的過程中，1，25(OH)2D3一方面可阻止幼稚樹突狀細(xì)胞向成熟樹突狀細(xì)胞分化，促進(jìn)Treg生成并分泌IL-10因子，還可通過IL-17啟動(dòng)子招募組蛋白去乙?；?(histone deacetylase,HDAC)，抑制IL-17啟動(dòng)子募集Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1 (Runx1)來下調(diào)IL-17的水平，進(jìn)而阻抑CD4+T細(xì)胞向Th17亞群分化[21，22]。本實(shí)驗(yàn)研究過程中共有3例患兒出現(xiàn)肺不張、胸腔積液等肺內(nèi)外并發(fā)癥，多次調(diào)整抗生素并予以地塞米松靜脈滴注，因糖皮質(zhì)激素具有抑制細(xì)胞及體液免疫、抗炎、退熱等功效，為實(shí)驗(yàn)混雜因素，故未納入實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

研究顯示，IL-17可促進(jìn)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和 Rhoa蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致小氣道廣泛的收縮痙攣，加重氣道反應(yīng)性[23]。本實(shí)驗(yàn)干預(yù)組患兒給予維生素D后咳嗽及喘憋癥狀消失時(shí)間較非干預(yù)組縮短，考慮維生素D可通過下調(diào)IL-17減輕氣道炎性反應(yīng)，進(jìn)而改善呼吸道癥狀；干預(yù)組患兒體溫恢復(fù)正常時(shí)間及總住院時(shí)間較非干預(yù)組縮短，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量較少有關(guān)，兩組患兒肺部啰音吸收時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-17為具有雙向作用的因子，急性感染期機(jī)體需要強(qiáng)有力的免疫應(yīng)答清除病原，此時(shí)IL-17在炎性反應(yīng)部位聚集并發(fā)揮其抗感染作用，據(jù)此可推測(cè)早期感染越重，炎性反應(yīng)越強(qiáng)烈，IL-17水平越高，在疾病恢復(fù)期高水平的IL-17可致炎性損傷不利于疾病轉(zhuǎn)歸，有研究證實(shí)MPP患兒嚴(yán)重程度與血清IL-17水平呈正相關(guān)[24]。若MPP患兒病情發(fā)展至重癥肺炎支原體肺炎(severe MPP,SMPP)，則治療難度較大，能否通過口服維生素D降低IL-17以減少SMPP發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，為今后研究方向。

綜上所述，維生素D輔助治療MPP可在一定程度上調(diào)節(jié)Th17/Treg失衡并改善呼吸道癥狀。由于本研究樣本量較小、觀察周期較短，需擴(kuò)大樣本量明確其臨床療效，并規(guī)范維生素D的用法、用量，隨著研究的不斷深入，將為MPP的干預(yù)和治療提供新的靶點(diǎn)。