三個綿羊品種LHX3基因多態(tài)性與生長性狀的關聯分析

王燕新 廖圓圓 阿依木古麗 齊驁穹 李海健 徐紅偉 楊具田蔡勇

（1. 西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030；2. 西北民族大學實驗教學部，蘭州 730030）

動物的生長發(fā)育是由許多信號傳導途徑上的調控因子協同來執(zhí)行的，體內幾乎所有的激素都直接或間接地參與機體生長的調節(jié)［1-2］。對于生物的整個生長和分化過程起到重要調節(jié)作用的是同源盒基因在動物組織中表達出來的一種轉錄調節(jié)因子［3-5］。LIM同源盒3基因（LIM homeobox gene 3，LHX3）是位于腦垂體上游重要的調節(jié)因子之一［6］，其蛋白產物是垂體發(fā)育和運動神經元特化所需要的神經內分泌轉錄因子［7-10］。LHX3因其自身的結構特點使其既可以進行自調節(jié)又可以激活垂體激素基因，包括生長激素（Growth hormone，GH）、催乳素（Prolactin，PRL）、促黃體生成素（Luteini-zing hormone，LH）、促卵泡生成激素（Follicle-stimulating hormone，FSH）和促甲狀腺素（Thyrotropin，thyroid stimulating hormone，TSH）等［11］，而這些激素大多與動物的生長繁殖有一定的聯系［6］。由于LHX3及其產物在垂體的早期發(fā)育及垂體激素分泌中發(fā)揮著關鍵的作用，如對POUIF1、PRL和GH的調控［12］，故該基因在綿羊的生長發(fā)育方面具有重要的遺傳效應。插入/缺失是研究動植物基因組DNA進化和育種、種質保護、選擇利用的最簡單快速的分子標記之一，它不僅擴增產物帶型簡單清晰，穩(wěn)定性和產物分離效果均明顯優(yōu)于SSR標記［13］；還較SNP標記檢測簡單便捷，對儀器設備和技術要求較低，在電泳技術平臺上即可進行［14］。因此，動植物中插入/缺失的開發(fā)、鑒定和功能分析越來越受到研究者的關注［15］。本實驗以灘羊（Tan sheep，TS）、小尾寒羊（Small-tailed Han sheep，STHS）、蘭州大尾羊（Lanzhou Fat-tailed sheep，LFTS）為研究對象，以LHX3作為研究影響綿羊生長發(fā)育的候選基因，尋找與綿羊生長發(fā)育相關的分子標記，為綿羊的分子選育和種質資源的有效利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物為1 269只綿羊（1-1.5歲，公母隨機），生長發(fā)育正常、健康無病且同一品種綿羊的飼養(yǎng)管理條件相同。其中灘羊（TS，n=1 018，寧夏鹽池縣鑫海食品有限公司）、小尾寒羊（STHS，n=131，甘肅永靖縣瑞霖科技養(yǎng)殖有限公司）、蘭州大尾羊（LFTS，n=120，甘肅永靖縣瑞霖科技養(yǎng)殖有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 數據收集 先將綿羊耳緣被毛刮干凈，用75%酒精擦拭消毒之后用耳鉗采集黃豆粒大小耳組織，放入1.5 mL離心管并加1 mL 75%乙醇，固定后帶回實驗室于-80℃冰箱低溫保存。所有綿羊的數據測量均由同一人采樣同一標準測量，包括體長（Body length，BL）、體重（Body weight，BW）、體高（Body hight，BH）、 胸 深（Chest depth，ChD）、 胸寬（Chest width，ChW）、胸圍（Chest cicumference，ChC）、管圍（Cannon circumference，CaC）和十字部高（Hip width，HW）。后期根據數據統(tǒng)計分析，進行不同綿羊品種LHX3基因多態(tài)性與生長性狀之間的關聯分析。

1.2.2 基因組DNA的提取及檢測 采用苯酚-氯仿抽提法［16］從耳緣組織中提取總基因DNA，并用核酸測定儀測定基因組DNA的濃度和OD值。當OD值260/280在1.8-2.0之間時，則DNA質量較優(yōu)，符合試驗要求。

1.2.3 引物設計 按照GenBank 數據庫中已經公布的綿羊LHX3基因的mRNA序列（GenBank：NC_019460.2），參照Zhao等［6］設計的特異性引物用于擴增不同品種綿羊的LHX3基因。引物序列為（F：5'-CTCTGAACTGCCAGGACCCA-3'；R：5'-ACTCCA-CGATGCAGCCAAGA-3'），由上海生物工程科技有限公司合成。

1.2.4 PCR反應體系和擴增條件 PCR 擴增體系為50 μL：基因組 DNA 模板 3.0 μL，上游引物LHX3-F 1.5μL，下游引物LHX3-R 1.5 μL，2×Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。

為了確定引物的最佳退火溫度（Tm），先利用梯度PCR進行篩選，隨后在最佳Tm值下進行PCR擴增。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，61.4℃退火 30 s，72℃延伸30 s，共 30個循環(huán)；72℃ 延伸5 min，4℃保存。采用1.5%瓊脂糖凝膠對其擴增產物進行檢測，并將 PCR產物送上海生物工程科技有限公司進行序列測定。

1.2.5 數據統(tǒng)計分析方法 將測序結果與綿羊LHX3基因序列（GenBank：NC_019460.2）做比對，利用網站www.Msrcall.com計算和分析哈德-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）、有效等位基因數（Ne）、雜合度（He）、純合度（Ho）、多態(tài)性信息（PIC）、基因型頻率和等位基因頻率。利用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計檢驗［17］，并對不同位點基因型的分布進行χ2檢測，當χ2＜χ20.05時，表明該基因位點處在Hardy-Weinberg動態(tài)平衡；當時為Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)［18-19］。利用PIC軟件統(tǒng)計多態(tài)信息含量（PIC），公式如下：

Pi和Pj分別為第i個和第j個等位基因頻率，n為等位基因數。當PIC＞0.5時，該突變位點處在高度多態(tài)；當0.25＜PIC≤0.5時為中度多態(tài)；當PIC≤0.25時為低度多態(tài)。

對于綿羊的8個生長性狀按照LHX3所表現出來的 3 個基因型進行統(tǒng)計分析，利用SPSS19.0軟件的一般線性模型（GLM）分析個體基因型對綿羊生長性狀的影響。Y=u+maker+gender+MG+e，式中u為群體平均值，marker為基因型效應，gender為性別效應，MG為基因型與性別的互作效應，e為隨機殘差。對同一品種的不同基因型進行對比分析，結果用“Mean±SE”表示。

2 結果

2.1 LHX3基因PCR擴增分析

PCR產物經過1.5%瓊脂糖凝膠（120 V，60 min）電泳，結果如圖1所示，LHX3基因 PCR擴增產物的電泳條帶清晰且無雜帶，PCR產物具有3種類型：其中插入型（AA）為280 bp單一條帶，缺失型（BB）為251 bp單一條帶，插入/缺失型（AB）為251 bp和280 bp兩個條帶（圖1）。

圖1 綿羊LHX3基因PCR擴增產物檢測結果

2.2 序列測定與分析

對PCR產物進行測序，測序峰圖如圖2所示，插入/缺失片段為“GCCTGGACTGTGATGGGCACCCT CCGGGGTAG”，所得到的結果與NCBI數據庫中預測的結果相同（NC_019460.2：g.3107494-3107522 del GGCCTGGACTGATGGGCACCCTCCGGG）。

測序結果（圖2）顯示，基因型為插入/插入型（AA）的擴增片段長度為280 bp，缺失/缺失型（BB）為251 bp，經序列比對發(fā)現，其核苷酸序列與GenBank綿羊LHX3基因序列的同源度為96%以上，所擴增產物為綿羊LHX3基因片段。

2.3 LHX3基因多態(tài)性位點分析

對3個品種綿羊中的基因型頻率和基因頻率進行了統(tǒng)計分析，結果如表1所示，這3個品種綿羊的He和Ho非常接近，Ne接近于2。對于目前的基因位點來說，LTFS和STHS處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05），而TS處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P＞0.05），3個綿羊品種的PIC都呈現為中等程度的多態(tài)性（0.25＜PIC≤0.5）。由表2可以看出綿羊不同品種間基因型多態(tài)性分布的卡方獨立性檢驗中，LFTS、STHS、TS兩兩之間的基因型頻率與等位基因頻率均具有差異（P＜0.01）。

表1 LHX3基因多態(tài)位點分析

表2 不同品種間LHX3多態(tài)性基因型分布的卡方獨立性檢驗

2.4 LHX3基因型與生長性狀關聯分析

本實驗著重于考慮基因型效應對于表型值的影響程度。采用 SPSS19.0 軟件和Grandpad Prism分析不同基因型間生長性狀差異的顯著性（表3）。

表3 LHX3基因不同基因型與生長性狀之間的關聯分析

2.4.1LHX3基因型與蘭州大尾羊生長性狀關聯分析 由圖3可以看出，在LFTS中，BB基因型個體各生長性狀均高于AA基因型和AB基因型個體，其次，LFTS的BB基因型的BL、BH這2個生長性狀指標明顯高于AA基因型和AB基因型（P＜0.01），而在ChD、CaC這2個生長性狀指標則表現為BB基因型明顯高于AB基因型（P＜0.01）。

圖3 LHX3基因不同基因型與LFTS生長性狀之間的關聯分析

圖4 LHX3基因不同基因型與STHS生長性狀之間的關聯分析

2.4.2LHX3基因型與小尾寒羊生長性狀關聯分析由圖4可以看出，在STHS這一群體中，BB基因型各生長性狀大多高于AA基因型和AB基因型，且在ChD、CaC這兩個生長性狀中BB基因型顯著高于AB基因型（P＜0.01）。STHS的BB基因型的 ChC、ChD極顯著高于AA基因型（P＜0.01）。

2.4.3LHX3基因與灘羊生長性狀關聯分析 由圖5可以看出，TS的生長性狀指標中BB基因型在BL、ChD上顯著高于AB基因型（P＜0.01），BB基因型ChD、CaC這2個生長性狀明顯高于AA基因型（P＜0.05）。在BL這個生長性狀中，AA基因型和BB基因型都表現出較高優(yōu)勢，且BB基因型優(yōu)于AA基因型。通過以上分析可以看出該29 bp插入/缺失位點與綿羊的生長性狀指標明顯相關。

圖5 LHX3基因不同基因型與TS生長形狀之間的關聯分析

3 討論

3.1 LHX3基因群體遺傳特征分析

Ne、He、PIC、Ho等指標從不同角度反映了群體的遺傳變異程度。一般認為群體的He與遺傳多樣性密切相關，群體He越高，群體的遺傳變異越大，遺傳多樣性就越豐富，選擇的潛力就越大［20］。本實驗中，3個不同綿羊品種LHX3基因的Ho均在0.5左右，He均在0.49左右，Ne均在1.9左右，PIC均在0.37左右，為中度多態(tài)位點，表明在該位點的遺傳變異相對較高。

根據表1中HWE和PIC的分類，可以看出29個bp插入/缺失位點在3個不同綿羊品種中均處于中等程度多態(tài)。也就是說，29 bp的插入/缺失位點具有豐富的遺傳多樣性，這個位點可以用來評估綿羊遺傳資源的豐富程度。LFTS和STHS品種中HWE的P值均低于0.05，造成這種情況的原因可能是選種和選配不平衡，群體數量較小并受到高度選擇，導致群體偏離了HWE規(guī)律。

3.2 LHX3基因多態(tài)性與生長性狀關聯分析

動物的生長發(fā)育過程是由眾多調控因子綜合作用的結果，因此對一些有著重要功能的基因結構和功能的認識顯得十分重要。LHX3基因不僅對許多器官的發(fā)育和功能有重要的作用，其突變會嚴重影響其靶器官發(fā)育和功能［21］，而且它還是非常重要的垂體轉錄因子，對動物的生長繁殖起重要作用，它既可以進行自調節(jié)又可以激活與動物的生長繁殖有一定的聯系的垂體激素基因［6］，包括GH、PRL、LH、FSH和TSH等［11］。國內外對LHX3基因的研究大多集中在患者內分泌系統(tǒng)、激素缺乏、肺癌相關病理研究以及對神經系統(tǒng)的調控作用上［22-28］，關于LHX3作為改善家畜生長性狀的候選基因的報道逐漸增多，LHX3基因多態(tài)性在山羊和牛上的研究已有報道［11］，發(fā)現LHX3中存在插入/缺失位點，其中一些單核苷酸所呈現出來的多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）位點可以影響山羊和奶牛生長性狀和奶的品質［11，29］。但關于LHX3基因多態(tài)性對綿羊生長性狀的關聯分析的研究并不多見。

遺傳變異主要有兩方面的應用，一是基于功能變異的選擇；二是將該遺傳變異用于遺傳評估的模型中［30］。經過分子生物學的長期發(fā)展，與之而來的是更多深入的研究，利用分子標記技術對家畜進行遺傳多態(tài)性分析得到廣泛運用［31-33］。插入/缺失作為一種新的遺傳標記輔助選擇方法，能夠更加快速有效地探究LHX3基因多態(tài)性是否影響綿羊的生長發(fā)育，有研究報道了關鍵基因插入/缺失與家畜生長性狀相關，如閆海龍等［34］發(fā)現生長激素受體（Growth hormonereceptor，GHR）基因9 bp的插入/缺失能顯著提高陜北白絨山羊的體重和多個生長性狀；鄔明麗等［35］報道黃牛溶酶體轉錄調控因子（Lysosomal trafficking regulator，LYST）基因 22 bp 的插入 /缺失突變能夠顯著影響郟縣紅牛的生長性狀。

本實驗分析了LHX3基因29 bp插入/缺失位點與綿羊生長性狀之間的關系，在TS中BB基因型的個體存在諸多優(yōu)良性狀包括BL、BW、ChD和CaC，并且純合子BB基因型和AA基因型比雜合子AB基因型個體有著更高的先天優(yōu)勢。本實驗結果表明LFTS、STHS和TS中LHX3基因的3個基因型的生長性能都存在顯著性差異，可見綿羊生長性能與這個插入/缺失位點之間存在一定的相關性。通過數據分析發(fā)現BB基因型有利于LFTS、STHS和TS的生長，這是一個潛在的遺傳標記位點，可用于綿羊的遺傳分析和優(yōu)良個體選擇。本實驗所用樣本雖然存在一定的局限性，但結果表明B等位基因是優(yōu)勢基因，純合子的BB基因型個體更具有先天優(yōu)勢，可以在育種工作中選擇。3個綿羊品種均為中度多態(tài)且數值接近，說明這3個綿羊品種中的遺傳變異程度相似，具有相對較高的選擇潛力。

4 結論

LFTS、STHS和TS的LHX3基因中存在一個29 bp的插入/缺失（NC_019460.2：g.3107494-3107522 del GGCCTGGACTGATGGGCACCCTCCGGG）突變，該突變與生長性能相關，可以作為綿羊選育的DNA標記位點。