標(biāo)記指導(dǎo)大規(guī)?；旌霞蚁颠x育技術(shù)應(yīng)用實(shí)例

魯翠云，李超，曹頂臣，匡友誼，鄭先虎，李崇文，孫效文

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070;2.天津市天祥水產(chǎn)有限責(zé)任公司，天津 301500）

近年來，鯉Cyprinus carpio、鯽Carassius auratus、草魚Ctenopharyngodon idellus、鰱Hypophthalmichthys molitrix 和鳙Aristichthys nobilis 等我國主要養(yǎng)殖魚類基因組資源迅速積累，相繼開發(fā)了大量的共顯性標(biāo)記，建立了遺傳連鎖圖譜，發(fā)掘出了與重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）標(biāo)記。孫效文等[1]將分子育種技術(shù)定義為在群體、家系或個(gè)體選擇中使用了基因或標(biāo)記的育種技術(shù)。按照其觀點(diǎn)，我國主要養(yǎng)殖魚類均具備了開展分子育種研究的條件。利用分子標(biāo)記揭示親本個(gè)體間的遺傳差異，指導(dǎo)繁殖配組的分子育種技術(shù)已經(jīng)在鯉[2]、牙鲆Paralichthys olivaceus[3]、紅鰭東方鲀Takifugu rubripes[4]、大黃魚Larimichthys crocea[5]等魚類中應(yīng)用，開發(fā)了分子標(biāo)記指導(dǎo)的家系選育、群體選育、遺傳結(jié)構(gòu)優(yōu)化等一系列切實(shí)可行的分子育種技術(shù)路線[6]，取得了良好的選育效果[7,8]。既利用表型數(shù)據(jù)又利用基因型數(shù)據(jù)的分子育種技術(shù)是育種的換代技術(shù)，具有巨大的應(yīng)用潛力與優(yōu)勢。

混合家系選育及群體選育是魚類育種中常用的技術(shù)，但是，其繁殖的子代系譜不清，連續(xù)幾代繁殖后近親衰退嚴(yán)重?；谟H本遺傳背景的分子育種技術(shù)雖然可以解決這一難題，但是，有2 個(gè)因素制約了其推廣應(yīng)用：一是用分子標(biāo)記區(qū)分大量家系混合群體的工作量巨大，很難準(zhǔn)確鑒別數(shù)百個(gè)家系。目前，用分子標(biāo)記區(qū)分的最大的家系數(shù)目是245個(gè)[9]，限制了育種的強(qiáng)度；二是在苗種價(jià)值較低的魚類中應(yīng)用此法投入巨大，不利于在基層育種單位推廣。本研究將家系選育的準(zhǔn)確性和群體選育的易操作性相結(jié)合，建立了標(biāo)記指導(dǎo)的大規(guī)模混合家系選育技術(shù)，利用“優(yōu)選法”理念，不以鑒別和區(qū)分家系為目的，而是利用表型選擇獲得優(yōu)良的核心群體后，用分子標(biāo)記鑒定選擇的個(gè)體的系譜關(guān)系。以鏡鯉的選育為例，具體介紹了該技術(shù)的操作流程和簡要技術(shù)路線（圖1）。該技術(shù)方案避免了近親交配，簡化了育種步驟，減輕了工作量，提高分子育種技術(shù)的可操作性，可適應(yīng)不同生產(chǎn)條件的分子育種工作。

1 材料與方法

1.1 材料

鏡鯉親本繁育群體為分子標(biāo)記指導(dǎo)家系選育的F1代[2]，來自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實(shí)驗(yàn)站。親本的選擇包括外觀選擇、表型數(shù)據(jù)選擇、分子標(biāo)記選擇，具體選擇標(biāo)準(zhǔn)及詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[6]。選擇3+齡親本334 尾，雌魚210 尾，雄魚124 尾，平均體質(zhì)量2 314.44g，平均體長39.71cm。電子標(biāo)記后，按參考文獻(xiàn)[2]方法取鰭條，提取基因組DNA。

根據(jù)親本個(gè)體間的遺傳差異，以繁殖組內(nèi)任何一對(duì)雌、雄魚間無近親交配關(guān)系為原則設(shè)計(jì)家系配組，建立大規(guī)模組間混合家系繁殖子代。繁育的部分苗種依托天津市天祥水產(chǎn)有限責(zé)任公司養(yǎng)殖和選育，經(jīng)過2 個(gè)年度的系統(tǒng)培育和選育，形成了F2代繁殖的核心群體300 尾，電子標(biāo)記后，采集鰭條樣本，提取基因組DNA。

1.2 引物與試劑

選取20 個(gè)與體長、體質(zhì)量、體高、飼料轉(zhuǎn)化率等[10-13]生長性狀相關(guān)的QTL 標(biāo)記檢測了F1和F2親本個(gè)體間的遺傳差異。引物由上海生工生物工程公司（簡稱上海生工）合成，引物信息見表1。實(shí)驗(yàn)所用的Taq DNA 聚合酶、dNTP 及生化試劑均購自上海生工。

1.3 PCR 擴(kuò)增及檢測

15μL PCR反應(yīng)體系含10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，dNTP 各200 μmol/L，微衛(wèi)星上下游引物各5 pmol，Taq DNA聚合酶1U，DNA 模板100 ng。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30s，51～60℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，27 個(gè)循環(huán)；最后72℃下延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，用Gel-Pro Analyzer 4.5 軟件分析電泳條帶的大小。

1.4 數(shù)據(jù)處理

微衛(wèi)星是共顯性遺傳，可從凝膠電泳圖譜上直接判斷出個(gè)體的基因型，用自主開發(fā)的“魚類種質(zhì)資源遺傳分析平臺(tái)（專利號(hào)：ZL200710144749.3）”處理個(gè)體間遺傳數(shù)據(jù)，將其轉(zhuǎn)化為PHYLIP 3.6 識(shí)別數(shù)據(jù)格式，用PHYLIP 3.6 軟件的gendist 程序計(jì)算個(gè)體間的遺傳距離，用neighbor 程序繪制聚類圖，經(jīng)過1 000 次抽樣自舉檢驗(yàn)，選定唯一聚類圖，用自主開發(fā)的計(jì)算機(jī)軟件“基于遺傳背景的分子育種軟件1.0（登錄號(hào)：2011SR091052）”劃分繁殖系譜，組間雌雄個(gè)體交叉進(jìn)行配組繁殖混合家系，以避免近親繁殖。

圖1 標(biāo)記指導(dǎo)大規(guī)?；旌霞蚁颠x育技術(shù)路線簡圖Fig.1 Technical route diagram of large-scale mixed family selection assisted by microsatellite markers

表1 本研究用的微衛(wèi)星引物及其序列Tab.1 Sequences of microsatellite primers used in the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 鏡鯉F1親本個(gè)體間的遺傳差異

用20 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了鏡鯉親本個(gè)體間的遺傳差異，用PHYLIP 3.6 軟件包內(nèi)的gendist 程序計(jì)算了個(gè)體間的遺傳距離在0.0120～2.0794 之間。neighbor 程序繪制的聚類結(jié)果顯示，多數(shù)親本個(gè)體具有相似的遺傳背景，個(gè)體間遺傳分化程度較小。其中328 個(gè)個(gè)體在相同節(jié)點(diǎn)處聚成74 個(gè)分支，多數(shù)個(gè)體以2～5 個(gè)個(gè)體聚為一支，占全部分支的79.73%，其中43.28%的個(gè)體遺傳距離處于0.4～0.7的范圍之內(nèi)（圖2），適合作為親本繁殖下一代，而存在近親交配風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體數(shù)僅占7.90%。

以分支間雌雄個(gè)體交叉進(jìn)行群體繁殖，控制每對(duì)親本配組的遺傳距離位于0.4～0.7 之間，建立大規(guī)?；旌霞蚁?。當(dāng)年累計(jì)建立了約500 個(gè)混合家系，獲得F2苗種約100 萬尾，其中約30 萬尾由天津市天祥水產(chǎn)有限責(zé)任公司養(yǎng)殖及選育，作為下一代繁殖用的后備親魚。

2.2 子代混合家系的培育及選育

圖2 F1親本個(gè)體間遺傳距離范圍分布圖Fig.2 Distribution diagram of genetic distance range among F1parental individuals

約30 萬尾超大混合家系F2代魚苗運(yùn)往天津市天祥水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖和培育，當(dāng)年10 月（1-齡魚種）和次年10 月（2-齡成魚）選優(yōu)去劣，由經(jīng)驗(yàn)豐富的養(yǎng)殖技術(shù)人員選擇留取體型優(yōu)良、生長優(yōu)勢明顯、鱗被規(guī)范的個(gè)體，最終獲得F2代的2 齡備選親魚300 尾,雌性200 尾，雄性100 尾，平均體質(zhì)量（1 564.93±335.05）g，平均體長（35.85±3.10）cm，累計(jì)留種比例為1 000∶1。各階段選育的群體體質(zhì)量性狀及留種情況見表2。

2.3 優(yōu)良個(gè)體的系譜分析

對(duì)選出的300 尾后備親本進(jìn)行電子標(biāo)記，采集鰭條樣本，用20 個(gè)與生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記分析基因型，利用“基于遺傳背景的分子育種軟件1.0”將其中的288 尾個(gè)體劃分到20 個(gè)繁殖系譜，每個(gè)繁殖系譜含有9～21 個(gè)個(gè)體，平均體質(zhì)量（1 441.67±99.35）～（1 783.57±150.14）g，平均體長（34.37±0.59）～（37.32±1.08）cm，其中15 個(gè)繁殖系譜的平均體質(zhì)量達(dá)到了預(yù)定規(guī)格（1 500 g）以上，占75%（圖3）。

表2 F2代大規(guī)?；旌霞蚁叼B(yǎng)殖及選育過程Tab.2 The rearing and breeding process of large-scale mixed family of F2generation in mirror carp

圖3 20 個(gè)繁殖系譜體質(zhì)量性狀比較Fig.3 Comparative analysis of body weight among twenty breeding pedigrees

3 討論

電子標(biāo)記輔助的大規(guī)模家系選育技術(shù)已經(jīng)成功用于挪威大西洋鮭Salmo salar 和美國優(yōu)質(zhì)虹鱒Oncorhynchus mykiss 的選育[14]，但是，其構(gòu)建上百個(gè)家系，先分池飼養(yǎng)，然后電子標(biāo)記混合飼養(yǎng)的技術(shù)路線并不適用于我國，尤其不適用于產(chǎn)卵量大、苗種價(jià)格低、投入低的鯉科魚類的苗種生產(chǎn)及培育。本研究結(jié)合了大規(guī)模家系選育的優(yōu)點(diǎn)，利用分子標(biāo)記揭示的親本個(gè)體間的遺傳差異輔助構(gòu)建混合家系，在苗種階段即同池混合飼養(yǎng)，通過多次的表型選擇[6]，保留生長及體型優(yōu)良的個(gè)體，形成后備親魚；再次使用分子標(biāo)記鑒定優(yōu)良個(gè)體的繁殖系譜，下一代繁殖時(shí)，以繁殖系譜間親魚配組，最大限度地避免了近親繁殖又簡化了操作步驟，獲得了最大的選擇強(qiáng)度和選擇效果。

開展魚類家系選育的關(guān)鍵是選擇配組親本，難點(diǎn)是大規(guī)模家系的混合群體中鑒定出優(yōu)良家系或確定繁殖系譜。利用分子標(biāo)記揭示的親本間遺傳差異指導(dǎo)家系配組在作物[15,16]及畜禽[17]中已廣泛應(yīng)用。在水產(chǎn)動(dòng)物中，魯翠云等[2]用微衛(wèi)星標(biāo)記指導(dǎo)鏡鯉家系親本的配組，顯示親本間遺傳距離在0.5～0.7之間的子一代具有較好的生產(chǎn)性能。畢金貞等[3]研究發(fā)現(xiàn)，牙鲆親本間遺傳距離在0.2578～0.5958 范圍內(nèi)，與后代生長速度之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。常玉梅等[5]用遺傳差異指導(dǎo)群體繁殖的大黃魚的生產(chǎn)性能和抗逆性比對(duì)照組有較大提高。孫效文等[6]通過連續(xù)多年的實(shí)驗(yàn)，提出鏡鯉雌雄親本配組親緣關(guān)系的閾值是“遺傳距離小于0.2、大于0.7 的1 對(duì)雌雄個(gè)體不適合繁殖配組，最佳配組雌雄個(gè)體的遺傳距離范圍為0.5～0.7。而利用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定混合養(yǎng)殖家系的系譜關(guān)系也已在中國明對(duì)蝦Fenneropenaeus chinensis[18]、大菱鲆Scophthalmus maximus[19]、馬氏珠母貝Pinctada martensii[20]等水產(chǎn)動(dòng)物育種中應(yīng)用。本研究將微衛(wèi)星標(biāo)記與大規(guī)?；旌霞蚁颠x育技術(shù)相結(jié)合，利用微衛(wèi)星標(biāo)記揭示的親本間遺傳差異指導(dǎo)建立大規(guī)?；旌霞蚁?，將大多數(shù)親本個(gè)體聚為74 個(gè)組，其中43.28%的個(gè)體間遺傳距離處于0.4～0.7 的范圍之內(nèi)，適合用于家系的繁殖配組，組間雌雄交叉繁殖混合家系約500 個(gè)，達(dá)到了大規(guī)模家系選育的程度。經(jīng)過2 整年的表型選擇，獲得了第二代后備親魚，選擇強(qiáng)度達(dá)到了1‰，再次用微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)合配組軟件將后備親魚中的大部分優(yōu)良個(gè)體劃歸20 個(gè)繁殖系譜，為下一代的繁殖配組奠定了基礎(chǔ)。

近年來，我國多數(shù)主要養(yǎng)殖魚類相繼開發(fā)了大量的共顯性標(biāo)記，具備了開展基于遺傳背景的分子育種研究的條件，開展分子育種將是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物育種研究的一種趨勢和方向，多家系混合選育可以消除環(huán)境差異的影響，也將是分子育種的重要技術(shù)程序。但如果從幾百個(gè)家系的混合群體中將所有家系區(qū)分開來將是一個(gè)成本高、工作量巨大的檢測工作，如本研究使用500 個(gè)家系，要區(qū)分這些家系，每個(gè)家系用30 個(gè)個(gè)體就要15 000 個(gè)個(gè)體，用20 個(gè)標(biāo)記鑒定也要獲得30 萬個(gè)基因數(shù)據(jù)，其分析工作量非常巨大，檢測成本也將達(dá)到上百萬元。本研究介紹的標(biāo)記指導(dǎo)的大規(guī)?；旌霞蚁颠x育技術(shù)，借鑒“優(yōu)選法”理念，不以鑒別和區(qū)分所有家系為目標(biāo)，放棄了對(duì)所有實(shí)驗(yàn)家系進(jìn)行系譜分析或親權(quán)鑒定，而是在1 齡和2 齡各利用表型選留一次后備親本，僅深入分析目標(biāo)性狀優(yōu)秀的個(gè)體，例如開展繁殖系譜劃分、親權(quán)關(guān)系鑒定、全基因組重測序等，減少了基因型分析的工作量，既節(jié)省了成本，也達(dá)到了利用分子標(biāo)記輔助建立優(yōu)良后備親魚群體的目標(biāo)，是一個(gè)選擇強(qiáng)度大的實(shí)用分子育種技術(shù)方案。