獨(dú)活寄生湯對(duì)改良Hulth法造模大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨形態(tài)的影響

趙忠勝 ，黃云梅 ，鄭若曦 ，邱建清 ，劉淑如 ，吳廣文

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）多見于中老年人，是最常見的骨關(guān)節(jié)炎類型。隨著人口老齡化及肥胖人口增加，其發(fā)病率逐年增加［1-2］。膝骨關(guān)節(jié)炎易反復(fù)發(fā)作，纏綿難愈，具有較高的致殘率。KOA以軟骨退變、滑膜炎癥、骨贅形成、軟骨下骨硬化等為主要病理特征［3］，其確切病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前的治療方法以對(duì)癥治療為主，仍未找到能夠延緩KOA進(jìn)展的有效方法［4］。早期進(jìn)行干預(yù)預(yù)防可延緩關(guān)節(jié)軟骨退變、修復(fù)軟骨損壞，對(duì)防治KOA的進(jìn)一步發(fā)展有重要意義［5-6］。獨(dú)活寄生湯作為中藥復(fù)方，具有扶正祛邪、標(biāo)本兼顧的特點(diǎn)，能有效緩解KOA患者的臨床癥狀。研究表明：獨(dú)活寄生湯能抑制軟骨細(xì)胞凋亡，延緩軟骨退變，但其效應(yīng)的作用機(jī)制有待深入研究［7-8］。本研究觀察獨(dú)活寄生湯對(duì)改良Hulth法造模大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨形態(tài)的影響，從形態(tài)學(xué)角度探討其作用機(jī)制，為其臨床運(yùn)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)2月齡雄性SD大鼠66只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［合格證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005］提供。動(dòng)物處理方法符合中華人民共和國(guó)科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 獨(dú)活寄生湯藥物組成：獨(dú)活9 g，桑寄生 6 g，牛膝 6 g，杜仲 6 g，秦艽 6 g，防風(fēng) 6 g，肉桂 6 g，細(xì)辛 6 g，當(dāng)歸 6 g，川芎 6 g，熟地黃 6 g，芍藥 6 g，人參 6 g，茯苓 6 g，甘草 6 g；鹽酸氨基葡萄糖膠囊（香港澳美制藥廠）；均購(gòu)于福州市閩侯縣上街致誠(chéng)醫(yī)藥商店。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥液制備 獨(dú)活寄生湯藥液按照大鼠數(shù)量、體質(zhì)量，計(jì)算出用藥量，加入蒸餾水煎煮的藥液，濃縮至濃度為0.93 g／mL，-20℃保存?zhèn)溆谩｛}酸氨基葡萄糖膠囊用蒸餾水配制，濃度為0.15 g／mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 BioSpec 70／20 USR小動(dòng)物核磁共振成像儀（瑞士布魯克公司）；RM2265石蠟切片機(jī)、DM4000B研究級(jí)生物顯微鏡（德國(guó)徠卡儀器公司）；Moticam5000c＋Motic M形態(tài)學(xué)顯微圖像采集與分析系統(tǒng)（廈門市麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；改良番紅O-固綠軟骨染色液（北京Solarbio生物技術(shù)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組18只和造模組48只。采用改良Hulth法造模：大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板［9］。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素20萬U預(yù)防感染。手術(shù)傷口愈合后開始每天強(qiáng)迫大鼠活動(dòng)0.5 h，連續(xù)2周。

2.2 大鼠膝關(guān)節(jié)MRI掃描 大鼠造模強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)2周后，隨機(jī)抽取正常組、造模組大鼠各3只，拍攝膝關(guān)節(jié)MRI，觀察膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展情況。采用氣體（異氟烷與氧氣混合，比例1∶4）麻醉裝置對(duì)大鼠進(jìn)行持續(xù)麻醉，掃描過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠生命體征。將大鼠仰臥位固定于檢查板，膝伸直輔以軟墊固定，環(huán)形表面線圈固定于關(guān)節(jié)正上方，線圈中心正對(duì)脛骨平臺(tái)，采用冠狀位和矢狀面T2WI序列進(jìn)行成像。T2WI序列采用TurboRARE序列，參數(shù)如下：TR＝4 554.863 ms，TE＝35.0 ms，層厚 0.4 mm，矩陣 256×256，F(xiàn)OV 30×20 mm2，掃面層數(shù) 13 層，平均次數(shù)4 次，掃描時(shí)間 9 min、43 s、22 ms。

2.3 干預(yù) 造模結(jié)束后，抽簽法將造模組隨機(jī)分為3組，即模型組、對(duì)照組和治療組各15只。根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”換算［10］，灌胃給藥12周，2周1個(gè)療程，每個(gè)療程間隔2 d。正常組和模型組按 10 mL／（kg·d）給予 0.9%NaCl溶液灌胃；對(duì)照組按 0.15 g／（kg·d）給予鹽酸氨基葡萄糖膠囊灌胃；治療組按 0.93 g／（kg·d）給予獨(dú)活寄生湯灌胃。

2.4 取材 灌胃結(jié)束后，采用2%戊巴比妥鈉溶液按2 mL／kg的劑量麻醉大鼠，切取左側(cè)脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)軟骨組織。標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定48 h后，用10%EDTA-2Na脫鈣液中脫鈣8周，每3天換1次脫鈣液。組織標(biāo)本修切后，常規(guī)石蠟包埋。

2.5 軟骨組織HE染色與Mankin評(píng)分 組織切片常規(guī)脫蠟至水后，蘇木素染色10 min，蒸餾水漂洗1 min，1%鹽酸酒精分色3 s，自來水洗，返藍(lán)15 min；伊紅染色3 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，干燥，封片，顯微鏡下觀察軟骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。各組軟骨組織HE染色后，每張切片選取5個(gè)不同視野，參照Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［11］，從軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞狀態(tài)、基質(zhì)染色、潮線的完整性等方面進(jìn)行評(píng)分。

2.6 番紅O-固綠染色與OARSI評(píng)分 組織切片常規(guī)脫蠟至水后，在新配制Weigert染色液（A1∶A2＝1∶1）中浸染 5 min，酸性分化液分化 15 s，蒸餾水洗10 min，固綠染色液內(nèi)浸染5 min，快速用弱酸溶液洗滌15 s以去除殘留固綠，番紅O染色液浸染7 min，分別用95%、100%酒精脫水，二甲苯透明，干燥，封片，鏡下觀察軟骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。番紅O-固綠染色后，每張切片選取5個(gè)不同視野，參照OARSI關(guān)節(jié)病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［12］，從蛋白多糖丟失、軟骨丟失、縱裂或糜爛、病變到達(dá)鈣化軟骨等方面進(jìn)行評(píng)分。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布以中位值（第一四分位數(shù)，第三四分位數(shù)）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡情況 在實(shí)驗(yàn)過程中，模型組因麻醉意外致死1只，灌胃過程因肺栓塞致死1只；治療組灌胃過程因腹瀉致死1只；對(duì)照組灌胃過程因肺栓塞致死1只。最終共56只進(jìn)入結(jié)果分析。

3.2 大鼠膝關(guān)節(jié)MRI 正常組可見關(guān)節(jié)間隙正常，內(nèi)外側(cè)半月板結(jié)構(gòu)完整，股骨髁和脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)面平整。造模組關(guān)節(jié)間隙增寬，內(nèi)側(cè)半月板缺如，關(guān)節(jié)軟骨面不平整、軟骨層變薄、局部缺損，結(jié)締組織增生，骨贅形成，關(guān)節(jié)腫脹積液明顯。見圖1。

圖1 大鼠膝關(guān)節(jié)MRI影像圖

3.3 關(guān)節(jié)軟骨HE染色 正常組關(guān)節(jié)軟骨表面平整，四層結(jié)構(gòu)清晰，無裂隙或中斷，細(xì)胞排列整齊，基質(zhì)染色均勻，潮線完整。模型組軟骨表面粗糙、碎裂或缺失，裂隙深達(dá)輻射層，軟骨細(xì)胞排列混亂，基質(zhì)染色不均勻，潮線破壞，軟骨下骨增生明顯。對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨表面不規(guī)整，軟骨層變薄，局部有表淺裂隙，軟骨細(xì)胞部分缺失，局部細(xì)胞增生，基質(zhì)染色不均勻，潮線尚完整，軟骨下骨結(jié)構(gòu)紊亂。治療組關(guān)節(jié)軟骨表面不規(guī)則，層次完整，軟骨細(xì)胞彌漫性增生，排列輕度紊亂，潮線完整，軟骨下骨無明顯改變。見圖2。

3.4 關(guān)節(jié)軟骨番紅O-固綠染色 番紅O是堿性染料，與硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素等酸性蛋白多糖結(jié)合，將軟骨基質(zhì)染成紅色；固綠是酸性染料，與富含堿性氨基酸的膠原纖維結(jié)合，將軟骨淺表層、軟骨下骨染成綠色。正常組可見軟骨基質(zhì)紅染，顏色鮮艷，固綠將淺表層、軟骨下骨染成綠色。模型組番紅O染色中重度減弱，部分失染；局部地方細(xì)胞增生、肥大，細(xì)胞數(shù)量增多。對(duì)照組和治療組經(jīng)干預(yù)后，均較模型組改善，番紅O染色增強(qiáng)，染色變深，表明治療后蛋白多糖表達(dá)上升，治療組較對(duì)照組改善更明顯，染色更深，說明治療組療效優(yōu)于對(duì)照組。見圖3。

圖2 關(guān)節(jié)軟骨HE染色圖（×100）

圖3 關(guān)節(jié)軟骨番紅O-固綠染色圖（×100）

3.5 4組軟骨組織Mankin評(píng)分、OARSI評(píng)分比較見表1。

表1 4組軟骨組織Mankin評(píng)分、OARSI評(píng)分比較（） 分

表1 4組軟骨組織Mankin評(píng)分、OARSI評(píng)分比較（） 分

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01；與對(duì)照組比較，3） P＜0.01。

組別正常組模型組對(duì)照組治療組n 15 13 14 14 Mankin評(píng)分0.33（0.00，0.83）11.28±1.271）8.92±1.682）6.58±1.562）3）OARSI評(píng)分0.33（0.00，0.83）5.27±0.791）4.58±0.792）3.00±0.852）3）

4 討 論

骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，是眾多因素相互作用的結(jié)果。KOA發(fā)生發(fā)展不僅是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)分解與合成代謝的失衡，還是全身衰老性改變的局部反應(yīng)［10］。 軟骨的退變是 KOA 的基本病變［13-14］，軟骨表面的膠原纖維退化，使軟骨負(fù)荷面變薄，粗糙不平，軟骨的深層發(fā)生裂隙。關(guān)節(jié)受力異常，關(guān)節(jié)軟骨磨損刺激關(guān)節(jié)滑膜和軟骨細(xì)胞出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，繼發(fā)滑膜組織增生、關(guān)節(jié)積液和軟骨營(yíng)養(yǎng)障礙［10，13］。磨損導(dǎo)致局部軟骨消失和外圍軟骨的增生，骨贅形成，加重關(guān)節(jié)畸形和破壞，導(dǎo)致軟骨下骨外露、硬化、囊變及關(guān)節(jié)間隙的變窄［15-16］。模型的選擇與建立是研究KOA病理機(jī)制及防治的必要手段，誘發(fā)動(dòng)物KOA模型可通過關(guān)節(jié)機(jī)械制動(dòng)、手術(shù)改變關(guān)節(jié)應(yīng)力、破壞關(guān)節(jié)局部血液循環(huán)、藥物關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射等多種方法。本實(shí)驗(yàn)采用與DMM造模法類似的改良Hulth 法造模［9，17］，一方面，膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻，力學(xué)軸線改變，負(fù)重力線內(nèi)移，關(guān)節(jié)面緩沖力較低，形成應(yīng)力集中而繼發(fā)骨小梁微骨折、骨質(zhì)塌陷；另一方面，膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性降低，脛股關(guān)節(jié)面軟骨磨損，引起軟骨退變；加之造模后，強(qiáng)迫大鼠運(yùn)動(dòng)，加速KOA形成。

大鼠造模1個(gè)月后膝關(guān)節(jié)MRI顯示：關(guān)節(jié)軟骨變薄、缺損，關(guān)節(jié)腔內(nèi)積液，表明經(jīng)改良Hulth法造模后，大鼠膝關(guān)節(jié)已向骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展，出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的早期病理表現(xiàn)。干預(yù)后HE染色、番紅O－固綠染色結(jié)果顯示，模型組軟骨退變、破壞等；正常組Mankin評(píng)分明顯低于模型組，表明改良Hulth法造模4個(gè)月后，大鼠膝關(guān)節(jié)已出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的中晚期病理表現(xiàn)。綜合對(duì)比正常組與模型組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明改良Hulth法是誘發(fā)大鼠KOA理想的造模方法，與KOA發(fā)病機(jī)制相符，貼近臨床實(shí)際，是一種理想合理的造模方法。

膝骨關(guān)節(jié)炎屬“痹痛”“骨痹”范疇，以虛為本，以痰、瘀之實(shí)為標(biāo)，屬本虛標(biāo)實(shí)、本痿標(biāo)痹之證［18］。KOA的治療以控制疼痛、延緩軟骨退變、改善關(guān)節(jié)功能為目標(biāo)。早期KOA以保守治療為主，旨在延緩病情進(jìn)展；中晚期KOA以手術(shù)治療為主，配合保守治療，旨在緩解疼痛，改善關(guān)節(jié)功能，提高生活質(zhì)量。對(duì)于早期KOA的治療，中醫(yī)藥有良好的臨床療效。獨(dú)活寄生湯具有補(bǔ)肝腎、益氣血、祛風(fēng)濕、止痹痛之效。現(xiàn)代藥理學(xué)、臨床應(yīng)用研究表明，獨(dú)活寄生湯具有抗炎鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)、延緩軟骨退變等作用［5，19-20］，廣泛應(yīng)用于骨性關(guān)節(jié)炎、腰椎間盤突出癥等骨科疾病。關(guān)于其治療KOA的機(jī)制，仍在進(jìn)一步探索之中。

本研究在應(yīng)用改良Hulth法誘發(fā)大鼠KOA模型的基礎(chǔ)上，觀察獨(dú)活寄生湯對(duì)KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)的影響，從形態(tài)學(xué)角度探究獨(dú)活寄生湯治療KOA的機(jī)制。治療結(jié)束后，模型組取材后肉眼觀察示：關(guān)節(jié)周圍滑膜、韌帶等結(jié)締組織增生明顯，關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨被大量增生組織包裹，軟骨表面蒼白不平整；形態(tài)學(xué)染色示：淺表層毛糙，局部缺損，軟骨細(xì)胞增生、肥大，細(xì)胞數(shù)量增多，軟骨下骨結(jié)構(gòu)紊亂、增生，說明改良Hulth法造模后，大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下結(jié)構(gòu)病變嚴(yán)重，病變累及軟骨層及軟骨下骨。治療組取材后肉眼觀察示：關(guān)節(jié)周圍滑膜、韌帶等結(jié)締組織增生較輕，軟骨表面有血色、較平滑；形態(tài)學(xué)染色示：軟骨表面較平滑，軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，排列較規(guī)則、整齊，軟骨基質(zhì)中蛋白多糖含量增加。治療組病理變化明顯較模型組輕，說明獨(dú)活寄生湯在一定程度上可以抑制軟骨退變，以維持軟骨結(jié)構(gòu)的完整性；促進(jìn)軟骨細(xì)胞及基質(zhì)分解與合成代謝，以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，增強(qiáng)軟骨修復(fù)功能，從而有效抑制KOA的進(jìn)展。