SNaPshot技術(shù)檢測灘羊雙羔群體中與多胎性狀相關(guān)SNP研究

田得紅 劉思嘉 丁寧 李雪 趙凱

（1. 中國科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810008；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

我國地方綿羊品種與同類羊相比，最典型、最突出的特性是性成熟早、肉質(zhì)嫩美、抗逆性好，而它的短板在于生長速度緩慢、繁殖性能低、轉(zhuǎn)化能力低下等，在傳統(tǒng)畜牧業(yè)向現(xiàn)代畜牧業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的過程中，地方品種綿羊沒有現(xiàn)代化批量產(chǎn)出的優(yōu)勢，而繁殖力是制約其發(fā)展的重要因素。挖掘其影響多胎性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，通過雙羔分子標(biāo)記本品種選育是解決繁殖力低下出現(xiàn)數(shù)量減少的本質(zhì)問題。但大多數(shù)地方品種綿羊?qū)偌竟?jié)性發(fā)情一胎單羔的動(dòng)物，為了經(jīng)濟(jì)利益的最大化，多胎一直是人們追求的目標(biāo)。雙羔初生重較單羔低20%以上，但在正常飼養(yǎng)管理情況下，這種差距越來越小，滿16個(gè)月齡時(shí)平均體重、產(chǎn)毛量差異均不顯著，經(jīng)濟(jì)效益非常明顯［1］。目前，對(duì)小尾寒羊及湖羊的多胎性狀相關(guān)的主效候選基因研究的較多，而對(duì)于低繁殖力的地方綿羊品種的多胎性狀相關(guān)的候選基因系統(tǒng)研究的較少。

BMPRIB基因非同義突變發(fā)生在高度保守的胞內(nèi)激酶信號(hào)域編碼區(qū)746（746A→G）引起氨基酸變 化（249Q → R），Mulsant等［2］、Souza 等［3］研究表明，該突變造成部分受體失活，抑制了BMPRIB基因的功能，影響顆粒細(xì)胞分化，加快卵泡成熟速度，導(dǎo)致突變型母羊排卵數(shù)增加，引起的突變與Booroola 母羊的高產(chǎn)表型完全相關(guān)［2，4］。Booroola表型具有孟德爾分離模式，該突變對(duì)綿羊排卵數(shù)具有加性效應(yīng)，即每增加一個(gè)拷貝將額外多排1.65枚卵，平均產(chǎn)羔數(shù)増加0.90-1.20只［5］，在性成熟母羊中，攜帶FecBB的母羊最一致的特征是卵泡的直徑明顯小于非攜帶母羊，純合非載體型（FecB+/FecB+），排卵率為1-2，排卵卵泡直徑為7 mm，雜合攜帶者（FecBB/FecB+），排卵率為3-4，卵泡大小為4-5 mm直徑［6］。因此 BMPR1B 基因成為目前已知的并應(yīng)用于生產(chǎn)的綿羊高繁殖力標(biāo)記基因之一。除了Booroola Merino 綿羊中FecB已被證實(shí)為影響多胎性狀的主效基因外，印度的Garole綿羊［7］，伊朗的 Kalehkoohi綿羊［8］、中國的小尾寒羊［9］、湖羊［10］、多浪羊［11］、策勒黑羊［12］中存在 FecB 突變，BMPR1B為主效候選基因之一。BMP4在綿羊的卵巢中發(fā)現(xiàn)，BMP4促進(jìn)了原始卵泡的發(fā)育和原始卵泡向初級(jí)卵泡的轉(zhuǎn)變［13］，BMP4對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞分泌黃體酮有較強(qiáng)的抑制作用，降低顆粒細(xì)胞黃體酮分泌［14］，完全阻斷FSH刺激作用，而促進(jìn)雌激素的分泌，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的早熟分化和濾泡的成熟［15］。BMP4在正常卵泡中高表達(dá)，但在閉鎖卵泡中幾乎檢測不到［16］，Sharma等［17］研究發(fā)現(xiàn) BMP4基因被認(rèn)為是山羊繁殖能力的候選基因，在小尾寒羊母羊、湖羊、山羊、陶寒F1、陶寒F2中BMP4基因產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)［18-20］，而BMP4基因?qū)χ袊览颍ㄜ妷ㄐ停└叻敝沉ρ驔]有影響［21］。因此，BMP4可能會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物的生殖功能產(chǎn)生影響。ADAMTS蛋白酶是一種分泌的鋅金屬蛋白酶，ADAMTS蛋白酶參與原膠原蛋白和血管性血友病因子的成熟，以及與形態(tài)發(fā)生、血管生成、排卵、癌癥和關(guān)節(jié)炎相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解［22］。ADAMTS1的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域具有催化活性［23］。研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS1可能是新近發(fā)現(xiàn)的影響排卵數(shù)的基因［24］。Mittaz等［25］研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS1是由導(dǎo)致排卵的激素通路中的孕酮受體調(diào)控的，在敲除 ADAMTS1的雌性小鼠中，雌性生殖器官畸形和繁殖能力下降，ADAMTS1缺失的雌性的生育能力存在于受損的排卵過程中，導(dǎo)致卵子被釋放的數(shù)量減少，ADAMTS1是正常排卵發(fā)生所必需的基因，因此ADAMTS1基因在雌性生育中，在排卵的組織重塑過程中起著重要作用。

SNaPshot技術(shù)也稱微測序技術(shù)，是由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems，ABI）開發(fā)的一種SNPs多重分析技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)中通量的SNPs分型［26］，它具有檢測速度快，準(zhǔn)確性高，成本相對(duì)低廉等特點(diǎn)。目前，已經(jīng)廣泛地用于人類遺傳疾病相關(guān)性分析［27-30］和法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的SNPs鑒定［31-32］。

本研究利用SNaPshot分型方法來檢測地方品種灘羊與多胎性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)檢測的灘羊候選基因突變頻率，分析中國地方品種灘羊突變頻率分布情況。旨在為畜牧工作者利用分子標(biāo)記改良繁殖性狀、培育多羔家系提供科學(xué)資料和參考依據(jù)，為多胎性狀相關(guān)分子標(biāo)記的篩選構(gòu)建一種快速準(zhǔn)確、機(jī)動(dòng)靈活、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的檢測方法，促進(jìn)SNP技術(shù)在分子育種中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試羊群和樣品采集 具有產(chǎn)羔記錄的2-5月齡的灘羊雙羔實(shí)驗(yàn)組384只，灘羊單羔對(duì)照組144只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來自遺傳系譜清晰，具有產(chǎn)雙羔、單羔記錄的羔羊，用耳號(hào)鉗取耳組織5 g，放入裝1 mL 70%乙醇的取樣管中，帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 選取BMPR1B、BMP4、ADAMTS1等3個(gè)基因所有外顯子設(shè)計(jì)引物，最終篩選出13個(gè)位點(diǎn)，采用 AssayDesigner3.1 軟件對(duì)3個(gè)基因的13個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)展引物，并交由四川栢暉生物公司合成表1。

1.2.2 Massarray SNP分型 取1.5 mL EP管中配置PCR master mix，并振蕩低速離心。在384加樣孔中加入4 μL PCR master mix，最后加入1 μL模板DNA（20 ng/μL）混勻，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，擴(kuò)增程序 ：94℃ 5 min ；94℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)；72℃ 3 min。產(chǎn)物堿性磷酸酶處理：反應(yīng)總體積為7 μL，其中PCR產(chǎn)物5 μL，SAP mix 2 μL。SAP Mix體系為 2 μL：Water（HPLC grade）1.53 μL，10×SAP Buffer 0.17 μL，1 U/μL SAP Enzyme 0.30 μL。單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積9 μL：EXTEND Mix 2 μL，SAP+PCR reaction 7 μL。將點(diǎn)樣后的Spectro CHIP芯片使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析，檢測結(jié)果使用TYPER4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖，檢查數(shù)據(jù)文件的完整性和正確性，將結(jié)果保存入相應(yīng)存儲(chǔ)媒介并進(jìn)行分析。

表1 引物序列信息

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 用Plink軟件分析最小等位基因、哈溫平衡、卡方分析、邏輯模型等，通過Pearson卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在每個(gè)位點(diǎn)上基因型和等位基因的差異，從而分析與多胎基因的相關(guān)性。用卡方適合性檢驗(yàn)法分析Hardy-Weinberg平衡定律，P＞0.001表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，符合Hardy-Weinberg平衡定律。Hapview軟件分析連鎖不平衡及單體型。

2 結(jié)果

2.1 SNaPshot 檢驗(yàn)的前期工作及HWP檢驗(yàn)

前期選擇7個(gè)經(jīng)典基因（BMPR1B、BMP4、ADAMTS1、BMP15、GDF9、INHA、MTNR1A7），利用混池?cái)U(kuò)增測序進(jìn)行SNP位點(diǎn)初步篩選的基礎(chǔ)上，通過軟件比對(duì)及人工對(duì)峰圖的判斷，選取雜合峰圖的位點(diǎn)作為候選SNP位點(diǎn)，共得到33個(gè)位點(diǎn)和8 個(gè) 文 獻(xiàn) 位點(diǎn)［33］（FecB、FecXG、FecXH、FecXI、FecXB、FexXO、FecXGR、FecXL）點(diǎn)作為候選點(diǎn)，共計(jì)41個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行SNP時(shí)間飛行質(zhì)譜檢測（單次檢測最多30個(gè)位點(diǎn)），進(jìn)行了兩次檢測，通過分型，最終確定了3個(gè)基因13個(gè)位點(diǎn)存在雜合情況，然后進(jìn)行后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析。

Hardy-Weinberg平衡是指群體內(nèi)一個(gè)位點(diǎn)上的基因型頻率和基因頻率世代保持不變，沒有偏離遺傳平衡狀態(tài)。進(jìn)行HWE檢驗(yàn)的主要目的就是為了檢驗(yàn)我們研究的群體是否來源于獨(dú)立樣本和處在一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)，是否存在顯著遺傳漂變。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)13個(gè)位點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，未偏離哈迪-溫伯格平衡（P＞0.001），樣本來源于孟德爾遺傳規(guī)律散發(fā)獨(dú)立樣本，該基因是群體中穩(wěn)定存在的基因，13個(gè)SNPs在后續(xù)的檢驗(yàn)中是有意義的，可進(jìn)行下一步關(guān)聯(lián)分析。13個(gè)SNPs位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中純合度較高，雜合度則相對(duì)較低，表明這13個(gè)SNPs位點(diǎn)在群體中的變異較小。

2.2 我國地方品種灘羊SNP多態(tài)性與多胎性狀相關(guān)性分析

通過測序序列比對(duì)結(jié)果，在3個(gè)基因中共發(fā)現(xiàn)13個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，這些位點(diǎn)中不存在插入和缺失位點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)有9個(gè)，包括3個(gè)A/G轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和6個(gè)T/C轉(zhuǎn)換位點(diǎn)；顛換位點(diǎn)有4個(gè)，包括A/C顛換位點(diǎn)3個(gè)，G/T顛換位點(diǎn)1個(gè)。最小等位基因率MAF＞0.05，說明選取實(shí)驗(yàn)群體數(shù)據(jù)與真實(shí)的大范圍群體相比沒有出現(xiàn)偏移，突變頻率較低的位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組-對(duì)照組間差異較大，可以得出有效結(jié)論。每個(gè)SNP的等位基因頻率在單羔和雙羔組中的分布差異見表3，經(jīng)過檢驗(yàn)后，其中SNP5-C/T位 點(diǎn)、FecB-A/G位 點(diǎn)、rs21-A/C位 點(diǎn)、rs22-A/C位點(diǎn)的等位基因在雙羔組和單羔組中的分布存在極顯著差異（P＜0.01），SNP15-C/T分布差異顯著（P＜0.05），初步分析認(rèn)為SNP5-C/T位點(diǎn)、FecB-A/G位點(diǎn)、SNP15-C/T位點(diǎn)、rs21-A/C位點(diǎn)、rs22-A/C位點(diǎn)與多胎性狀相關(guān)，除了FecB位點(diǎn)是已報(bào)道的影響多胎的主效基因外［3-4］，其余4個(gè)位點(diǎn)相關(guān)的研究內(nèi)容目前尚未見報(bào)道，SNP5-T、SNP15-T、FecB-G、rs21-C、rs22-C為優(yōu)勢等位基因，5個(gè)位點(diǎn)測序結(jié)果與參考序列進(jìn)行比對(duì)，做出基因堿基突變位點(diǎn)測序峰圖與MassArray 分型的散點(diǎn)圖進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果一致，說明結(jié)果的可靠性（圖1-2）。

表2 灘羊群體哈溫平衡檢驗(yàn)

針對(duì)該基因每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)SNP5-CC/TC/TT、rs21-AA/CA/CC、rs22-CC/AC/AA、FecB-AA/GA/GG基因型在雙羔組和單羔組間的分布極顯著差異（P＜0.01），SNP15-CC/TC/TT基因型在單羔組和雙羔組間的分布顯著差異（P＜0.05），野生型和突變型對(duì)雙羔性狀影響存在極顯著性差異（P＜0.01）。

表3 BMPR1B、BMP4、ADAMTS1基因外顯子SNP基因頻率分布及單位點(diǎn)分析

圖1 5個(gè)SNPs測序圖

2.3 SNP位點(diǎn)遺傳模型構(gòu)建及相關(guān)性

對(duì)13個(gè)位點(diǎn)分別行3種不同的遺傳模型分析，結(jié)果顯示，SNP15、SNP5、FecB、rs21、rs22位點(diǎn)建立的3種模型均為有意義的模型，SNP15與多胎性狀的發(fā)生有顯著相關(guān)性（P＜0.05），SNP5、rs21、rs22、FecB發(fā)生為極顯著相關(guān)性（P＜0.01），模型預(yù)測SNP15、SNP5、rs21、rs22、FecB為與雙羔性狀相關(guān)的位點(diǎn)。

2.4 雙羔組和單羔組SNP的連鎖不平衡分析及單倍型的構(gòu)建

對(duì)符合Hardy-Weinberg平衡定律的SNPs位點(diǎn)，利用SHSsis 在線軟件［34］計(jì)算連鎖不平衡系數(shù)進(jìn)行連鎖不平衡分析，通過D'值，觀察各位點(diǎn)之間的連鎖不平衡程度，判斷是否存在連鎖不平衡。在ADAMTS1的6個(gè)位點(diǎn)中，存在1個(gè)block構(gòu)建3種單倍型，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)3種單倍型都與多胎無關(guān)（P＞0.05），表6。在BMPR1B基因中關(guān)聯(lián)兩個(gè)SNPs間的連鎖不平衡很弱或的不存在連鎖不平衡，無法構(gòu)建單倍型。

圖2 Sequenom MassArray分型的散點(diǎn)圖

表4 BMPR1B、BMP4、ADAMTS1基因外顯子SNP基因型頻率分布

表5 SNPs各位點(diǎn)的遺傳模型與多胎性狀相關(guān)性

圖3 ADAMTS1 6個(gè)位點(diǎn)連鎖不平衡圖譜

圖4 BMPR1B 4個(gè)位點(diǎn)連鎖不平衡圖譜

表6 單倍型頻率

3 討論

本研究在前期初步篩選的基礎(chǔ)上，確定3個(gè)基因13個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，最終發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因的13個(gè)位點(diǎn)均未偏離哈溫平衡，5個(gè)位點(diǎn)（SNP15、SNP5、FecB、rs21、rs22）在雙羔組和單羔組間差異顯著，表明這5個(gè)位點(diǎn)與雙羔性能有關(guān)聯(lián)。本研究最終篩選的3個(gè)BMPR1B、BMP4、ADAMTS1基因都是生殖軸上己知被前人研究者證明與羊的繁殖性狀相關(guān)［3，35-36］。其中 FecB 位點(diǎn)在 Booroola羊中亦證實(shí)為影響多胎的主效基因，F(xiàn)ecB位點(diǎn)也是影響我國的小尾寒羊多胎性能的主效候選基因［37］，F(xiàn)ecB基因在小尾寒羊和湖羊的外顯子8存在FecB突變［38］，F(xiàn)ecBB突變在灘羊中出現(xiàn)基因分型，發(fā)現(xiàn)FecBB等位基因?qū)┭虍a(chǎn)仔數(shù)有非常顯著的影響［39］，BMPR-1B基因外顯子9的雜合度可使所有母羊產(chǎn)仔數(shù)增加［40］，周世偉等［41］對(duì)FecB基因編輯后，初生的羔羊單核苷酸交換的觀察效率高達(dá)23.8%。由于收集產(chǎn)仔數(shù)數(shù)據(jù)需要很長時(shí)間，目前還無法收集編輯后的動(dòng)物的表型數(shù)據(jù)，但認(rèn)為此項(xiàng)發(fā)現(xiàn)將有助于提高動(dòng)物的繁殖性狀。以上研究證實(shí)FecB突變與產(chǎn)仔數(shù)增加有關(guān)與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，主要原因沉默BMPR1B可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)BMPR1B可抑制綿羊顆粒細(xì)胞細(xì)胞凋亡［42］，F(xiàn)ecB基因突變可能改變了卵母細(xì)胞發(fā)育和卵丘顆粒細(xì)胞的增殖水平，從而提高排卵率［43］。但FecB突變在 Barki和Rahmani地方綿羊品種中未檢測到［44］，推測可能是基因結(jié)構(gòu)和品種的不同對(duì)小鼠卵巢的研究證明ADAMTS1在體內(nèi)排卵和受精過程中都起著至關(guān)重要的作用，通過對(duì)貴州半細(xì)羊毛綿羊ADAMTS1基因的混池測序發(fā)現(xiàn)該基因可能影響繁殖性能［45］，但也有研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS1基因不能作為高產(chǎn)湖羊的候選基因［46］。本研究認(rèn)為ADAMTS1基因可能是影響灘羊繁殖性狀的一個(gè)候選基因，但可否作為綿羊繁殖性狀的候選基因可能存在品種間的差異，還有待進(jìn)一步研究。我們通過3種遺傳模型分析也發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNPs與雙羔性能的相關(guān)性。但這5個(gè)SNP 位點(diǎn)能否作為雙羔性狀的遺傳標(biāo)記，還需要對(duì)這些地方品種灘羊個(gè)體進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證以及如何參與綿羊雙羔生產(chǎn)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。

本研究關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)與雙羔性狀相關(guān)5個(gè)SNPs位 點(diǎn)， 即 SNP5、SNP15、rs21、rs22、FecB位點(diǎn)，5個(gè)位點(diǎn)的突變可能利于生產(chǎn)雙羔。這5個(gè)SNPs位點(diǎn)在群體中的變異較小，這可能與地方品種綿羊的遺傳背景和本品種選育程度有關(guān)［47］；13個(gè)位點(diǎn)均處于哈迪-溫伯格平衡，說明試驗(yàn)群體在選擇中不易受外界干擾，這些位點(diǎn)的基因序列保守性較強(qiáng)，在品種的選育、遷徙和遺傳漂變因素作用下而處于動(dòng)態(tài)平衡，他們的遺傳是隨機(jī)的［48］，而使這5個(gè)SNPs位點(diǎn)能夠提供較為合理的遺傳信息，這可能是由于該群體在適應(yīng)性方面具有遺傳優(yōu)勢，并經(jīng)過長期進(jìn)化和選擇達(dá)到了平衡狀態(tài)，基因型頻率的平衡對(duì)于群體穩(wěn)定性有著直接的保證作用的。哈溫平衡不但受遺傳學(xué)規(guī)律的控制，而且還受外界環(huán)境的影響［49］，遺傳學(xué)影響表現(xiàn)在基因頻率自然選擇作用發(fā)生了變化、基因漂變，以及鄰種群的基因由于雜交而正在加入到所研究的區(qū)域或是其基因成分發(fā)生了變化［48］。HWE檢驗(yàn)是有必要的，只有哈溫平衡才能驗(yàn)證所獲得的樣本是否有代表性，只有滿足HWE，才能進(jìn)一步推斷基因與雙羔的關(guān)聯(lián)性。CoxDG等［50］認(rèn)為不符合 HWE可能是基因分型錯(cuò)誤所致，那么在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行基因與性狀的關(guān)聯(lián)推斷顯然是沒有意義的。

單倍型可提供比單個(gè)SNPs 更為豐富的信息量，有助于低頻率變異信息的利用，被稱為人類進(jìn)化歷史的“分子化石”［51］。在復(fù)雜性狀的關(guān)聯(lián)研究中，單倍型比單個(gè)SNPs具有更好的統(tǒng)計(jì)分析效果，不同SNP位點(diǎn)優(yōu)勢等位基因型與優(yōu)勢等位基因種類和頻率大小，單倍型均有不同程度的差別。但由于樣本數(shù)量有限會(huì)導(dǎo)致單倍型被漏檢，樣本選擇不全面，并且研究不夠深入［52］。本研究對(duì)符合要求的SNPs位點(diǎn)構(gòu)建了單倍型，得到了3種與雙羔性能相關(guān)的單倍型，但在雙羔組和單羔組間都未達(dá)到差異水平，所以我們繼續(xù)以ADAMTS1和BMPR1B基因?yàn)橹行模瑧?yīng)該進(jìn)一步擴(kuò)大樣本容量，確定我國地方綿羊品種群LDblock的精確結(jié)構(gòu)，為優(yōu)勢選擇進(jìn)一步尋找證據(jù)，并為地方品種灘羊基因組多樣性研究增加遺傳數(shù)據(jù)，為今后推動(dòng)地方品種綿羊雙羔分子標(biāo)記本品種選育提供參考。

4 結(jié)論

本研究利用SNaPshot技術(shù)，在前期篩選的基礎(chǔ)上，確定在3個(gè)基因13個(gè)位點(diǎn)上比較分析了地方品種灘羊雙羔和單羔群體與多胎性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，13個(gè)位點(diǎn)均未偏離哈溫平衡，最終分析發(fā)現(xiàn)5個(gè)位點(diǎn)（SNP15、SNP5、FecB、rs21、rs22）在雙羔組和單羔組間差異顯著，這5個(gè)位點(diǎn)與多胎性狀相關(guān)，構(gòu)建的遺傳模型也被證實(shí)，但在ADAMTS1的6個(gè)位點(diǎn)中的1個(gè)block構(gòu)建3種單倍型都與多胎無關(guān)。在地方品種綿羊雙羔群體中挖掘與多胎性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，有助于雙羔分子標(biāo)記本品種選育，由于外血滲入對(duì)地方品種的巨大沖擊，鑒定并運(yùn)用雙羔分子標(biāo)記技術(shù)也是對(duì)本品種很大的保護(hù)。