參附注射液聯(lián)合阿奇霉素治療小兒支原體肺炎的臨床療效及機制

張 軍，封其華

(1. 蘇州大學附屬兒童醫(yī)院風濕免疫科，江蘇蘇州 215025；2. 宿遷市第一人民醫(yī)院兒科，江蘇宿遷 223899)

近年來，肺炎支原體感染(mycoplasma pneumonia infection, MP)約占小兒肺炎發(fā)生率的10%～20%，逐漸成為小兒感染性呼吸道疾病的主要病原體之一。MP不僅可繼發(fā)咽炎、扁桃體炎等呼吸道多種感染，甚至還可導致腦膜炎、肝炎、心肌炎等，嚴重時也可導致患兒死亡[1]。目前，臨床上治療支原體肺炎常用藥物是以阿奇霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為主，但是近年來病原體對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性顯著增加。因此，尋找適當?shù)穆?lián)合用藥可更好促進大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的臨床療效，降低其副作用?，F(xiàn)代醫(yī)學認為小兒肺炎的發(fā)病機制與病菌入侵、免疫功能紊亂有關(guān)[2]。參附注射液屬于臨床常見中成藥，主要含人參皂苷和水溶性生物堿，對免疫、心臟等均具有明顯調(diào)理作用[3]。本研究擬觀察參附注射液聯(lián)合阿奇霉素治療小兒MP的臨床療效，并探討其可能的分子機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年6月-2017年6月于蘇州大學附屬兒童醫(yī)院風濕免疫科收治的肺炎患兒80例為研究對象，其中男46例，女34例；年齡2月～12歲，平均年齡(6.2±3.8)歲，病程5～14 d。用隨機數(shù)字法將入選病例隨機分為2組，每組40例，其中觀察組男性24例，女性16例；對照組男性22例，女性18例。兩組之間性別、年齡、病程、阿奇霉素藥敏實驗等資料差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 診斷標準及治療方法在入組肺炎患兒中，診斷為MP的依據(jù)[4]：以發(fā)熱、咳嗽為主要癥狀；胸片顯示肺部云霧狀或扇狀游走陰影等；ELISA法檢測血中MP-IgM結(jié)果為陽性(滴度≥1∶64)。同時排除病程長于14 d；重癥肺炎；伴有其他系統(tǒng)嚴重疾病者；已接受其他相關(guān)治療者。

兩組患兒入院后均給予止咳、平喘、退熱、祛痰、補液等常規(guī)對癥處理。對照組給予阿奇霉素10 mg/kg，靜脈滴入，每日1次，共3 d。觀察組在對照組的基礎(chǔ)上同時予以參附注射液，100 mL/(次?d)，溶于50 g/L葡萄糖注射液250 mL，靜脈滴入，1次/d，共3 d。兩組均在癥狀、體征、X線表現(xiàn)及肺炎支原體滴度恢復正常時停藥。

1.3 觀察指標兩組在治療前后均常規(guī)檢查血、尿及大便常規(guī)和肝腎功能、胸片及肺炎支原體滴度等。觀察兩組治療前后咳嗽持續(xù)時間、肺部啰音消失時間、退熱時間、X線陰影吸收時間。記錄兩組治療前及治療后第7天時CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞群比例及CD4+/CD8+比值。

1.4 療效及不良反應(yīng)判定參照療效評定標準[5]如下。治愈：患兒咳嗽、發(fā)熱等臨床癥狀消失，肺部無啰音，胸部X線檢查恢復正常，肺炎支原體滴度恢復正常；顯效：患兒臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)，肺部啰音顯著減少，胸部X線有一項異常，肺炎支原體滴度恢復正常；有效：患兒臨床癥狀緩解，肺部啰音較前減少，胸部X線仍有陰影，肺炎支原體滴度正常；無效：患兒臨床癥狀無緩解，體征無改善，胸部X線未明顯改變，肺炎支原體檢測仍陽性。有效率=(治愈+顯效+有效)例數(shù)/總例數(shù)×100%。不良反應(yīng)主要指：口干舌燥、面部潮紅、心悸、血壓升高、惡心、頭痛、大便干燥等。

1.5 人淋巴細胞分離取患兒新鮮抗凝血2 mL，混入2 mL Hank’s液，再加入等體積的淋巴細胞分離液，以1 000 r/min離心15 min，收集第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層，放入4 mL細胞洗滌液中，再次離心20 min，棄上清，重復2次后即可獲得人T淋巴細胞，用于后續(xù)實驗。

1.6 miR-181a轉(zhuǎn)染用慢病毒將miR-181a轉(zhuǎn)染入人T淋巴細胞中。在裝有miR-181a mimics(購自廣州銳博生物公司)EP管中加入250 μL DEPC水，取20 μL miR-181a mimics與500 μL opti-MEM混合，輕輕吹打均勻后室溫作用25 min，在60 mm培養(yǎng)皿(細胞數(shù)約為7.0×105)中加入4 mL無血清DMEM和混合的opti-MEM，培養(yǎng)6 h，棄去無血清DMEM后正常培養(yǎng)。

1.7 miR-181a的檢測按照TaKaRa RNA Extraction試劑盒的操作步驟，從人T淋巴細胞中提取總RNA。采用加尾反轉(zhuǎn)錄法，按試劑盒(Bulge-LoopTMmiRNA-181a qPCR，購自廣州銳博生物公司)的操作步驟，從提取的總RNA中檢測患兒血漿中miR-181a水平。

1.8 MTT法檢測按照實驗要求，取1×104的轉(zhuǎn)染miR-181a的或正常的人T淋巴細胞孵育在96孔板內(nèi)，分別孵育12、24、36、48、72 h，加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)并離心，吸棄培養(yǎng)液后，加入150 μL二甲基亞砜，搖床震蕩10 min，于490 nm讀取吸光度(A)值。

1.9 ELISA檢測取小兒血清或1.7項中的細胞培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒說明書操作方法包被、加樣、加酶標抗體(細胞因子IL-2、IL-22、IFN-γ和TNF-β)及底物顯色液、于450 nm處讀取A值。

1.10 熒光素酶報告試驗使用PBS清洗分離后的人T淋巴細胞(來自前文1.5項中步驟)，棄清洗液。向96孔板中加入20 μL的PLB(passive lysis buffer)溶液，于室溫輕緩搖晃15 min，轉(zhuǎn)移至檢測試管中，使用熒光發(fā)光儀(Promega GLOMAX)對樣品進行檢測[3]。

1.11 Q-PCR檢測細胞因子mRNA表達按照實驗要求，于不同組(轉(zhuǎn)染miR-181a或正常)的人T淋巴細胞中加入Trizol(Invitrogen)溶液進行吹打，按照試劑盒的說明依序加入氯仿、乙醇、異丙醇等試劑，最終加入DEPC水對DNA進行溶解。按照q-PCR試劑盒的操作步驟，檢測細胞因子IL-2、IL-22、IFN-γ、TNF-β的mRNA表達，各引物序列見表1。

表1 IL-2、IL-22、IFN-γ、TNF-β的引物序列

Tab.1 The primers of IL-2, IL-22, IFN-γ and TNF-β

基因引物序列IL-2Forward: 5'-TACAAGAACCCGAAACTGACTCG-3'Reverse: 5'-ACATGAAGGTAGTCTCACTGCC-3'IL-22Forward: 5'-GCTTGACAAGTCCAACTTCCA-3'Reverse: 5'-GCTCACTCATACTGACTCCGT-3'IFN-γForward: 5'-TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA-3'Reverse: 5'-TCGCTTCCCTGTTTTAGCTGC-3'TNF-βForward: 5'-ATGACACCACCTGAACGTCTC-3'Reverse: 5'-CTCTCCAGAGCAGTGAGTTCT-3'

1.12 免疫印跡使用RIPA細胞裂解液對人T淋巴細胞(來自前文1.5項中步驟)提取蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗(1∶2 000)、二抗(1∶8 000)、顯影等步驟檢測P-AKT和P-MEK蛋白的磷酸化水平。

1.13 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0軟件包進行分析。計量資料予以方差分析，計數(shù)資料予以卡方檢驗，等級資料予以秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患兒臨床療效及不良反應(yīng)的比較觀察組治療14 d總有效率(95%)顯著高于對照組(77.5%)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組之間不良反應(yīng)無明顯差異(P>0.05，表2)。

2.2 兩組患兒癥狀消失時間的比較與對照組相比，治療后觀察組咳嗽持續(xù)時間、肺部啰音消失時間、退熱時間和胸部X線陰影消失時間均明顯縮短(P<0.05，表3)。

2.3 兩組患兒治療前后T細胞亞群的比較與治療前相比，兩組患兒在治療后的CD3+、CD4+、CD8+亞群及CD4+/CD8+比例均顯著上升(P<0.05)；與對照組治療后相比，觀察組治療后CD3+、CD4+、CD8+亞群及CD4+/CD8+比例均顯著上升(P<0.05，表4)。

表2 兩組患兒臨床療效及不良反應(yīng)的比較

Tab.2 Comparison of clinical curative effects and adverse reactions between the two groups [n(%)]

組別n治愈顯效有效無效有效率不良反應(yīng)對照組40 10(25.0) 12(30.0) 9(22.5) 9(22.5)31(77.5) 1(2.5)觀察組40 12(30.0) 16(40.0) 10(25.0) 2(5.0)38(95.0)*# 3(7.5)

與對照組相比，*P=0.023(χ2=5.165)；與對照組相比，#P=0.008(Mann Whitney U=9.65)。

表3 兩組患兒癥狀消失時間的比較

組別n咳嗽持續(xù)時間肺部啰音消失時間退熱時間胸部X線陰影吸收時間對照組408.5±1.26.5±0.77.5±0.89.5±1.6觀察組405.6±0.8*4.2±0.8*5.2±0.9*6.2±1.4*t12.723.4212.089.82P<0.001<0.001<0.001<0.001

與對照組相比，*P<0.05。

表4 兩組患兒治療前后T細胞亞群的比較

Tab.4 Comparison of T lymphocyte subsets before and after treatment between the two groups

組別nCD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+對照組治療前4062.8±7.535.8±5.130.6±3.81.20±0.31對照組治療后4065.3±8.240.6±5.334.5±4.11.35±0.28F11.24615.72512.14512.27P0.013<0.0010.0040.05觀察組治療前4063.1±7.936.2±4.831.4±4.11.22±0.34觀察組治療后4069.1±7.8*43.2±6.1*34.4±4.6*1.62±0.41*F22.27033.2857.56344.663P<0.001<0.0010.007<0.001

與對照組治療后相比，*P<0.05。

2.4 兩組患兒治療前后血清炎性因子水平的比較與治療前相比，兩組患兒在治療后IL-2、IL-22、IFN-γ及TNF-β水平均顯著上升(P<0.05)；與對照組治療后相比，觀察組治療后IL-2、IL-22、IFN-γ及TNF-β水平均顯著上升(P<0.05，表5)。

2.5 兩組患兒治療前后淋巴細胞內(nèi)miR-181a水平的比較對照組治療后miR-181a水平(12.2±4.5)低于治療前(15.2±3.6)(P<0.05)；觀察組治療后的miR-181a水平(9.3±5.3)顯著低于治療前(15.3±3.8)(P<0.05)。與對照組治療后相比，觀察組治療后淋巴細胞內(nèi)miR-181a的表達降低更加明顯(P<0.05)。

2.6 miR-181a對人T淋巴細胞增殖及分泌細胞因子功能的影響MTT結(jié)果(圖1)顯示，患兒人正常淋巴細胞轉(zhuǎn)染miR-181a組細胞增殖明顯低于正常組；轉(zhuǎn)染組細胞上清中細胞因子IL-2、IL-22、IFN-γ及TNF-β也顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.7 miR-181a在淋巴細胞中的作用靶點通過在線數(shù)據(jù)庫查找，發(fā)現(xiàn)miR-181a 3′UTR可以與KRAS、NRAS及MAPK1相結(jié)合，通過熒光素酶報告試驗發(fā)現(xiàn)，miR-181a轉(zhuǎn)染組的KRAS、NRAS及MAPK1表達降低；Western blot結(jié)果顯示，下游P-AKT和P-MEK也明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

表5 兩組患兒治療前后血清炎性因子水平的比較

組別nIL-2(μg/L)IL-22(pg/mL)INF-γ(ng/mL)TNF-β(ng/mL)對照組治療前404.6±1.320.2±9.410.6±4.722.7±10.5對照組治療后5.5±0.926.4±11.214.6±2.633.0±9.7F21.62723.25816.35854.523P<0.001<0.001<0.001<0.001觀察組治療前404.9±1.520.6±10.510.8±3.223.6±11.7觀察組治療后6.7±0.8*38.9±10.3*16.8±3.0*44.4±9.0*F35.25644.36829.35258.632P<0.001<0.001<0.001<0.001

與對照組治療后相比，*P<0.05。

圖1 miR-181a在體外對淋巴細胞增殖及分泌細胞因子功能的影響

Fig.1 The effect of miR-181a on lymphocyte proliferation and secretion of cytokinesinvitro

與對照組(Normal)相比，*P<0.05。

圖2 miR-181a在淋巴細胞中的作用靶標

Fig.2 The target of miR-181a in lymphocytes

2.8 miR-181a在體內(nèi)外對細胞因子mRNA水平的影響q-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-181a可以明顯降低IL-2、IL-22、IFN-γ和TNF-β的mRNA表達，差異具有統(tǒng)計學意義；體外ELISA實驗結(jié)果顯示，小兒MP血清中細胞因子IL-2、IL-22、IFN-γ和TNF-β也出現(xiàn)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

2.9 小兒MP的miR-181a表達與血清中細胞因子的相關(guān)性分析Person檢驗發(fā)現(xiàn)，在小兒MP中，淋巴細胞miR-181a的表達水平與血清中IL-2、IL-22、IFN-γ和TNF-β的水平明顯負相關(guān)，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4)。

圖3 miR-181a在體外對細胞因子表達水平的影響

Fig.3 The effect of miR-181a on cytokines levelinvitro

與對照組(Normal)相比，*P<0.05。

圖4 小兒支原體肺炎中miR-181a與血清中細胞因子的相關(guān)性Fig.4 Correlation between miR-181a level and serum cytokines level in children with Mycoplasma pneumonia

3 討 論

MP是小兒臨床常見疾病，由肺炎支原體引起的間質(zhì)性支氣管炎、急性細支氣管炎等。MP的發(fā)病機制目前尚未完全明確，有研究者認為機體免疫功能紊亂在MP發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液聯(lián)合阿奇霉素相對單獨使用阿奇霉素不僅具有更高的治療有效率，還明顯縮短患兒的臨床癥狀持續(xù)時間，此外，還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組可以增高CD3+、CD4+、CD8+亞群及CD4+/CD8+比例，提示參附注射液可能通過增強機體免疫功能而提高阿奇霉素治療MP的療效。

IL-2和IL-22是T細胞亞群活化的重要效應(yīng)分子，在調(diào)控固有免疫反應(yīng)、防御和損傷修復方面具有重要作用[6]。IFN-γ和TNF-β廣泛參與炎癥反應(yīng)、免疫系統(tǒng)的發(fā)育和調(diào)節(jié)，能夠調(diào)控機體免疫細胞介導抗炎機制，增強對病原微生物的抵抗作用[6]。本實驗檢測血清中細胞因子IL-2、IL-22、IFN-γ及TNF-β的水平，發(fā)現(xiàn)參附注射液可提高患兒血清中細胞因子水平，增強機體免疫系統(tǒng)以抵抗MP。

眾多研究表明，miR-181a在腫瘤、炎癥及自體免疫性疾病中都發(fā)揮了重要作用[7-8]。小鼠體內(nèi)過表達miRNA-181a能夠促進B淋巴細胞分化，同時使循環(huán)T淋巴細胞減少[9]。本研究聯(lián)合組比單用阿奇霉素組患兒血清miR-181a含量降低，體外MTT實驗發(fā)現(xiàn)升高miR-181a可以抑制人淋巴細胞增殖，提示miR-181a在機體抵抗MP過程中發(fā)揮著一定的作用。有研究報道，miR-181a可以靶向“炎癥小體”，可作為炎癥反應(yīng)的“效應(yīng)器”抑制炎癥反應(yīng)[10]。本研究還發(fā)現(xiàn)，升高miR-181a的表達可以抑制淋巴細胞分泌細胞因子IL-2、IL-22、IFN-γ和TNF-β。據(jù)此推測，參附注射液通過降低小兒淋巴細胞中miR-181a的表達水平，繼而促進細胞因子IL-2、IL-22、IFN-γ及TNF-β的分泌，從而調(diào)控機體免疫系統(tǒng)以抗MP。

本研究使用在線數(shù)據(jù)庫(TargetScan和miRWalk)發(fā)現(xiàn)miR-181a可以靶向KRAS、NRAS和MAPK1基因[11]。進一步進行熒光素酶報告實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-181a可以降低KRAS、NRAS和MPAK1的mRNA表達。我們針對KRAS、NRAS和MPAK1基因下游，檢測發(fā)現(xiàn)AKT和MEK的磷酸化水平明顯下降，提示miR-181a通過降低KRAS、NRAS和MPAK1的mRNA表達，從而抑制AKT和MEK的磷酸化，抑制AKT和MAPK通路，抑制淋巴細胞的增殖及功能。

本研究進一步驗證了miR-181a可以降低IL-2、IL-22、IFN-γ及TNF-β的mRNA表達，表明miR-181a可以抑制淋巴細胞分泌細胞因子。為了探究miR-181a是否在體內(nèi)同樣發(fā)揮著相似功能，我們在80例患兒血清中檢測發(fā)現(xiàn)IL-2、IL-22、IFN-γ及TNF-β的含量與淋巴細胞中miR-181a的表達水平呈負相關(guān)，表明miR-181a在體內(nèi)依然可以影響淋巴細胞分泌細胞因子的能力，抑制機體抗MP的免疫應(yīng)答。

綜上所述，在阿奇霉素治療基礎(chǔ)上聯(lián)合參附注射液治療小兒MP可獲得滿意療效，該方案可以有效緩解患兒臨床癥狀，促進患兒免疫功能恢復，其機制可能通過降低淋巴細胞中miR-181a水平，升高AKT和MEK的磷酸化水平，并促進淋巴細胞增值及分泌相關(guān)細胞因子而實現(xiàn)。