重癥急性胰腺炎患者外周血Th22細(xì)胞水平變化及臨床意義

焦 艷 張永輝

急性胰腺炎(AP)是臨床常見(jiàn)的急腹癥，有研究報(bào)道顯示，有15%～20%的AP患者可進(jìn)展為重癥急性胰腺炎(SAP)，進(jìn)一步導(dǎo)致多器官功能障礙，病情兇險(xiǎn)，病死率極高[1]。隨著基礎(chǔ)與臨床研究的深入，SAP的發(fā)病機(jī)制及相關(guān)臨床診斷已取得了較大進(jìn)展，但早期診斷率仍較低。因此，明確SAP發(fā)病機(jī)制，針對(duì)SAP病情的準(zhǔn)確評(píng)估與治療，是提高該病治療效果及預(yù)后的關(guān)鍵。近年來(lái)，已有研究表明，SAP的發(fā)生與機(jī)體免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的炎性反應(yīng)的激活密切相關(guān)[2,3]，SAP的免疫防治作為重要的治療手段而備受關(guān)注。輔助型T細(xì)胞是免疫炎性反應(yīng)的重要組成部分，在炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的作用[4,5]。其中，Th22細(xì)胞作為重要的亞群之一，其特異性的分泌促炎細(xì)胞因子IL-22，可激活下游炎性通路，放大炎性反應(yīng)[6]。然而，在SAP患者體內(nèi)外周血Th22細(xì)胞與疾病發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性如何，目前尚未闡明。本研究通過(guò)觀察SAP患者外周血Th22細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平，探討外周血Th22細(xì)胞對(duì)SAP的臨床診斷價(jià)值。

資料與方法

1.研究對(duì)象:選取2015年1月～2018年12月于筆者醫(yī)院就診住院的SAP患者100例作為觀察組，其中男性55例，女性45例，患者年齡34～78歲，中位年齡54.5歲。致病原因：膽囊及膽管結(jié)石(62例)、暴飲暴食及酒精性(14例)、高脂血癥(8例)、藥物性(5例)、其他(11例)，所有患者均符合SAP診斷與治療指南[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤、全身嚴(yán)重感染的患者；合并嚴(yán)重肝、腎功能不全的患者；存在其他自身免疫性疾病和免疫缺陷的患者；近半年使用免疫抑制劑的患者。同時(shí)選取同期100例普通輕型AP患者為對(duì)照組，所有對(duì)照組患者均滿足AP診斷及治療指南，同時(shí)需排除符合SAP診斷的患者。記錄患者一般臨床資料如年齡、性別、基礎(chǔ)疾病等，同時(shí)記錄患者入院12h的修正CT嚴(yán)重指數(shù)評(píng)分(MCTSI)、Ranson評(píng)分及APACHEⅡ評(píng)分。各組間在性別、年齡、致病原因、基礎(chǔ)疾病等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得了陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn)并征得了患者家屬書(shū)面知情同意。

2.主要設(shè)備及試劑：(1)主要設(shè)備：流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Emax公司)。(2)主要試劑：人淋巴細(xì)胞分離液、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液、佛波酯、離子霉素、莫能菌素、細(xì)胞固定液及細(xì)胞破膜劑(美國(guó)Sigma公司)；鼠抗人CD4單抗及鼠抗人IL-22單抗(美國(guó)eBioscience公司)；人血清IL-22和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(中國(guó)博士德公司)；AMY、內(nèi)毒素的 ELISA試劑盒(中國(guó)南京建成生物公司)。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th22細(xì)胞水平：分別抽取兩組患者清晨空腹靜脈血3ml，經(jīng)肝素抗凝后，加入淋巴細(xì)胞分離液，震蕩混勻，經(jīng)離心后提取單核細(xì)胞。取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將上述提取的單核細(xì)胞接種于該培養(yǎng)板，同時(shí)加入等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基。隨后加入相關(guān)抗菌素(50μl佛波酯，16μl離子霉素及16μl莫能菌素)后，吹打混勻，孵育箱孵育6h。加入抗人CD4單抗10μl，吹打混勻后，室溫避光孵育1h，隨后加入100μl細(xì)胞固定液，經(jīng)離心后，加入100μl破膜液及5μl IL-22單抗?；靹蚝蠹尤肴旧潭ㄒ?00μl，最后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th22細(xì)胞水平。

4.外周血相關(guān)因子及炎性指標(biāo)的檢測(cè):取兩組患者清晨空腹靜脈血3ml，離心后收集上清，采用ELISA法測(cè)定各組間外周血IL-1β、IL-22、AMY及內(nèi)毒素水平，具體操作依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

結(jié) 果

1.外周血Th22細(xì)胞及相關(guān)炎性指標(biāo)比較:與對(duì)照組比較，觀察組患者外周血Th22細(xì)胞、IL-22、IL-1β、AMY及內(nèi)毒素水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表1及圖1。

表1 兩組患者外周血Th22細(xì)胞及相關(guān)炎性指標(biāo)水平比較

圖1 外周血 Th22細(xì)胞的流式細(xì)胞分析圖A.對(duì)照組；B.觀察組

2.病情嚴(yán)重程度評(píng)分比較：與對(duì)照組比較，觀察組病情嚴(yán)重程度評(píng)分(MCTSI評(píng)分、Ranson評(píng)分及APACHEⅡ評(píng)分)均顯著升高(P<0.05)。

表2 兩組患者病情嚴(yán)重程度評(píng)分比較(分，

3.相關(guān)性分析:SAP患者外周血Th22細(xì)胞與IL-22、IL-1β、AMY及內(nèi)毒素水平呈顯著正相關(guān)(r=0.930，P=0.000；r=0.825，P=0.000；r=0.782，P=0.007；r=0.803，P=0.002；r=0.680，P=0.012)；同時(shí)與病情嚴(yán)重程度評(píng)分(MCTSI評(píng)分、Ranson評(píng)分及APACHEⅡ評(píng)分)呈顯著正相關(guān)(r=0.820，P=0.000；r=0.830，P=0.000；r=0.747，P=0.009)。

4.外周血Th22細(xì)胞水平對(duì)SAP患者早期診斷價(jià)值的ROC曲線分析:通過(guò)以外周血Th22細(xì)胞水平來(lái)評(píng)估SAP患者早期診斷價(jià)值，繪制ROC曲線。外周血Th22細(xì)胞水平的曲線下面積(AUC)為0.908(95% CI: 0.839～0.976)，其最佳工作點(diǎn)(OOP)分別為3.08，提示按此最佳工作點(diǎn)對(duì)SAP患者進(jìn)行早期診斷預(yù)測(cè)，其敏感度和特異性分別為87.88%和80.00%，見(jiàn)圖2。

圖2 外周血Th22細(xì)胞對(duì)SAP患者早期診斷價(jià)值的ROC曲線分析

討 論

近年來(lái)，SAP的發(fā)生率及病死率均呈上升趨勢(shì)，雖然相關(guān)基礎(chǔ)與臨床研究對(duì)SAP的發(fā)病機(jī)制及診斷、治療取得了一定進(jìn)展，但病死率仍居高不下[8]。主要原因?yàn)橐让讣せ?，?dǎo)致機(jī)體炎性因子過(guò)度釋放，常并發(fā)多器官功能障礙，造成病情進(jìn)行性惡化[9]。相關(guān)研究顯示，早期診斷SAP，可有效的減少并發(fā)癥及患者病死率[10]。SAP患者機(jī)體炎性反應(yīng)進(jìn)行性放大的具體機(jī)制尚不完全清楚，但隨著近年來(lái)炎癥免疫研究的進(jìn)展，輔助型T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在多種自身免疫及炎性疾病中的作用，越來(lái)越受到關(guān)注[11,12]。特別是以Th22細(xì)胞為代表的新型輔助型T細(xì)胞亞群，通常情況下，機(jī)體Th22細(xì)胞處于抑制狀態(tài)，當(dāng)受促炎細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α的刺激作用下，可由CD4+T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，分泌IL-22，隨后激活下游炎性通路，產(chǎn)生炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13,14]。相關(guān)研究已顯示，外周血Th22細(xì)胞參與了炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[15,16]。SAP作為炎性疾病之一，外周血Th22細(xì)胞可能在SAP的早期診斷及病情變化的評(píng)估過(guò)程中，具有重要的臨床價(jià)值。

相關(guān)研究顯示，急性胰腺損傷時(shí)，體內(nèi)炎性通路可顯著激活，輔助型T細(xì)胞如Th17細(xì)胞可顯著激活，進(jìn)一步導(dǎo)致下游IL-17及TNF-α水平顯著升高，抑制Th17細(xì)胞激活，可顯著降低急性胰腺炎模型大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)，減輕胰腺損傷[17,18]。作為一類新型的輔助型T淋巴細(xì)胞亞群，外周血Th22細(xì)胞是否參與了SAP的發(fā)生，同時(shí)與病情嚴(yán)重程度關(guān)系如何，目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，SAP患者外周血Th22細(xì)胞及相關(guān)下游炎性因子如IL-22、IL-1β等顯著升高，表明SAP患者體內(nèi)存在持續(xù)的炎性狀態(tài)，其可能參與并促進(jìn)了SAP的發(fā)展過(guò)程。

為進(jìn)一步分析外周血Th22細(xì)胞與SAP體內(nèi)炎性細(xì)胞因子及病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，通過(guò)相關(guān)性分析顯示，外周血Th22細(xì)胞與IL-22、IL-1β、AMY及內(nèi)毒素水平呈顯著正相關(guān)，提示外周血Th22細(xì)胞的激活，可進(jìn)一步導(dǎo)致相關(guān)炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加；同時(shí)SAP患者體內(nèi)外周血Th22細(xì)胞水平還與病情嚴(yán)重程度評(píng)分(MCTSI評(píng)分、Ranson評(píng)分及APACHEⅡ評(píng)分)呈顯著正相關(guān)，提示外周血Th22細(xì)胞可一定程度反映SAP患者病情嚴(yán)重程度，可能對(duì)SAP患者病情嚴(yán)重程度的評(píng)估，具有一定的臨床運(yùn)用價(jià)值。通過(guò)ROC曲線分析外周血Th22細(xì)胞水平對(duì)SAP患者早期診斷的評(píng)估價(jià)值，其結(jié)果顯示，ROC曲線下面積較大，預(yù)測(cè)價(jià)值較高。外周血Th22細(xì)胞是炎性反應(yīng)發(fā)起及進(jìn)一步放大的重要環(huán)節(jié)，有研究顯示，通過(guò)有效的抑制體內(nèi)Th22細(xì)胞的激活，可顯著降低炎性反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大，改善炎癥性疾病的預(yù)后[19,20]。因此，外周血Th22細(xì)胞水平不僅可作為評(píng)估SAP患者早期診斷的可靠指標(biāo)，還可能成為其治療的有效靶標(biāo)。

綜上所述，外周血Th22細(xì)胞參與了SAP患者的炎性反應(yīng)，但有關(guān)Th22細(xì)胞在SAP發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。