星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化芹菜籽揮發(fā)油羥丙基-β-環(huán)糊精的包合工藝*

劉道群，國大亮，趙 宇，劉 巖，宋秀寧，劉玉璇

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2．天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，天津 300112）

芹菜籽為傘形科植物旱芹（Apium graveolens L．）的干燥成熟果實(shí)[1]。芹菜籽在維吾爾醫(yī)藥中廣泛應(yīng)用，具有消除寒濕閉陰，消食健胃，消腫散氣，消石止痛，調(diào)和百藥等功效[2]，是新疆資源豐富的藥食兼用植物資源。芹菜籽中的揮發(fā)油是芹菜籽中的重要成分，具有抗氧化[3]、降低亞硝酸鈉活性[4-5]、降低血液黏度[6]、抗腦缺血[7]、降血壓[8]等藥理作用。同時(shí)其具有清新的香氣，可用于食品、化妝品等行業(yè)[9-10]。芹菜籽揮發(fā)油中的主要藥效成分為丁苯酞。丁苯酞可用于治療帕金森癥、阿爾茲海默病、血管性癡呆、抑郁癥、驚厥、癲癇等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，同時(shí)可以用于心血管系統(tǒng)疾病，對某些糖尿病及高血壓并發(fā)癥具有一定的療效[11-16]。目前上市的國家一類新藥丁苯酞軟膠囊，臨床上主要用于治療輕、中度急性缺血性腦卒中。

在制劑過程中，揮發(fā)油處理的常規(guī)方式為直接噴灑，但是揮發(fā)油性質(zhì)不穩(wěn)定，對光、熱、空氣敏感，在制劑中易損失，為提高芹菜籽揮發(fā)油的穩(wěn)定性和水溶性，減小刺激性，本研究采用羥丙基-β-環(huán)糊精包合芹菜籽揮發(fā)油，并采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法對包合工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SSI型高效液相色譜儀（美國實(shí)驗(yàn)儀器公司）；Jade DSC型差示掃描量熱儀（美國Perkin Elmer公司）；UV2450型紫外分光光度計(jì)（日本島津）；BT25S型十萬分之一分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UPT-Ⅱ-10T型超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；SOP型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（江蘇中大儀器科技有限公司）；LGJ-10型冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；ZDHW型調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；WZJ-681型振動(dòng)式藥物超微粉碎機(jī)（濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司）；Five Eosy PlusTM FE20型pH計(jì)（METTLER TOLEDO）；TG16-WS型臺式高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 試藥 芹菜籽揮發(fā)油（實(shí)驗(yàn)室自制）；羥丙基-β-環(huán)糊精（山東濱州智源生物科技有限公司）；中性蛋白酶（江蘇銳陽生物科技有限公司，200 000 U/g）；中溫α淀粉酶（江蘇銳陽生物科技有限公司，10000U/g）；丁苯酞對照品（批號101035-201502，中國食品藥品檢定研究院，含量以99．6%計(jì)）；甲醇（分析純，天津康科德科技有限公司）；乙腈（色譜純，天津康科德科技有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；石油醚（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；去離子水（自制，優(yōu)普系列超純水器）。

2 方法與結(jié)果

2.1 芹菜籽揮發(fā)油的提取 取芹菜籽適量，超微粉碎機(jī)粉碎，過五號藥典篩。然后取過篩后的芹菜籽粉300 g，置于圓底燒瓶中，加入1 800 mL去離子水浸泡30 min。加磷酸調(diào)節(jié)pH至6．2，加入6 g復(fù)合酶（中性蛋白酶：中溫α淀粉酶=1∶1），混合均勻，置55℃水浴中酶解2 h，然后采用水蒸氣蒸餾法提取5 h，即得淡黃色透明的芹菜籽揮發(fā)油，提取率為 2．336%。

2.2 包合物制備方法 精密稱取芹菜籽揮發(fā)油適量于燒杯中，加適量的無水乙醇溶解；另取各實(shí)驗(yàn)對應(yīng)的羥丙基-β-環(huán)糊精于燒杯中，加2倍量的水溶解。將羥丙基-β-環(huán)糊精溶液置于磁力攪拌器上，固定轉(zhuǎn)速，在各實(shí)驗(yàn)對應(yīng)的恒定溫度下逐滴加入揮發(fā)油乙醇溶液，攪拌至規(guī)定時(shí)間，包合液以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心2 min后，吸去上層未包合的揮發(fā)油，用0．45μm孔徑微孔濾膜過濾，放至冷凍干燥機(jī)，冷凍干燥24 h即得芹菜籽揮發(fā)油-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物。

2.3 含量測定方法

2.3.1 色譜條件 高效液相色譜柱：Platisil C18（Dikma公司，4．6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相-乙腈：0．3% 磷酸水（48∶52），流速：1 mL/min，檢測波長：235 nm；柱溫：25℃，進(jìn)樣量20μL，理論塔板數(shù)不低于2 500。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取丁苯酞對照品4．89 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到濃度為97．4μg/mL的對照品貯備液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取0．5 g包合物樣品置于25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，0．45 μm 孔徑微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別取“2．3．2”項(xiàng)下對照品溶液適量，甲醇稀釋，搖勻，得到濃度為9．740、19．48、38．96、58．44、77．92、97．40 μg/mL 的系列對照品溶液，用 0．45 μm 孔徑微孔濾膜過濾，按“2．3．1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。以進(jìn)樣濃度（X）對峰面積（Y）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得丁苯酞的回歸方程分別為：Y?=34240X+11 521（r=0．999 8）。結(jié)果表明，丁苯酞在 9．740～97．40μg/mL的濃度范圍內(nèi)濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2．3．2”項(xiàng)下對照品溶液，按上述色譜條件，進(jìn)樣20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定丁苯酞的峰面積，按峰面積計(jì)算RSD值為0．70%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品6份，按“2．3．3”項(xiàng)下方法制備包合物的供試品溶液，按“2．3．1”項(xiàng)下色譜條件測定供試品溶液中丁苯酞的峰面積，計(jì)算RSD值為0．77%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批包合物，按照“2．3．3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣，按“2．3．1”項(xiàng)下色譜條件測定供試品中溶液中丁苯酞的峰面積，計(jì)算RSD值為1．5%，表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率 精密稱取已知含量的樣品6 份，精密加入一定量的對照品，按“2．3．1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，根據(jù)峰面積計(jì)算平均回收率和RSD值。丁苯酞平均回收率為100．6%，RSD為1．7%（n=6），表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.4 評價(jià)指標(biāo) 制備包合物的過程中的評價(jià)指標(biāo)采用綜合評分法，以包合率和包合物中丁苯酞的載藥量為綜合考察指標(biāo)，按照“2．3．3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用高效液相色譜法測定包合物中丁苯酞的含量，以包合物中的丁苯酞總量與投入量的比值計(jì)算包合率Y1，權(quán)重系數(shù)0．7；以包合物中丁苯酞的單位含量作為載藥量Y2，權(quán)重系數(shù)0．3。綜合指標(biāo)OD=（Y1/Y1max）×0．7+（Y2/Y2max）×0．3。

2.5 單因素考察

2.5.1 投料比單因素考察 精密稱取芹菜籽揮發(fā)油5份，按照“2．2”項(xiàng)下包合物的制備方法，設(shè)定包合溫度為40℃，包合時(shí)間為120 min，考察芹菜籽揮發(fā)油與羥丙基-β-環(huán)糊精的比例為 1∶50、1∶25、3∶50、2∶25、1∶10 時(shí)的包合率和載藥量，并計(jì)算 OD 值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，由結(jié)果可知投料比為2∶25時(shí)，包合物的OD值最大，比例增大，揮發(fā)油的包合率會減小，包合物的OD值隨之減小，因此選用投料比2∶25為星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.5.2 包合溫度單因素考察 精密稱取芹菜籽揮發(fā)油5份，按照“2．2”項(xiàng)下包合物的制備方法，設(shè)定揮發(fā)油與羥丙基-β-環(huán)糊精的比例為2∶25，包合時(shí)間 120 min，考察包合溫度為 30、40、50、60、70 ℃時(shí)的包合率和載藥量，并計(jì)算OD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，由結(jié)果可知包合溫度為40℃時(shí)，包合物的OD值最大，溫度升高或降低都不利于芹菜籽揮發(fā)油的包合，因此選用40℃為星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表1 投料比對包合效果的影響Tab.1 Effect of feeding ratio on inclusion

表2 包合溫度對包合效果的影響Tab.2 Effect of inclusion tem perature on inclusion

2.5.3 包合時(shí)間單因素考察 精密稱取芹菜籽揮發(fā)油5份，按照“2．2”項(xiàng)下包合物的制備方法，設(shè)定揮發(fā)油與羥丙基-β-環(huán)糊精的比例為2∶25，包合溫度 40 ℃，考察包合時(shí)間為 40、80、120、160、200 min時(shí)的包合率和載藥量，并計(jì)算OD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，由結(jié)果可知，包合時(shí)間為160 min時(shí)，包合物的OD值最大，包合時(shí)間增長會導(dǎo)致?lián)]發(fā)油損失，包合率下降，因此選用160 min為星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表3 包合時(shí)間對包合效果的影響Tab.3 Effect of inclusion time on inclusion

2.6 星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)化 效應(yīng)面優(yōu)化法就是通過擬合效應(yīng)變量對考察因素變量的效應(yīng)面，即函數(shù)f可以用某一數(shù)學(xué)模型近似地模擬函數(shù)，依據(jù)該模型可以描繪效應(yīng)面，從效應(yīng)面上選擇最優(yōu)的效應(yīng)域，利用這一數(shù)學(xué)模型求得自變量的取值范圍即最佳實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化法[17]。

本實(shí)驗(yàn)通過單因素考察，確定了投料比、包合溫度、包合時(shí)間的優(yōu)化范圍，采用三因素五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)，以包合率和載藥量的OD值為考察指標(biāo)，對包合工藝進(jìn)行優(yōu)化，星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平見表4、星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果見表5。

表4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表Tab.4 Level table of central com posite design

表5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Experimental arrangement and results of central com posite design

運(yùn)用Design expert 10．0．3軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，以O(shè)D值對自變量進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式、三項(xiàng)式非線性擬合，多元線性方程為：OD=83．007 26-2．497 8A+0．102 51B+3．936 56×10-3C（P=0．218 8，失擬項(xiàng) P=0．001 2）；二項(xiàng)式擬合方程為：OD=26．813 53+630．33A+1．047 07B+0．180 93C-0．575AB-0．58437AC+2．8125×10-4BC-3227．04873A2-0．011 795 5B2-4．721 6×10-4C2（P＜0．000 1，失擬項(xiàng)P=0．316 6）；三項(xiàng)式擬合方程為：OD=-10．130 10+1 112．114 63A+2．834 77B+0．202 59C-22．793 52AB-1．01206AC+3．125×10-5BC-3468．08883A2-0．033760B2-4．421 60 ×10-4C2+3．125 ×10-3ABC-1．541 04A2B+1．891 76A2C+0．274 56AB2（P=0．000 5，失擬項(xiàng) P=0．207 41）。二項(xiàng)式擬合模型 P＜0．000 1，說明其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該模型在本研究所選定的因素范圍內(nèi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；方程的失擬項(xiàng)不顯著說明模型與實(shí)際情況模擬較好，沒有失擬因素存在，可以選用此模型對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，二項(xiàng)式回歸模型方差分析見表6。

表6 二項(xiàng)式回歸模型方差分析表Tab.6 Analysisof variance for regression model

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Design expert 10．0．3軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，得到兩兩因素對包合效果OD值影響的三維效應(yīng)曲面圖（見圖1）和等高線圖（見圖2），軟件預(yù)測最佳包合工藝條件為：揮發(fā)油與羥丙基-β-環(huán)糊精比例為 2∶25，包合溫度 44．5 ℃，包合時(shí)間167 min，在該包合條件下，綜合評分（Y）的預(yù)測值為89．95，按上述優(yōu)化結(jié)果的條件制備3批包合物，測定包合率和載藥率，結(jié)果如表7所示。所得平均OD值為89．95，實(shí)際值與星點(diǎn)設(shè)計(jì)預(yù)測結(jié)果基本一致，說明該擬合方程可較好地預(yù)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該包合工藝穩(wěn)定可行。

2.8 包合物的表征

2.8.1 紫外掃描法（UV） 取芹菜籽揮發(fā)油10 mg，加25 mL無水乙醇溶解，為樣品a；取包合物0．15 g，加25 mL乙酸乙酯，超聲20 min，0．45μm孔徑微孔濾膜濾過，續(xù)濾液為樣品 b；取包合物0．15 g，加25 mL乙酸乙酯，振搖后0．45μm孔徑微孔濾膜濾過，續(xù)濾液為樣品 c；取羥丙基-β-環(huán)糊精 0．15 g，加25 mL無水乙醇溶解，為樣品d。對4個(gè)樣品進(jìn)行紫外掃描，掃描范圍200～400 nm。由圖3結(jié)果可知，羥丙基-β-環(huán)糊精對測定無干擾，芹菜籽揮發(fā)油的乙醇溶液與包合物的乙酸乙酯提取液在273 nm和280 nm處有明顯的吸收峰，而包合物的乙酸乙酯溶液在這兩個(gè)波長下沒有吸收峰，說明芹菜籽揮發(fā)油被羥丙基-β-環(huán)糊精成功包合。

2.8.2 差示掃描量熱法（DSC） 采用差示掃描量熱法對芹菜籽揮發(fā)油包合物進(jìn)行表征，測定氣體為氮?dú)?，升溫速度?0℃/min，升溫范圍為30～450℃，以空白坩堝為參比，分別測定芹菜籽揮發(fā)油、羥丙基-β-環(huán)糊精、芹菜籽揮發(fā)油包合物、羥丙基-β-環(huán)糊精與芹菜籽揮發(fā)油混合物。由圖5可知，混合物的熱曲線呈現(xiàn)兩者特征疊加，說明兩者只是物理混合。芹菜籽揮發(fā)油包合物與羥丙基-β-環(huán)糊精的熱曲線相似，呈現(xiàn)羥丙基-β-環(huán)糊精的特征，未有揮發(fā)油熱曲線的特征，表明羥丙基-β-環(huán)糊精成功包合芹菜籽揮發(fā)油。

圖1 各兩兩因素對OD值的三維效應(yīng)曲面圖的影響Fig.1 Effect of each two factors on 3D-response surface map of OD values

圖2 各兩兩因素對OD值的等高線圖的影響Fig.2 Effect of each two factors on contour map of OD values

圖3 樣品紫外吸收曲線Fig.3 UV absorption curveof samples

圖4 樣品差示掃描量熱曲線Fig.4 Differential scanning calorimetry curve of samp les

表7 包合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of inclusion verification test

3 討論

目前，包合揮發(fā)油的材料主要有β-環(huán)糊精和羥丙基-β-環(huán)糊精，羥丙基-β-環(huán)糊精是由β-環(huán)糊精和環(huán)氧丙烷縮合而成的一類羥烷基親水性衍生物，與β-環(huán)糊精相比具有水溶性好、疏水性空腔大、安全性好等優(yōu)點(diǎn)[18]。本研究曾采用β-環(huán)糊精對芹菜籽揮發(fā)油進(jìn)行包合，但是包合率低且重現(xiàn)性差，β-環(huán)糊精水溶性差，不利于藥物溶出。因此本研究采用羥丙基-β-環(huán)糊精包合芹菜籽揮發(fā)油，以包合率和載藥量的OD值作為評價(jià)指標(biāo)，根據(jù)重要程度分配權(quán)重，優(yōu)化出最優(yōu)工藝。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法比正交實(shí)驗(yàn)更簡便，比均勻設(shè)計(jì)法更全面，其實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少，實(shí)驗(yàn)精度高，適用于多因素、多水平的實(shí)驗(yàn)[19]。本實(shí)驗(yàn)通過單因素考察，確定出各因素的優(yōu)化范圍，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對芹菜籽揮發(fā)油包合工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過二項(xiàng)式擬合方程預(yù)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。建立的HPLC方法適用于包合物中丁苯酞的含量測定，該方法操作簡單，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。

本實(shí)驗(yàn)通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法篩選出芹菜籽揮發(fā)油的最優(yōu)包合工藝：采用飽和水溶液法，揮發(fā)油與羥丙基-β-環(huán)糊精比例為2∶25，包合溫度44．2℃，包合時(shí)間166 min，在此包合條件下，羥丙基-β-環(huán)糊精包合芹菜籽揮發(fā)油的包合率為78．95%，載藥量為 2．982 mg/g。采用 UV、DSC 對芹菜籽揮發(fā)油包合物進(jìn)行表征，結(jié)果表明芹菜籽揮發(fā)油被羥丙基-β-環(huán)糊精成功包合。