小地老虎不同組織表達(dá)差異揭示其翅發(fā)育機(jī)制

鄭偉剛 靳明輝 Swapan Chakrabarty 肖彬 蕭玉濤 袁海濱

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長春 130118；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所，深圳 518120）

小地老虎（Agrotis ipsilon）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、帝王蝶、黏蟲（Mythimna separata）、稻飛虱（Nilaparvata lugens）、玉米螟（Ostriniafurnacalis、Ostrinia nubilalis）及東亞飛蝗（Locusta migratoria manilensis（Meyen））等都屬于遷飛性昆蟲［1-6］。遷飛是動物種群對棲息地資源發(fā)生季節(jié)性或偶然性變化時(shí)進(jìn)化出的一種適應(yīng)性對策，昆蟲的遷飛行為嚴(yán)重影響人類的生產(chǎn)和生活，如危害農(nóng)作物，造成農(nóng)作物大量減產(chǎn)、傳播人和牲畜的疾病等。影響昆蟲遷飛的因素眾多，包括生存環(huán)境、激素調(diào)控、遺傳因素等，而翅發(fā)育是昆蟲遷飛的一個(gè)重要影響因素。昆蟲翅膀的進(jìn)化對昆蟲覓食、求偶、避敵、抵御外界不良環(huán)境等起到重要作用［7-8］。隨著果蠅等模式昆蟲的深入研究，一系列與翅發(fā)育有關(guān)的信號通路逐漸被揭示出來，如Wnt、Hedgehog、Decapentaplegic（Dpp）、Hippo和 c-Jun N-terminal Kinase（JNK）等信號通路，其中Wnt通路是昆蟲翅發(fā)育的關(guān)鍵信號通路。

Wnt信號通路包含3種Wnt信號傳導(dǎo)通路：經(jīng)典Wnt通路，非經(jīng)典Wnt /鈣通路以及非經(jīng)典planar cell polarity通路［9-11］，這 3種途徑都是通過Wnt蛋白配體與Frizzled（Fz）家族受體結(jié)合而激活的。經(jīng)典Wnt通路引起基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，并且被認(rèn)為部分地被SPATS1基因負(fù)調(diào)節(jié)［11］。非經(jīng)典planar cell polarity通路調(diào)控細(xì)胞骨架，骨架決定細(xì)胞的形狀。非經(jīng)典Wnt /鈣通路，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的鈣。Decapentaplegic（Dpp）信號通路中，Dpp是參與果蠅發(fā)育的關(guān)鍵形態(tài)發(fā)生素，也是第一個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證的分泌形態(tài)發(fā)生素［12-13］。早期果蠅胚胎和15個(gè)成蟲器的正確形成和發(fā)育需要Dpp調(diào)控，這些組織將生長發(fā)育為成年果蠅中的四肢和其他器官和結(jié)構(gòu)。DPP在調(diào)節(jié)組織的生長和器官組織大小方面起著重要的作用［12，14］。Hedgehog（Hh）信號通路在控制細(xì)胞增殖、組織模式形成、干細(xì)胞維持和發(fā)育方面發(fā)揮著多種作用［15-18］。Hedgehog信號通路是一種向胚胎細(xì)胞傳遞信息的信號通路，這些信息是胚胎細(xì)胞分化所必需的。胚胎的不同部位具有不同濃度的Hedgehog基因信號蛋白。該通路在成蟲個(gè)體中也有作用。Hippo信號通路也被稱為Salvador或者Warts通路，通過調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡來控制動物的器官大小。該通路的名字來源于它的一個(gè)關(guān)鍵信號元件——蛋白激酶Hippo（Hpo）［19-20］。該基因的突變導(dǎo)致組織過度生長，或類似“河馬”表型。

小地老虎（Agrotis ipsilon）又名切根蟲、土蠶等，屬于一種世界性的鱗翅目夜蛾科農(nóng)業(yè)害蟲［5，21］，也是典型的遷飛性農(nóng)業(yè)害蟲。由于翅是在成蟲階段發(fā)育形成，且屬于昆蟲胸部的組成部分，本試驗(yàn)對小地老虎幼蟲，成蟲頭部、胸部、腹部和進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，探究可能決定小地老虎翅發(fā)育的關(guān)鍵通路及相關(guān)基因［22-23］。

1 材料與方法

1.1 材料

小地老虎幼蟲主要來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所農(nóng)業(yè)生態(tài)基因組學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，小地老虎成蟲主要來源于山東長島野外采集。

1.2 方法

1.2.1 小地老虎總RNA的提取、文庫構(gòu)建和測序 小地老虎幼蟲6頭作為一個(gè)重復(fù)，共取18頭做3組幼蟲整蟲轉(zhuǎn)錄組Ya、Yb、Yc的組織材料，為避免腸道微生物污染，幼蟲整蟲解剖去除圍食膜，再用液氮研磨。小地老虎成蟲每6頭作為一個(gè)重復(fù)，分別取頭、胸、腹，做頭（Ta、Tb、Tc）、胸（Xa、Xb、Xc）、腹（Fa、Fb、Fc）轉(zhuǎn)錄組材料。

取烘干研缽，加入少量乙醇，灼燒防止研缽內(nèi)殘留其他物質(zhì)。待研缽烘干后，加入液氮，將組織樣品加入研缽中研磨至粉狀，取適量放入裝有1 mL TRIzol的RNAase free 1.5 mL離心管中。通常情況下，1 mL TRIzol Reagent 能夠裂解50-100 mg組織樣品。

向樣品中加入0.2 mL氯仿（每1 mL TRIzol加0.2 mL氯仿）后，用手輕輕搖動15 s左右，使其混合并于常溫孵育2-3 min，然后將樣品于12 000 r/min、4℃條件下進(jìn)行離心15 min。將離心管傾斜為45°并用移液器將水相吸出，然后移入新的離心管，在此過程中應(yīng)盡量避免吸入混合相或者有機(jī)層。取0.5mL 異丙醇（每1 mL TRIzol對應(yīng)0.5 mL異丙醇）加入之前移出的水相樣品中，常溫孵育10 min后在4℃、12 000 r/min條件下，離心10 min，倒掉上清液并留下RNA沉淀。加入1 mL 75%酒精（每1 mL的 TRIzol至少加1 mL的75%乙醇），輕微震蕩混勻后在4℃、7 500 r/min條件下離心5 min，倒掉上清液，只留底部沉淀。風(fēng)干RNA沉淀5-10 min，禁止真空離心RNA沉淀。加入0.02-0.05 mL無核酸酶水，使用移液器反復(fù)吸打，然后在55-60℃條件下水浴10-15 min，使RNA沉淀溶解，將得到的RNA溶液于-80℃條件下長期保存。

利用 Nanodrop2000 對根據(jù)上述步驟提取出的total RNA，檢測其濃度和純度，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性，使用Agilent 2100 測定total RNA RIN 值。單次建庫要求RNA 總量 5 μg，濃度≥ 200 μg/mL，OD260/OD2280介于 1.8-2.2 之間。利用Illumina公司的TruSeqTMRNA sample preparation kit完成cDNA文庫的構(gòu)建，并通過Illumina Hiseq 測序平臺的150 paired-end模式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組組裝和ORF預(yù)測 對于無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測序和相關(guān)研究，獲得RNA-seq高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)后，需要將測序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，才能進(jìn)行后續(xù)注釋及其他生物學(xué)功能分析。Trinity（http：//trinityrnaseq.sourceforge.net/，版本號 ：v2.6.6）是目前從頭組裝Illumina 短片段序列比較常用的軟件，本試驗(yàn)在對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，使用Trinity進(jìn)行從頭組裝。使用TransDecoder（https：//github.com/TransDecoder/TransDecoder，版本號：5.5.0）軟件識別轉(zhuǎn)錄本序列中候選的編碼區(qū)域，結(jié)合 cd-hit（http：//weizhongli-lab.org/cd-hit/，版本號：v4.8.1）進(jìn)行去冗余，得到獨(dú)立基因（Unigene）序列。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組功能注釋 使用Trinity軟件組裝得到轉(zhuǎn)錄本序列后，要對生物學(xué)相關(guān)問題進(jìn)行探究，就要對這些轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋。將拼接所得所有（unigene）序列，使用Interperscan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/，版本號：v5）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，使用 Blastp（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）分別與KEGG、eggNOG、NR、Trembl、Swissprot、數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對獲得相應(yīng)的功能注釋信息，然后進(jìn)行KEGG通路富集分析。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因組百科全書，http：//www.genome.jp/kegg/）是基因組注釋方面的公共數(shù)據(jù)庫。KEGG數(shù)據(jù)庫中豐富的通路信息將有助于我們從系統(tǒng)水平去了解基因的生物學(xué)功能，例如代謝途徑、遺傳信息傳遞以及細(xì)胞過程等一些復(fù)雜的生物功能，這大大提高了該數(shù)據(jù)庫在實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用中的價(jià)值。根據(jù)與KEGG數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果，獲得轉(zhuǎn)錄本對應(yīng)的KO編號，根據(jù)KO編號可以獲得某轉(zhuǎn)錄本可能參與的具體生物學(xué)通路。eggNOG（evolutionary genealogy of genes：Non-supervised Orthologous Groups）數(shù)據(jù)庫包含了豐富的注釋信息，包含了KEGG等數(shù)據(jù)庫信息。Swiss-Prot是一個(gè)手工注釋的非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫。它結(jié)合了從科學(xué)文獻(xiàn)中提取的信息和生物尿酸評估計(jì)算分析，TrEMBL（翻譯的EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫），為那些不在Swiss-Prot中的蛋白質(zhì)提供自動注釋。NR（NCBI 非冗余蛋白庫）為綜合數(shù)據(jù)庫，包括了SwissProt、PIR（Protein information resource）、PRF（Protein research foundation）、PDB（Protein data bank）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中非冗余的數(shù)據(jù)以及從GenBank和RefSeq的CDS數(shù)據(jù)庫中翻譯所得的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)。

1.2.4 差異表達(dá)基因分析 使用組裝軟件將轉(zhuǎn)錄組組裝好后，利用RSEM（http：//deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/）進(jìn)行表達(dá)量分析。RSEM利用bowtie的比對結(jié)果進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，首先得到每個(gè)樣品比對到每個(gè)基因上的read count數(shù)目，然后對其進(jìn)行TPM數(shù)值轉(zhuǎn)換，TPM數(shù)值可以反映基因的表達(dá)水平。使用R包（edgeR和DESeq）分別對小地老虎轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，取兩者交集，得到最終差異基因。

2 結(jié)果

2.1 原始測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

測序小地老虎幼蟲，成蟲頭、胸和腹部，各3個(gè)樣本，共計(jì)12個(gè)樣本。小地老虎幼蟲共測數(shù)據(jù)19.59 G，小地老虎成蟲頭部20.73 G，小地老虎成蟲胸部21.36 G，小地老虎成蟲腹部21.32 G，共計(jì)數(shù)據(jù)量82.99 G，質(zhì)控去掉Adapter和低于Q20的數(shù)據(jù)后最終得到78.67 G（表1）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組組裝和ORF預(yù)測

使用 Trinity（http：//trinityrnaseq.sourceforge.net/）軟件，對小地老虎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝。最終組裝得到轉(zhuǎn)錄組243.4 M，最長序列27.4 K，平均長度0.6 K，N50 0.7 K，denove轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果GC含量為39.66%（表2）。使用TransDecoder對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行ORF 預(yù)測，并去冗余后，得到37 744個(gè)unigenes。轉(zhuǎn)錄組組裝長度頻數(shù)分布（圖1），圖1-A為轉(zhuǎn)錄本（Transcripts）組裝長度頻數(shù)分布，在200-500范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本比例最多，為67.59%，其次為在500-1 000范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本比例為22.03%。圖1-B為Unigenes組裝長度頻數(shù)分布，在500-1 000范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本比例最多，為33.83%，其次為在200-500范圍內(nèi)的比例為30.29%。

表1 小地老虎轉(zhuǎn)錄組測序原始數(shù)據(jù)及質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表2 轉(zhuǎn)錄組denovo組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 小地老虎轉(zhuǎn)錄組功能注釋

使用Interperscan進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，共有20 522個(gè)unigenes預(yù)測出結(jié)構(gòu)域信息。將拼接所得獨(dú)立基因，使用Blastp分別與NR、Sport、Trembl、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，比對后取besthit獲得相應(yīng)的注釋信息。

KEGG 數(shù)據(jù)庫注釋功能基因23 334個(gè)，注釋通路373條，KO 6 161個(gè)；eggNOG 數(shù)據(jù)路注釋功能基因31 556個(gè)，Orthologous Groups（OG，同源群）8 211個(gè)；Nr 數(shù)據(jù)庫共注釋功能基因29 971個(gè)；Swissprot 數(shù)據(jù)庫注釋功能基因本21 538個(gè)；Trembl數(shù)據(jù)庫注釋功能基因32 354個(gè)。各個(gè)數(shù)據(jù)庫功能注釋Venn圖（圖2），其中5個(gè)數(shù)據(jù)庫能夠共同注釋到的基因有18 345個(gè)。5個(gè)數(shù)據(jù)庫分別注釋出了本數(shù)據(jù)庫特有基因，其中Trembl數(shù)據(jù)庫注釋出的特有基因最多，為426個(gè)，KEGG數(shù)據(jù)庫注釋出的特有基因最少，有15個(gè)（圖2）。

圖1 轉(zhuǎn)錄組組裝長度頻數(shù)分布

2.4 小地老虎轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異分析

分別使用EdgeR.R和DEseq2.R 進(jìn)行差異分析，并求出差異基因。再將兩種方法得到的差異基因求交集，得到最終的差異基因（圖3）。最終得到小地老虎成蟲頭部樣本與小地老虎胸部樣本轉(zhuǎn)錄組差異基因4 069個(gè)，小地老虎成蟲胸部樣本與小地老虎腹部樣本轉(zhuǎn)錄組差異基因6 905個(gè)，小地老虎成蟲腹部樣本與小地老虎頭部樣本轉(zhuǎn)錄組差異基因7 777個(gè)，小地老虎幼蟲與小地老虎成蟲頭部樣轉(zhuǎn)錄組差異基因5 768個(gè)，小地老虎幼蟲與小地老虎成蟲胸部樣轉(zhuǎn)錄組差異基因4 836個(gè)，小地老虎幼蟲與小地老虎成蟲腹部樣轉(zhuǎn)錄組差異基因8 917個(gè)。小地老虎成蟲頭部與腹部差異基因最多，小地老虎成蟲頭部與胸部差異基因最少。小地老虎幼蟲與成蟲頭、胸、腹三部分相比，小地老虎幼蟲與成蟲腹部的差異基因最多，與胸部的差異基因最少（圖3）。

圖2 轉(zhuǎn)錄組不同數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果Venn圖

圖3 各組樣本DESeq2與EdegR基因差異表達(dá)火山圖和差異基因Venn圖

通過對小地老虎轉(zhuǎn)錄組KEGG通路富集分析，結(jié)合Interperscan結(jié)構(gòu)域預(yù)測和其他注釋信息得到小地老虎翅發(fā)育機(jī)制相關(guān)通路基因，并進(jìn)行表達(dá)量分析與表達(dá)量差異比較分析，對差異表達(dá)基因繪制小地老虎Wnt信號通路基因表達(dá)熱圖（圖4）；并根據(jù)KEGG通路差異基因富集分析繪制小地老虎Wnt信號通路基因圖（圖5）。由小地老虎Wnt相關(guān)基因KEGG通路基因富集分析和表達(dá)量差異比較分析可知，Notum、Frizzled、CaN等53個(gè)元件均被注釋出，但是PRP、GBp、ICAT等17個(gè)元件沒有在小地老虎轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)（圖4-5）。Wnt信號通路包含經(jīng)典Wnt通路，非經(jīng)典Wnt /鈣通路以及非經(jīng)典planar cell polarity通路，其中非經(jīng)典Wnt /鈣通路以及非經(jīng)典planar cell polarity通路總基因數(shù)目較少，但是在小地老虎轉(zhuǎn)錄組中注釋出的基因較多，非經(jīng)典Wnt/鈣通路只有一個(gè)元件未注釋出，非經(jīng)典planar cell polarity通路只有兩個(gè)元件未注釋出；非經(jīng)典Wnt /鈣通路，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的鈣，非經(jīng)典planar cell polarity通路調(diào)控細(xì)胞骨架，骨架決定細(xì)胞的形狀。

圖4 小地老虎Wnt信號通路基因表達(dá)熱圖

小地老虎胸部組織與頭部組織相比，F(xiàn)rizzled（Fz）、BMP and activin membrane-bound inhibitor（BAMBI）、（CKIα）、casein kinase 1（CKIε）、Axin、Myc proto-oncogene protein（c-myc）、E3 ubiquitinprotein ligase（Siah-1）、glypican 4（Knypek）、serine/threonine-protein phosphatase 2B catalytic subunit（CaN）、cullin 1（Cul1）等在小地老虎胸部組織中都上調(diào)表達(dá)，Notum、calcyclin binding protein（SIP）、classical protein kinase C alpha type（PKC）在胸部組織中下調(diào)表達(dá)。小地老虎胸部組織與腹部組織相比，Notum、Dally、Siah-1、CaN等在小地老虎胸部組織中都上調(diào)表達(dá)，wingless-type MMTV integration site family、Frizzled、Rac等在小地老虎胸部組織中下調(diào)表達(dá)。小地老虎胸部組織與小地老虎幼蟲組織相比，F(xiàn)rizzled、Dally、SIP、Cul1、Siah-1等上調(diào)表達(dá)，Rac、phosphatidylinositol phospholipase C beta（PLC）、Frizzled等下調(diào)表達(dá)（圖5）。

小地老虎胸部組織相對于頭部、腹部及幼蟲組織，只有Siah-1和CaN全部上調(diào)表達(dá)，Notum雖然在小地老虎胸部組織相對于頭部、幼蟲對比中上調(diào)表達(dá)，但在小地老虎胸部組織相對腹部組織中下調(diào)表達(dá)。SIP同時(shí)在小地老虎胸部相對于頭部和腹部比較中下調(diào)表達(dá)。

非經(jīng)典planar cell polarity通路中，小地老虎胸部相對于頭部有表達(dá)差異的基因全部為表達(dá)上調(diào)，小地老虎胸部相對于腹部有表達(dá)差異的基因全部為表達(dá)下調(diào)。非經(jīng)典planar cell polarity通路中，PLC在小地老虎胸部相對于頭部和幼蟲的基因表達(dá)中均為下調(diào)，下游元件CaN表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)。

圖5 小地老虎Wnt信號通路基因圖

3 討 論

Wnt信號通路相關(guān)基因在小地老虎幼蟲、小地老虎成蟲頭、胸、腹部均有表達(dá)。Wnt信號通路包含3種Wnt信號傳導(dǎo)通路：經(jīng)典Wnt通路，非經(jīng)典Wnt /鈣通路以及非經(jīng)典planar cell polarity通路。非經(jīng)典planar cell polarity通路是通過Wnt與Fz及其共受體結(jié)合而激活的。然后受體結(jié)合Dishevelled（Dsh），Dsh利用其PDZ和DIX結(jié)構(gòu)域與morphogenesis 1（Daam1）的Dishevelled-associated激活因子1形成復(fù)合物。然后Daam1通過鳥嘌呤交換因子激活G-蛋白Rho［24］。Rho激活Rho相關(guān)激酶Rho-associated kinase（ROCK），這是細(xì)胞骨架的主要調(diào)節(jié)因子之一。Dsh還與Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1（Rac1）形成復(fù)合物，并介導(dǎo)profilin與肌動蛋白的結(jié)合［25］。Rac1激活JNK，也可導(dǎo)致肌動蛋白聚合。丙氨酸與肌動蛋白結(jié)合可導(dǎo)致細(xì)胞骨架和原腸胚的重組。經(jīng)典Wnt通路相關(guān)基因有一些在小地老虎轉(zhuǎn)錄組中未被注釋到，這可能與小地老虎的發(fā)育有關(guān)，有些基因沒有表達(dá)，也有可能與物種有關(guān)，小地老虎可能不含有某些基因。同時(shí)這些在小地老虎腹部表達(dá)的基因可能參與一些基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，這也是此信號通路的主要功能。

Wnt信號通路相關(guān)基因在小地老虎幼蟲和成蟲不同組織表達(dá)差異揭示小地老虎可能的翅發(fā)育機(jī)制，非經(jīng)典planar cell polarity通路調(diào)控細(xì)胞骨架，決定骨架細(xì)胞的形狀，Rac在小地老虎腹部相對小地老虎胸部上調(diào)表達(dá)，Rac也能間接影響JNK，從而影響一些基因的轉(zhuǎn)錄。非經(jīng)典Wnt /鈣通路中，小地老虎胸部相對于頭部、腹部和小地老虎幼蟲，CaN、Siah-1都表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，CaN在肌肉形成和功能的基本過程中起著重要的作用［26］，因此小地老虎成蟲胸部CaN的表達(dá)可能與其肌肉功能有關(guān)。本次試驗(yàn)的小地老虎成蟲為處于遷飛狀態(tài)的小地老虎成蟲，胸部肌肉相關(guān)基因表達(dá)較高與其生物性狀相適應(yīng)。

Wnt信號通路相關(guān)基因在小地老虎幼蟲、成蟲頭、胸、腹部的表達(dá)存在差異，小地老虎胸部組織與頭部組織、腹部組織和小地老虎幼蟲組織相比，CaN、Siah-1相關(guān)基因都顯著上調(diào)表達(dá)。這些基因有可能在其他昆蟲中也會有類似現(xiàn)象。對于昆蟲翅發(fā)育相關(guān)基因的研究主要集中于昆蟲羽化之前，本試驗(yàn)表明，在昆蟲羽化后一些翅發(fā)育相關(guān)基因會繼續(xù)在成蟲胸部表達(dá)，也可能與翅部肌肉等組織的發(fā)育和代謝有關(guān)。這些對于昆蟲或者對于遷飛昆蟲的研究可能提供一些研究思路。近年來，隨著illumina、pacbio、nonapore等高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，以及CRISPR-Cas9技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的科學(xué)問題通過基因組測序成功解決，也為研究昆蟲遷飛相關(guān)基因功能解析提供了新的技術(shù)方法［27］。

另外，影響昆蟲翅發(fā)育相關(guān)通路還有Decapentaplegic（Dpp）、Hedgehog、Hippo信號通路等。Dpp是參與果蠅發(fā)育的關(guān)鍵形態(tài)發(fā)生素，Dpp也是第一個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證的分泌形態(tài)發(fā)生素［12-13］。Hedgehog（Hh）信號通路在控制細(xì)胞增殖、組織模式形成、干細(xì)胞維持和發(fā)育方面發(fā)揮著多種作用［15-18］。Hippo信號通路也被稱為Salvador或者Warts通路，通過調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡來控制動物的器官大小。該通路的名字來源于它的一個(gè)關(guān)鍵信號元件——蛋白激酶Hippo（Hpo）［19-20］。該基因的突變導(dǎo)致組織過度生長，或類似“河馬”表型。

昆蟲翅的進(jìn)化對昆蟲的意義重大，探究影響昆蟲翅生長發(fā)育的相關(guān)通路，有助于了解昆蟲翅的進(jìn)化及發(fā)育的過程。在眾多的昆蟲中，有相當(dāng)一部分為農(nóng)業(yè)害蟲，有些如棉鈴蟲、小地老虎等還是可進(jìn)行遷飛的害蟲，探究昆蟲翅的發(fā)育機(jī)制，可以為揭開昆蟲遷飛面紗并研發(fā)新型防治農(nóng)業(yè)害蟲方法提供幫助。本研究通過對小地老虎轉(zhuǎn)錄組的組裝及注釋，結(jié)合影響果蠅翅發(fā)育相關(guān)通路基因，找到許多潛在與小地老虎翅發(fā)育相關(guān)通路基因，為后續(xù)研究小地老虎翅發(fā)育相關(guān)基因提供了良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過對小地老虎轉(zhuǎn)錄組的組裝及注釋，最終組裝得到轉(zhuǎn)錄組243.4 Mb，組裝出轉(zhuǎn)錄本429 288個(gè)，獨(dú)立基因37 744個(gè)。小地老虎Wnt相關(guān)通路中，Notum、Frizzled、CaN等53個(gè)相關(guān)元件被注釋出。Wnt信號通路中的非經(jīng)典planar cell polarity通路中，PlC在小地老虎胸部相對于頭部和幼蟲的基因表達(dá)中均為下調(diào)，下游元件CaN、Siah-1在小地老虎胸部相對于頭部、腹部及幼蟲組織的基因表達(dá)中均表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)，可能與其肌肉功能有關(guān)。