高效液相色譜法測定經酸水解后蓮房中槲皮素的含量

肖建平 ，李 彧 ，曾榮潔 ，林 超 ，陳建忠

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建省康復技術重點實驗室，福建 福州 350003；3.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

蓮房為睡蓮科多年水生草本植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥成熟花托，是蓮子生產過程中的副產物，同時也是一味藥用部位獨特的中藥，主產于福建、湖南、湖北、江蘇、浙江等地。根據(jù)2015年版《中國藥典》記載，蓮房炭（蓮房的炮制品）味苦、澀，性溫，歸肝經，用于崩漏、尿血、痔瘡出血、產后瘀阻、惡露不盡等［1-4］。藥理研究表明，蓮房具有較明顯的抗氧化作用［5-6］，也可配伍用于治療母兒ABO血型不合溶血?。?-8］。目前2015年版《中國藥典》一部中對蓮房的檢測項目僅有藥材性狀鑒別、粉末顯微鑒定、水分和灰分的要求，整體過于簡單，不能滿足蓮房質量控制的要求。蓮房中主要含有黃酮類和多酚類活性成分，其中黃酮類有金絲桃苷、槲皮素等，多酚類成分有原花青素等。這些成分大都與蓮房的許多保健和治療作用密切相關［9-11］。但考慮到原花青素類化合物結構相對復雜、不夠穩(wěn)定和對照品不易獲取等因素［12］，本研究根據(jù)前期的文獻調研，以槲皮素為指標性成分，建立經水解的蓮房中槲皮素含量的測定方法，為提升和完善蓮房的質量標準提供實驗數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試藥 槲皮素對照品（批號：100081-200603，純度：96.5%）購自中國食品藥品檢定研究院，色譜純甲醇購于默克公司，水為超純水，其余溶劑為分析純。15批蓮房樣品主要收集于福建、北京、廣東等地，經鑒定為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥花托。

1.2 儀器 Alliance高效液相色譜儀 （美國Waters公司）包括Empower化學工作站、二極管陣列檢測器（PDA）等；BSA系列電子分析天平（德國塞多利斯科學儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Thermo Scientific Syncronis C18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.012 5%磷酸溶液（60∶40）；檢測波長為 370 nm；流速為 1.0 mL／min；柱溫為 30 ℃，進樣量為 20 μL。在上述色譜條件下，槲皮素的保留時間為8.3 min，樣品中其他成分不影響測定，見圖1。理論板數(shù)按槲皮素峰計算均不低于3 000。

2.2 對照品溶液的制備 取槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇-鹽酸（55%，v／v）混合溶液（4∶1，v／v），制成每1 mL中含槲皮素9.866 μg的對照品溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號篩）約0.3 g，精密稱定，置150 mL圓底燒瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（55%，v／v）混合溶液（4∶1，v／v）25 mL，密塞，稱定重量，85℃恒溫水浴加熱回流3.0 h后，取出，冷水迅速冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇-鹽酸（55%，v／v）混合溶液（4∶1，v／v）補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 檢測限與定量限 以信噪比為3∶1確定槲皮素的檢測限為7 ng；以信噪比為10∶1確定槲皮素的定量限為14 ng。

圖1 HPLC色譜圖

2.4.2 線性關系 精密稱取槲皮素對照品12.33 mg，置 250 mL容量瓶中，加甲醇-55%鹽酸（4∶1）的混合溶液至刻度，搖勻。精密吸取該溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL 轉移至 2 mL 容量瓶中，分別加甲醇-55%鹽酸溶液（4∶1）混合溶液，稀釋至刻度，搖勻，制成槲皮素濃度為2.466、4.933、9.866、14.80、19.73、24.67、37.00 和 49.32 μg／mL 的對照品溶液。準確吸取上述對照品溶液20 μL，按上述確定的色譜條件進行測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，槲皮素回歸方程為Y＝82 458X＋19 253，相關系數(shù)r＝0.999 8。

2.4.3 精密度試驗 日內精密度：準確吸取同一供試品（收集地福建福州，產地福建）溶液20 μL，連續(xù)進樣6次，測得槲皮素的峰面積RSD為1.4%。日間精密度：上述供試品溶液連續(xù)測定3 d，每日測定6次，測得槲皮的素峰面積RSD為1.9%。

2.4.4 重現(xiàn)性試驗 取同一樣品6份，精密稱定，按“2.3”項下的供試品溶液制備方法操作，在上述色譜條件下進行進樣測定，測得槲皮素的含量RSD為1.6%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 準確吸取同一供試品溶液20 μL，分別在 0、4、12、24、48、72 h 進行測定，以槲皮素的峰面積進行考察，進樣6次，測得槲皮素的峰面積RSD為1.5%，表明樣品至少在72 h內穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知槲皮素含量的蓮房樣品粉末0.15 g，精密稱定9份，每3份加入相同量（分別為已知含量的80%、100%和120%）的槲皮素對照品，按“2.3”項下供試品溶液制備方法操作、測定。結果見表1。

表1 槲皮素的加樣回收率結果（n＝9）

2.5 樣品測定 按照本方法的測定條件，分別測定15批次的蓮房樣品，每個批次平行2份，每份樣品平行進樣3針，以外標法計算樣品中槲皮素的含量，結果見表2。

3 討 論

3.1 指標性成分的選擇 蓮房中含有多種黃酮苷和黃酮苷元成分，這些黃酮又多具有良好的藥理活性。因此，對這些黃酮的含量測定是對蓮房進行質量控制的有效方法。但是目前多數(shù)黃酮苷對照品還未有商品化供應，且很多苷的化學結構不穩(wěn)定，故選擇黃酮苷作為蓮房的質量控制指標在實際應用中尚有一定的困難，而蓮房水解后黃酮苷元槲皮素的含量較高，檢測的穩(wěn)定性較好，同時又與蓮房的藥理活性具有相關性，且對照品相對穩(wěn)定、價廉易得，所以選擇槲皮素作為蓮房質量控制的指標性成分。

表2 不同批次蓮房中槲皮素的含量結果（n＝2）

3.2 提取方法的選擇及優(yōu)化 前期預實驗我們曾采取溶劑直接提取測定槲皮素的方法［13-14］，但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，槲皮素的含量很低，回收率不穩(wěn)定。后經文獻調研，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)黃酮苷類化合物口服后，首先在消化道上皮細胞水解酶或腸道微生物作用下，水解或轉變成相應的黃酮苷元后再被吸收而發(fā)揮療效，所以口服黃酮苷類化合物的效應實際為其苷元的活性［15-16］?；瘜W成分研究表明，蓮房中黃酮苷的苷元多數(shù)為槲皮素，因此本試驗采用酸水解方式提取蓮房后，用HPLC法測定槲皮素的含量，結果表明酸水解后槲皮素含量明顯上升，并且方法的提取率高、簡便、穩(wěn)定、準確。

在供試品溶液制備中，我們分別考察不同酸度的提取溶劑（30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%鹽酸的混合溶液）、不同提取溫度（75、80、85、90、95 ℃）、不同提取時長（1.5、2.0、3.0、4.0 h）和不同提取的次數(shù)（1次和 2 次）。 結果表明，以甲醇-鹽酸（55%，v／v）混合溶液（4∶1，v／v）為溶劑，在 85 ℃恒溫水浴下加熱水解1次，每次3.0 h，為蓮房的最佳提取方法。在我們的實驗過程中，還發(fā)現(xiàn)溶劑對槲皮素的響應值影響較大，所以配制對照品溶液時，必須使用與制備供試品溶液相同的溶劑。

3.3 耐受性實驗 在耐受性實驗中，分別考察3種不同品牌的 C18色譜柱、不同流速（0.9、1.0、1.1 mL／min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）和不同流動相 pH 值（2.05、2.25和2.35）等，結果表明，色譜條件的微小變化對測定結果影響不大（RSD＜1%），說明本方法的耐用性好。

3.4 樣品中槲皮素的含量差異 從實驗結果可以看出不同批次的蓮房之間槲皮素的含量差別較大，說明各地各批次的蓮房品質可能有著較大的區(qū)別，這不利于中醫(yī)的臨床用藥。因此，本文報道蓮房中槲皮素的含量測定方法，簡單、可靠和重現(xiàn)性好，可用于中藥蓮房的質量控制與評價研究，對于提高質量、保證臨床療效具有重要意義。同時，該結果也為《中國藥典》一部中蓮房的質量標準提升奠定基礎。