多發(fā)性肌炎/皮肌炎患者外周血Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)趨化因子的臨床意義

鄭小蔚，陳小青，李秋蘭，黃小蘭，蘇慧華，林 玲

多發(fā)性肌炎/皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis，PM/DM)是一組異質(zhì)性皮膚/肌肉炎癥為主的自身免疫性疾病，病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。研究顯示：Ⅰ型干擾素通路異常激活對其可能起到關(guān)鍵作用[1-3]。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測PM/DM患者PBMCs中5個(gè)經(jīng)典的Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)趨化因子基因(MCP-1、IP-10、 I-TAC、MCP-2、 MIP-1α)的mRNA表達(dá)量，將其整合后分別計(jì)算趨化因子積分，探討Ⅰ型干擾素通路活化與PM/DM臨床表型的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

PM/DM組52例(PM24例，DM28例)，來自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院免疫內(nèi)科2011年1月至2014年1月的門診和住院患者，其中女性36例，男性16例，年齡20～74歲，平均(47±15)歲，其中有45例隨訪半年以上，6例收集了治療前后的標(biāo)本，所有患者均符合2004年國際肌病協(xié)作組建議的PM/DM分類診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究根據(jù)臨床表現(xiàn)、肺功能及胸部高分辨率CT明確肺間質(zhì)病變的存在，并排除其他可能引起類似肺間質(zhì)病變表現(xiàn)的病因，包括感染等。肺間質(zhì)病變的診斷依據(jù)影像學(xué)表現(xiàn)分型[4]。健康對照組(health donors，HD)20名，其中女性14名，男性6名，年齡29～78歲，平均(45±14)歲，來自本院健康體檢人群。PM/DM組與HD組性別﹑年齡構(gòu)成上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并取得受試對象的知情同意。

1.2 主要儀器和試劑

NanoVue核酸定量儀(GE Healthcare公司)，實(shí)時(shí)定量PCR儀ABI PRISM 7500型(美國ABI公司)，低溫高速離心機(jī)Allegra 64R Centrifuge(美國Beckman Coulter公司)， Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，淋巴細(xì)胞分離液(法國biowest公司),SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)，SYBR green PCR試劑盒(日本Takara公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分離PBMCs：安靜狀態(tài)下抽取靜脈血8 ml入肝素抗凝管中，采用密度梯度分離法，分離PBMCs。

1.3.2 總RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄：收集分離后的PBMCs，加1 ml Trizol試劑，振蕩混勻，室溫放置5 min；加入200 μl氯仿，劇烈振蕩15 s；室溫孵育2～3 min；4 ℃ 12 000 g離心15 min，將上清液移至焦磷酸二乙酯(DEPC)處理的Eppendorf管；加500 μl異丙醇，混勻，室溫靜置10 min；4 ℃ 12 000 g離心15 min，棄上清；加75%乙醇1 ml洗滌RNA，旋渦混勻；4 ℃ 7 500 g離心5 min，真空干燥5～10 min；以含1‰DEPC處理的無菌雙蒸水溶解RNA，DU 800核酸定量儀檢測RNA純度和濃度，A260/A280>1.8。所得RNA -80 ℃保存。抽提總RNA并鑒定RNA的質(zhì)量和完整性，定量后以1 μg RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系總體積20 μl，42 ℃ 2 min， 37 ℃ 15 min 85 ℃ 5 sec，4 ℃ 7 min合成第一鏈cDNA。RNA和cDNA均置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)：以核糖體蛋白L13a(RPL13A)為內(nèi)參照基因，檢索NCBI數(shù)據(jù)庫獲得目的基因MCP-1、IP-10, I-TAC、MCP-2、MIP-1α的cDNA全長序列，Oligo 6設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，由上海生工生物工程有限公司合成。具體引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Target gene primer sequence

1.3.4 SYBR green dye I 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)：SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包軟件分析結(jié)果。各樣本以RPL13A基因進(jìn)行標(biāo)化，計(jì)算目的基因的△ct值。以HD組標(biāo)本為參照，計(jì)算各組樣本中各目的基因的相對表達(dá)量。

1.3.5 趨化因子積分的計(jì)算： 參考文獻(xiàn)[5]的計(jì)算方法。簡要如下：計(jì)算HD組每一目的基因表達(dá)水平的平均值(Mean HD)及標(biāo)準(zhǔn)差(SD HD)，根據(jù)以下公式計(jì)算PM/DM組相應(yīng)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平(S)，其中GenePM/DM 表示一個(gè)PM/DM患者某一特定基因的相對表達(dá)水平。將每個(gè)樣本6個(gè)目的基因的S值相加，則得到該樣本的趨化因子積分。采用上述方法分別計(jì)算PM/DM組和HD組各樣本的趨化因子積分。

S=GenePM/DM - GeneMean HD /SD (GeneHD)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，采用中位數(shù)(第25百分位數(shù)，第75百分位數(shù))[M(P25,P75)]表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)趨化因子基因在各組表達(dá)水平的比較

PM/DM組PBMCs中MCP-1、IP-10、I-TAC、MCP-2及MIP-1α的表達(dá)均較HD組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

2.2 趨化因子積分在各組水平的比較

將MCP-1、IP-10、 I-TAC、MCP-2、MIP-1α的表達(dá)量整合后計(jì)算出趨化因子積分。結(jié)果顯示PM/DM組趨化因子積分[48.4(25.4,144.7)]較HD組[2.2(0.6，4.0)]顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.630，P< 0.01)。

2.3 不同肌炎組干擾素誘導(dǎo)趨化因子基因的表達(dá)

PM/DM組分為PM組與DM組，其中PM組24例，DM組28例。與HD組比較，PM組與DM組MCP-1、IP-10、 I-TAC、MCP-2及MIP-1α的表達(dá)水平顯著增高(P< 0.01)(表2)。而DM組上述6個(gè)干擾素誘導(dǎo)趨化因子基因表達(dá)水平與PM組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。趨化因子積分在PM組[67.6(27.4,447.7)]與DM組[54.7(36.7,180.2)]均較HD組[2.2(0.6,4.0)]顯著增高(Z=3.308和Z=-5.152，P<0.01)。

2.4 趨化因子積分與PM/DM疾病活動度相關(guān)性

采用肌炎活動性評價(jià)工具(myositisdisease activity assessmenttool，MDAAT)，以其中的肌炎疾病活動性評估視覺模擬量表評分(myositis disease activity assessment visual analogue scale，MYOACT)-總活動度評分評價(jià)患者疾病活動性。同一患者，與穩(wěn)定期[15.2(5.5，70.6)]相比，處于疾病活動期的趨化因子積分顯著升高[181.5(108.8，417.9)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.851，P<0.05)(圖1)。MDAAT疾病總活動度：MDAAT[治療前(8.3±1.5)；治療后(1.3±1.2)，P<0.05](圖2)，與此同時(shí)，趨化因子積分與MDAAT疾病總活動度也呈正相關(guān)(r=0.915,P<0.05)(圖3)。

2.5 ANA抗體陽性組患者趨化因子積分顯著升高

在PM/DM患者組中，ANA抗體陽性組30例，ANA抗體陰性組22例， ANA抗體陽性組趨化因子積分[181.4(33.3,964.8)]較ANA抗體陰性組[46.2(25.7,70.4)]顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.523，P<0.05)。

表2 干擾素趨化因子誘導(dǎo)基因在PM/DM、PM﹑DM及HD組的相對表達(dá)水平[M(P25,P7)]Table 2 Relative expression levels of interferon chemokine inducible genes in PM/DM, PM, DM and HD groups [M(P25,P7)]

aPM/DM與HD組比較；bPM與HD組比較；cDM與HD組比較；dDM組與PM組比較;*P<0.0 1

圖 1 活動期與穩(wěn)定期趨化因子積分比較Fig 1 Comparison of chemokine integrals between active phase and stationary phase

圖 2 治療前與治療后MDAAT疾病總活動度比較Fig 2 Comparison of total disease activity of MDAAT before and after treatment

圖 3 MDAAT與趨化因子積分的相關(guān)性Fig 3 Integral correlation of MDAAT and chemokines

2.6 抗Jo-1陽性患者趨化因子積分顯著升高

抗Jo-1陽性組11例，抗Jo-1陰性組41例，與抗Jo-1陰性組[51.3(25.4,151.1)]相比，抗Jo-1陽性組趨化因子積分[153.6(67.3,218.3])顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.236，P<0.05)。

2.7 肺間質(zhì)病變組與非肺間質(zhì)病變組趨化因子積分無明顯差異

在PM/DM患者中，肺間質(zhì)病變組18例，非肺間質(zhì)病變組34例，肺間質(zhì)病變組趨化因子積分[62.3(28.3,161.3)]與非肺間質(zhì)病變組[51.3(26.4,151.5)]比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.761，P=0.447)。

2.8 趨化因子積分與PM/DM其他臨床特征的關(guān)系

在PM/DM患者組中,趨化因子積分與CK(P>0.05，r=-0.189)、LDH(P>0.05，r=-0.214)、AST(P>0.05，r=-0.517)、ALT(P>0.05，r=-0.211)均無明顯相關(guān)性。

3 討論

近年來，針對自身免疫性疾病致病機(jī)制研究中，特別是在特發(fā)性炎性肌病(Idiopathic inflammatory myopathy，IIM)發(fā)病機(jī)制中，Ⅰ型干擾素通路的研究為目前研究熱點(diǎn)[6-8]。干擾素通路包括Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)物、Ⅰ型干擾素、Ⅰ型干擾素信號通路、調(diào)控Ⅰ型干擾素表達(dá)的分子、Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)的基因及蛋白、以及受Ⅰ型干擾素調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子和趨化因子等。本課題組先前研究顯示PM/DM組患者Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)基因OAS-1﹑IFIT1﹑IFIT4﹑IFI44﹑RSAD2及MX-1的mRNA水平均明顯高于健康對照組，提示Ⅰ型干擾素通路參與炎癥性肌病的發(fā)病[9]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探索Ⅰ型干擾素調(diào)節(jié)的趨化因子是否參與了PM/DM的發(fā)病。

有報(bào)道 IIM 患者的血清MCP-1和MIP-1α表達(dá)升高[10-11]。Sanner等[12]對54例少年皮肌炎(junior dermatomyositis,JDM)患者確診后隨訪治療平均16.8年，并與54例性別和年齡相匹配的健康對照組相比較，血清嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin)﹑MCP-1及IP-10水平在JDM患者顯著升高(31.5%，37.2%，43.2%,P<0.05), eotaxin及MCP-1表達(dá)水平與患者年齡及疾病病程有正相關(guān)(r=0.47及r=0.64，P<0.001),且可能作為提示疾病早期的重要參數(shù)，隨訪發(fā)現(xiàn)MCP-1高表達(dá)與患者器官損傷程度顯著相關(guān)。多篇報(bào)道研究顯示IL- 6、 IL-10、IL-15、IL-17、MCP-1、MCP-2、MCP-4、I-TAC/CXCR1-3、 MIP-1α和MIP-1β參與T細(xì)胞調(diào)控[13-17]。有研究顯示Th1細(xì)胞經(jīng)由干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)和CXCR3相互作用能使DM發(fā)生皮膚病變[18]。趨化因子和細(xì)胞因子在DM患者局部組織表達(dá)上調(diào)，與MHC-I類上調(diào)是平行的，與募集特定的T細(xì)胞至靶組織有關(guān)[19]。DM患者受累皮膚[20-22]或肌肉[2,18,22]檢測到Ⅰ型干擾素趨化因子及其配體：包括MIG/CXCL9﹑IP10/CXCL10﹑I-TAC/CXCL11,這可能與Ⅰ型干擾素募集淋巴細(xì)胞至炎性病灶有關(guān)。上述研究提示PM/DM患者可能存在Ⅰ型干擾素通路異常活化，Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)的趨化因子參與了疾病的發(fā)生及進(jìn)展。

目前國內(nèi)尚缺乏這方面的研究，為較全面反映該通路的活化狀態(tài)，在高通量基因芯片等國外最新研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，本研究選擇5個(gè)具有代表性的干擾素誘導(dǎo)趨化因子基因，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法分別檢測其表達(dá)水平，并將其整合后計(jì)算出趨化因子積分，探討趨化因子積分與PM/DM疾病活動度及臨床特征的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與HD組相比，干擾素誘導(dǎo)趨化因子及趨化因子積分在PM/DM患者中顯著增高，這與近年來國外研究發(fā)現(xiàn)PM/DM患者外周血與肌肉活檢標(biāo)本中出現(xiàn)高表達(dá)IFN誘導(dǎo)趨化因子基因的結(jié)果[23-24]相符。Bilgic等[24]對56例DM患者檢測外周血計(jì)算基于I-TAC、IP-10、MCP-1及MCP-2計(jì)算得出干擾素趨化因子積分和血清IL-6的高表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)DM患者中IL-6與干擾素趨化因子積分和疾病的活動度有很強(qiáng)相關(guān)性，提示IL-6介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素通路可能參與DM致病，監(jiān)測這些通路中的失調(diào)將有助于指導(dǎo)診斷和治療。

Reed等[23]研究發(fā)現(xiàn)在JDM及DM患者中Ⅰ型干擾素積分(基于IFIT1、GIP-2及IRF7計(jì)算得出)顯著增加，且與疾病的活動性正相關(guān)(r=0.33，P=0.023),治療前后對比，研究結(jié)果顯示JDM及DM患者在受累肌肉組織及外周血細(xì)胞同時(shí)存在多種趨化因子(I-TAC、IP-10及MCP-1)表達(dá)上調(diào)，且干擾素趨化因子積分與疾病活動性相關(guān)(r=0.53，P<0.001)[12,24-25]。近年來，除血清肌酶水平外，MDAAT可用于評價(jià)疾病的活動性[2,26-27],但實(shí)際上MDAAT測定較為繁瑣，臨床實(shí)踐中缺乏可行性。本研究顯示同一患者，與穩(wěn)定期相比，疾病活動期的趨化因子積分顯著升高(P<0.05)。且趨化因子積分與MDAAT疾病總活動度相關(guān)，提示Ⅰ型干擾素通路的激活與PM/DM的疾病活動密切相關(guān)，趨化因子積分較好地反映PM/DM患者疾病的活動度。

本研究未發(fā)現(xiàn)趨化因子積分與肌酶相關(guān)性，可能與以下原因相關(guān)：(1)該研究納入的樣本例數(shù)不足；(2)當(dāng)血清中存在肌肉嚴(yán)重萎縮或肌酶抑制物時(shí)，也可能出現(xiàn)肌病患者肌酶水平增高不明顯的情況。(3)研究表明CK在反映慢性炎癥性肌病的疾病活動性方面敏感性不如病程短的急性起病者。

Gono等[26]對38例PM/DM患者外周血清研究發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-8、TNF-α及IP-10表達(dá)顯著增加，且在肺間質(zhì)病變組表達(dá)明顯高于非肺間質(zhì)病變組，并在治療后降低。本研究肺間質(zhì)病變組趨化因子積分[62.3(28.3,161.3)]較非肺間質(zhì)病變組[51.3(26.4,151.5)]無顯著升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.761，P=0.447)，可能與選擇的指標(biāo)及病例不同肺間質(zhì)病變類型不同有關(guān)。

本研究顯示ANA抗體陽性組以及抗Jo-1抗體陽性組患者均較抗體陰性者趨化因子積分明顯升高，提示干擾素通路活化可能與某些自身抗體的出現(xiàn)有關(guān)。Ⅰ型干擾素可誘導(dǎo)正常的單核細(xì)胞向活化的樹突狀細(xì)胞(DC)分化[24]，活化的DC可將自身抗原向T細(xì)胞提呈，能夠誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞活化，最終導(dǎo)致自身免疫。Ⅰ型干擾素還可促進(jìn)CD8+效應(yīng)性T細(xì)胞的分化和存活；增強(qiáng)B細(xì)胞向漿細(xì)胞的分化，從而增加自身抗體的產(chǎn)生[14]，這些環(huán)節(jié)都在PM/DM的發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用。另外我院除了抗Jo-1抗體以外，其他肌炎特異性自身抗體檢測需外送進(jìn)行。因此本研究納入的患者，僅部分能夠完成肌炎16項(xiàng)自身抗體譜檢查，尚不足以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其他肌炎抗體與趨化因子積分的相關(guān)性，此為本研究的局限性。

西法木單抗(sifalimumab)是anti-IFN-α單克隆抗體。Guo等[28]納入48例DM和PM患者進(jìn)行了西法木單抗Ⅰb期臨床試驗(yàn),該研究為多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照研究。在治療前后通過免疫組化、實(shí)時(shí)定量PCR以及血清蛋白多重檢測法觀察肌肉和外周血的13種IFIG水平的變化，結(jié)果顯示在治療98天后的血清MCP-1和MCP-2水平分別被抑制74.9%和81.2%,血清IL - 2ra,IL- 18,TNFR2和BAFF水平均有不同程度的降低降低，肌肉組織中發(fā)現(xiàn)其有顯著性T細(xì)胞浸潤的減少，該研究為IIM患者Ⅰ型干擾素通路的干預(yù)治療預(yù)示了良好前景。

綜上，本研究測定了5個(gè)Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)趨化因子基因的相對表達(dá)量，得到了趨化因子積分，能夠較好反映Ⅰ型干擾素活性，對趨化因子積分和臨床表型進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)與PM/DM活動及自身抗體的產(chǎn)生密切相關(guān)，有助于了解PM/DM患者Ⅰ型干擾素通路活化狀態(tài)，為臨床醫(yī)師評估其疾病活動性和預(yù)后提供了較好的指標(biāo)，也為將來Ⅰ型干擾素通路干預(yù)治療提供了新的證據(jù)。